基于转录组测序开发的红掌SSR引物对及试剂盒.pdf

1、(10)申请公布号 CN 104195245 A (43)申请公布日 2014.12.10 CN 104195245 A (21)申请号 201410423866.3 (22)申请日 2014.08.26 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 浙江省萧山棉麻研究所 地址 311202 浙江省杭州市萧山区北干街道 塘湾 79 号 (72)发明人 葛亚英 田丹青 金亮 沈晓岚 潘晓韵 刘晓静 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 林松海 (54) 发明名称 基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对及试 剂盒

2、(57) 摘要 本发明涉及一种基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对及试剂盒。本发明提供 22 对红掌 SSR 引物的序列及鉴定红掌亲缘关系和遗传特性的试 剂盒。本发明的 22 对引物在 50 个红掌品种中具 有多态性， 对 50 个红掌品种进行的遗传多样性分 析与植物分类常识相吻合， 可以直接把本发明提 供的 22 对引物应用于更多的红掌植物品种上， 进 行种质资源遗传多样性分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 14 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表14页 附图2页 (10

3、)申请公布号 CN 104195245 A CN 104195245 A 1/1 页 2 1. 一种基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对， 其特征在于， 在检测过程中使用一对 或多对引物 ； 所述引物共有 22 对， 分别为 ： 第 1 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 第 2 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 第 3 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 所示 ； 第 4 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID

4、 NO ： 8 所示 ； 第 5 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 9 和 SEQ ID NO ： 10 所示 ； 第 6 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 11 和 SEQ ID NO ： 12 所示 ； 第 7 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 13 和 SEQ ID NO ： 14 所示 ； 第 8 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 15 和 SEQ ID NO ： 16 所示 ； 第 9 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 17 和 SEQ ID NO ： 18 所示 ； 第 10 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 19 和 S

5、EQ ID NO ： 20 所示 ； 第 11 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 21 和 SEQ ID NO ： 22 所示 ； 第 12 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 23 和 SEQ ID NO ： 24 所示 ； 第 13 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 25 和 SEQ ID NO ： 26 所示 ； 第 14 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 27 和 SEQ ID NO ： 28 所示 ； 第 15 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 29 和 SEQ ID NO ： 30 所示 ； 第 16 对引物， 其序列如 SEQ ID

6、 NO ： 31 和 SEQ ID NO ： 32 所示 ； 第 17 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 33 和 SEQ ID NO ： 34 所示 ； 第 18 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 35 和 SEQ ID NO ： 36 所示 ； 第 19 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 37 和 SEQ ID NO ： 38 所示 ； 第 20 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 39 和 SEQ ID NO ： 40 所示 ； 第 21 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 41 和 SEQ ID NO ： 42 所示 ； 第 22 对引物，

7、 其序列如 SEQ ID NO ： 43 和 SEQ ID NO ： 44 所示。 2. 一种鉴定红掌亲缘关系和遗传特性的试剂盒， 其特征在于， 它包括如权利要求 1 所 述的一对或多对引物。 3. 一种如权利要求 1 所述的红掌 SSR 引物对的应用。 权 利 要 求 书 CN 104195245 A 2 1/7 页 3 基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及 SSR 引物， 具体地说是一套基于红掌转录组测序开发的 SSR 引物对及 试剂盒， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 红掌是天南星科花烛属多年生常绿草本植物， 其花型美观、 花期长， 观

8、赏性高， 在 全球热带花卉贸易中仅次于兰花名列第二。 我国自20世纪90年代开始引种红掌， 目前已成 为我国主产花卉之一， 其种质类型也越来越多， 主要是从形态特征方面来区分， 同种异名、 同名异种现象普遍存在， 无法反映真实的亲缘关系和遗传特性， 给品种收集、 保存和利用带 来影响， 给红掌新品种培育和资源利用带来困难。因此应用分子标记技术对红掌种质资源 多样性进行系谱分析是必要的。 0003 随着现代生物学技术的发展， 分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及 辅助育种工作中。AFLP、 ISSR、 RAPD 等标记均是采用无基因组序列信息的标记， 尽管有一定 的实用性， 但随机性强，

9、 稳定性差。与其他分子标记相比， SSR 标记具有共显性好、 重复性好 等优点， 是目前进行遗传多样性分析和图谱构建等的首选标记。 0004 目前， 红掌 SSR 应用很少。NCBI 数据库中红掌核苷酸序列仅 141 条， 甚至花烛属 序列也仅 793 条。2013 年， 台湾大学 Jau-Yueh Wang et al. 利用 GeneBank 公布的花烛属 序列开发了 8 对 SSR 引物， 具有多态性的仅有 4 对， 同时他利用同科 Colocasia esculenta 属的 EST 序列开发了 32 对引物， 仅得到 1 对多态性可用引物， 利用同科 Zantedeschia aet

10、hiopica 属的 EST 序列开发了 60 对引物， 也仅得到 1 对多态性可用引物， 6 对 SSR 引物 中他选择其中多态性大于90的4对引物在28个红掌品种上应用， 相对信息量较少。 而分 子标记的数量影响着种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性， 现有的 红掌 SSR 分子标记数量远远不能满足红掌分子生物学研究的需求。为了提高 EST-SSR 标记 的密度和提高更多红掌品种鉴定的效果， 有必要开发更多的 SSR 引物。 发明内容 0005 本发明针对现有技术的不足， 提供基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对及试剂 盒。本发明利用红掌转录组测序所得的 unigene

11、 以及 MISA 软件寻找 SSR， 开发了 SSR 引物， 合成了 200 对， 经 6 个不同红掌品种筛选， 及 50 个红掌品种验证， 得到 22 个不同于前人的 具有较高多态性的通用型引物。 0006 一种基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对， 在检测过程中使用一对或多对引 物 ； 所述引物共有 22 对， 分别为 ： 0007 第 1 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 0008 第 2 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 0009 第 3 对引物， 其序列如 SEQ ID

12、 NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 所示 ； 0010 第 4 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 所示 ； 说 明 书 CN 104195245 A 3 2/7 页 4 0011 第 5 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 9 和 SEQ ID NO ： 10 所示 ； 0012 第 6 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 11 和 SEQ ID NO ： 12 所示 ； 0013 第 7 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 13 和 SEQ ID NO ： 14 所示 ； 0014 第 8 对引物， 其序列如

13、SEQ ID NO ： 15 和 SEQ ID NO ： 16 所示 ； 0015 第 9 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 17 和 SEQ ID NO ： 18 所示 ； 0016 第 10 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 19 和 SEQ ID NO ： 20 所示 ； 0017 第 11 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 21 和 SEQ ID NO ： 22 所示 ； 0018 第 12 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 23 和 SEQ ID NO ： 24 所示 ； 0019 第 13 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 25 和

14、 SEQ ID NO ： 26 所示 ； 0020 第 14 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 27 和 SEQ ID NO ： 28 所示 ； 0021 第 15 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 29 和 SEQ ID NO ： 30 所示 ； 0022 第 16 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 31 和 SEQ ID NO ： 32 所示 ； 0023 第 17 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 33 和 SEQ ID NO ： 34 所示 ； 0024 第 18 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 35 和 SEQ ID NO ： 36

15、 所示 ； 0025 第 19 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 37 和 SEQ ID NO ： 38 所示 ； 0026 第 20 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 39 和 SEQ ID NO ： 40 所示 ； 0027 第 21 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 41 和 SEQ ID NO ： 42 所示 ； 0028 第 22 对引物， 其序列如 SEQ ID NO ： 43 和 SEQ ID NO ： 44 所示。 0029 一种鉴定红掌亲缘关系和遗传特性的试剂盒， 包括上述的一对或多对引物。 0030 一种所述的红掌 SSR 引物对的应用。 00

16、31 本发明的有益效果是 ： 0032 本发明的 22 对 SSR 引物是通过来源于 3 个种且形态差异大的 6 个品种筛选得到， 在 50 个红掌品种 ( 表 1) 中均具有多态性 ( 部分如图 2)， 在 50 个红掌品种中进行的遗传 多样性分析与红掌分类常识相吻 ( 图 3)， 是稳定存在的新标记， 可以直接将本发明所提供 的 22 个引物对应用于更多红掌品种上， 进行种质资源和遗传多样性分析， 为红掌分子标记 辅助育种奠定了良好的基础。 附图说明 0033 图 1 是基于转录组测序开发红掌 SSR 引物对的流程图。 0034 图 2 是本发明的部分红掌 SSR 引物对在 50 个红掌品

17、种上的扩增效果图。 0035 图 3 是基于 22 对 SSR 引物构建的 50 个红掌品种 UPGMA 聚类图。 具体实施方式 0036 基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对， 是通过红掌转录组测序、 SSR 引物开发、 DNA 提取、 SSR 引物筛选及品种鉴定等过程得到 ( 图 1)。 0037 本发明中， 用转录组测序得到的 EST 序列开发红掌 SSR 引物对的具体做法是 ： 0038 一、 红掌转录组测序 0039 采用 Trizol 法提取红掌 ( 阿拉巴马 ) 叶片总 RNA 后， 用带有 Oligo(dT) 的磁珠富 集真核生物 mRNA。加入 fragmentation

18、 buffer 将 mRNA 打断成短片段， 以 mRNA 为模板， 用 说 明 书 CN 104195245 A 4 3/7 页 5 六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链， 然后加入缓冲液、 dNTPs、 RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链， 在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液 洗脱之后做末端修复、 加 poly(A) 并连接测序接头， 然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小 选择， 最后进行 PCR 扩增， 建好的测序文库用 Illumina HiSeqTM 2000 进行测序， 获得 32391 个 uni

19、gene。 0040 二、 SSR 引物开发 0041 利用红掌转录组测序得到的32391个unigene， 利用MISA软件寻找到3944个含有 SSR 的重复基元， 选择 SSR 位点的重复基元为二核苷酸重复次数 6 次， 三、 四核苷酸重复 次数 5 次， 五、 六核苷酸重复次数 4 次的 SSR 序列， 用软件 Primer3.0 设计 SSR 引物， 引 物设计的原则为 ： 最终产物长度为 100-200bp, 引物长度为 18-24bp, 退火温度为 48-65。 挑选其中的 200 对引物， 委托上海生工生物工程股份有限公司合成。 0042 三、 品种 DNA 提取 0043 用

20、 CTAB( 十六烷基三乙基溴化铵 ) 法提取 50 个红掌品种 ( 表 1) 基因组 DNA， 具体 步骤 ： 0044 表 1 本发明实现方案中所用到的不同红掌品种 0045 说 明 书 CN 104195245 A 5 4/7 页 6 0046 (1)配制DNA提取缓冲液 ： 2CTAB， 1M Tris， 0.5M EDTA(pH8.0)， 5M NaCl和10mg/ ml 的 RNAase 酶。 0047 (2) 对上述红掌材料分别进行如下处理 ： 0048 A、 在 65水浴锅中预热 CTAB 提取液 ； 用天平迅速称取约 0.3g 嫩叶， 在液氮中迅 速研磨样品， 将粉末状材料转

21、入 2ml 离心管中， 加入预热的 CTAB 提取液 900ul， 65保温 3060min， 每隔10min轻轻颠倒混匀 ； 加入等体积900ul的氯仿 ： 异戊醇(24:1)， 混匀， 4 说 明 书 CN 104195245 A 6 5/7 页 7 下 12000rpm 离心 10min， 取上清转入新离心管， 并再次加入 900ul 氯仿 / 异戊醇 (24:1)， 混 匀， 12000rpm 离心 10min。 0049 B、 在上述步骤 A 离心后所得的上清液中加入 0.5ml 5M NaCl 和 0.75ml 冷异丙醇， 轻轻混匀至 DNA 沉淀 ( 置 4冰箱静置 30min

22、以上 ) ； 后 15下 8000rpm 离心 8min， 弃上 清。 0050 C、 将步骤 B 所得 DNA 沉淀物用 1ml 左右的 75的乙醇漂洗， 室温条件下 12500rpm 离心 2min， 弃上清， 重复洗一次 ； 再用无水乙醇清洗一次。 0051 D、 将上述步骤 C 洗涤后的 DNA 室温风干并溶于 100 200ul 的超纯水中， 加入 1.2ul 左右的 RNAase 酶 (10mg/ml)， 37水浴 30 分钟或室温下静置 1 小时以去除 RNA。 0052 E、 紫外分光光度法检测上述步骤D所得的DNA样品的浓度， 0.8的琼脂糖凝胶电 泳检测 DNA 的完整性。

23、 0053 四、 SSR 引物筛选 0054 以步骤三提取的待测样品中， 选择来源于三个种且形态差异大的 6 个红掌品种 (An1、 An2、 An3、 An4、 An6、 An15) 基因组 DNA 为模板进行步骤二所得 200 对引物的筛选， PCR 采用 20ul 反应体系 ： 10PCR buffer2l,25mM MgCl21.2ul,10mM dNTP 0.4l,10U/ul Taq DNA polymerase 0.1l,10uM正向引物1l， 10uM反向引物1l， 20ng/l DNA模板 1l， 加ddH2O至20l。 使用PCR S1000TMThermal Cycler

24、进行DNA扩增， PCR扩增条件如 下 ： 94预变性 4min,94 (45s)/TM(45s)/72 (60s)36 个循环， 最后 72延伸 8min。产 物检测 ： PCR 产物在 6的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后， 染色显色后在看胶灯下观察并照 相记录结果， 6 个品种均能扩增出多态性清晰条带的 22 对引物对用于下一步的品种鉴定。 0055 五、 品种鉴定 0056 根据步骤四分析结果， 电泳检测 6 个品种有多态性清晰条带的 22 对引物在 50 个 不同红掌品种 ( 表 1) 上进行上述步骤四中相同条件的 PCR 扩增， 扩增产物以步骤四相同方 法电泳检测， 发现这 22 对引物

25、在 50 个不同红掌品种上均有扩增产物， 且多态性高 ( 部分引 物对扩增结果如图 2 所示 )， 聚类分析结果 ( 图 3) 表明这 22 对引物能将 50 个不同红掌品 种分为三大类， 这种分类与经典的形态学分类相符合， 说明这 22 对引物 ( 即本发明所述引 物对， 其特征如表 2 所示 ) 可以用于红掌种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。 0057 本发明提供 22 对红掌 SSR 引物， 22 对 SSR 引物的特征如表 2 所示 ： 0058 表 2 红掌 SSR 引物对特征 0059 说 明 书 CN 104195245 A 7 6/7 页 8 0060 表 2 续 006

26、1 说 明 书 CN 104195245 A 8 7/7 页 9 0062 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104195245 A 9 1/14 页 10 SEQUENCE LISTING 浙江省萧山棉麻研究所 基于转录组测序开发的红掌 SSR 引物对及试剂盒 44 PatentIn version 3.5 1 23 DNA Artifi cial Sequence H036-F 1 ca

27、gtaccagt agaagggatg acg 23 2 22 DNA Artifi cial Sequence H036-R 2 acaagctcaa gaaggagctg ag 22 3 23 DNA 序 列 表 CN 104195245 A 10 2/14 页 11 Artifi cial Sequence H039-F 3 cagtagaagg gatgacgcat tag 23 4 22 DNA Artifi cial Sequence H039-R 4 cttctcccac aagctcaaga ag 22 5 23 DNA Artifi cial Sequence H040-F

28、5 ctgtatcgac caaaagaacc agt 23 6 22 DNA Artifi cial Sequence 序 列 表 CN 104195245 A 11 3/14 页 12 H040-R 6 acaagctcaa gaaggagctg ag 22 7 22 DNA Artifi cial Sequence H059-F 7 ccgtgtagtt cttgtagccc tc 22 8 23 DNA Artifi cial Sequence H059-R 8 cacacggaga agacaacttc tgt 23 9 23 DNA Artifi cial Sequence H06

29、0-F 9 序 列 表 CN 104195245 A 12 4/14 页 13 accgtgtagt tcttgtagcc ctc 23 10 22 DNA Artifi cial Sequence H060-R 10 acaacttctg ttctcctcct gc 22 11 22 DNA Artifi cial Sequence H068-F 11 aaatcctttc gtgacagcag at 22 12 22 DNA Artifi cial Sequence H068-R 12 aaagggattt gattgcatca tt 22 序 列 表 CN 104195245 A 13

30、5/14 页 14 13 23 DNA Artifi cial Sequence H103-F 13 ctcaaaagaa agatgatggc aac 23 14 23 DNA Artifi cial Sequence H103-R 14 tgacactatc tgcttcatct ccc 23 15 21 DNA Artifi cial Sequence H110-F 15 cttccacctc cttcctttga c 21 16 21 DNA 序 列 表 CN 104195245 A 14 6/14 页 15 Artifi cial Sequence H110-R 16 acgctga

31、tgc aagaaacaac t 21 17 23 DNA Artifi cial Sequence H120-F 17 aaaatccaca aaggtagaga ggc 23 18 23 DNA Artifi cial Sequence H120-R 18 tcactttcct gtgtttcaca atg 23 19 23 DNA Artifi cial Sequence 序 列 表 CN 104195245 A 15 7/14 页 16 H128-F 19 agtaacataa tccggcacac aag 23 20 23 DNA Artifi cial Sequence H128-

32、R 20 cgccagcaac taaattaaac aac 23 21 23 DNA Artifi cial Sequence H129-F 21 ataggtagca ccaagaaagg gag 23 22 23 DNA Artifi cial Sequence H129-R 22 序 列 表 CN 104195245 A 16 8/14 页 17 aagaagggtt tcctgggtaa gat 23 23 23 DNA Artifi cial Sequence H130-F 23 aatcgtgtat ctggcctcaa aat 23 24 21 DNA Artifi cial

33、Sequence H130-R 24 gtacagagga acccgtcaca g 21 25 18 DNA Artifi cial Sequence H134-F 25 gaaggagccg acgagttg 18 序 列 表 CN 104195245 A 17 9/14 页 18 26 23 DNA Artifi cial Sequence H134-R 26 gcaccagaaa gagaggagta aga 23 27 23 DNA Artifi cial Sequence H138-F 27 cgtgttagtg ctccatttat cgt 23 28 22 DNA Artifi

34、 cial Sequence H138-R 28 ggatctcaaa gaggcactca tc 22 29 23 DNA 序 列 表 CN 104195245 A 18 10/14 页 19 Artifi cial Sequence H146-F 29 aaaaattcat ccagagggaa aag 23 30 23 DNA Artifi cial Sequence H146-R 30 gaacacatcc acactgaaca aaa 23 31 23 DNA Artifi cial Sequence H149-F 31 agtgacgaga gaggaaggaa gac 23 32

35、 20 DNA Artifi cial Sequence 序 列 表 CN 104195245 A 19 11/14 页 20 H149-R 32 gagcagacgc aggtcatttc 20 33 23 DNA Artifi cial Sequence H155-F 33 atcttcagct taagcaaccc tgt 23 34 23 DNA Artifi cial Sequence H155-R 34 taggtggaat catgttttcg ttc 23 35 24 DNA Artifi cial Sequence H156-F 35 序 列 表 CN 104195245 A

36、 20 12/14 页 21 cggtttagca gatctagaag aagg 24 36 23 DNA Artifi cial Sequence H156-R 36 aataacacag atcattggga tcg 23 37 24 DNA Artifi cial Sequence H166-F 37 ataatcaacc acctgaggtt caag 24 38 23 DNA Artifi cial Sequence H166-R 38 ctgaaaccca acgatctcat aac 23 序 列 表 CN 104195245 A 21 13/14 页 22 39 21 DNA

37、 Artifi cial Sequence H170-F 39 cgtcctcttg ctagatgcag a 21 40 18 DNA Artifi cial Sequence H170-R 40 ccaagtcccc ctccaact 18 41 22 DNA Artifi cial Sequence H172-F 41 acgttctcgc ttctatcgct ac 22 42 23 DNA 序 列 表 CN 104195245 A 22 14/14 页 23 Artifi cial Sequence H172-R 42 cttcctcacc atcactactc ctc 23 43 23 DNA Artifi cial Sequence H175-F 43 attataatgt cccctcctgt tgc 23 44 23 DNA Artifi cial Sequence H175-R 44 ggttatgcaa gcctgaacaa tac 23 序 列 表 CN 104195245 A 23 1/2 页 24 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104195245 A 24 2/2 页 25 图 3 说 明 书 附 图 CN 104195245 A 25