D-丝氨酸制备方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102226207 A (43)申请公布日 2011.10.26 CN 102226207 A *CN102226207A* (21)申请号 201110115028.6 (22)申请日 2005.10.07 298344/2004 2004.10.13 JP 200580034899.8 2005.10.07 C12P 13/06(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/025(2006.01) C12R 1/64(2006.01) (71)申请人 三井化学株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 安乐城正 秀崎友则 渡边清一 西田圭

2、太 长原清辉 小糸光男 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 杨宏军 (54) 发明名称 D- 丝氨酸制备方法 (57) 摘要 本发明涉及 D- 丝氨酸的制备方法， 所述制备 方法在具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活 性的微生物或其处理物的存在下， 使甘氨酸和甲 醛反应合成 D- 丝氨酸。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 17 页 序列表 23 页 附图 1 页 CN 102226214 A1/2 页 2 1. 一种 D- 丝氨酸的制备方法

3、， 所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的 活性的微生物或其处理物的存在下， 使甘氨酸和甲醛反应合成 D- 丝氨酸， 所述处理物选自 对所述微生物进行机械破坏、 超声波处理、 冻结融解处理、 干燥处理、 加压或减压处理、 渗透 压处理、 自身消化、 表面活性剂处理、 酶处理而得到的物质、 及通过上述处理所得到的含有 具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的酶的部分的固定化物以及所述微生物的固定 化物， 其中， 采用下述 (1) (4) 中一种以上的方法将所述反应的反应液中副生的 L- 丝氨酸 抑制在相对于 D- 丝氨酸为 1.5 摩尔以下， (1)对具有由甘氨酸和甲醛合成D-

4、丝氨酸的活性的微生物进行有机溶剂处理及/或加 热处理的方法 ； (2) 将反应液中的甲醛浓度， 在 a) 通过所述 (1) 的方法进行有机溶剂处理及 / 或加热 处理时， 控制在 2M 以下 ； 在 b) 未进行有机溶剂处理及 / 或加热处理时， 控制在 150mM 以上 2M 以下的方法 ； (3)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶、 且L-丝氨酸合成酶基因 缺失的微生物作为催化剂的方法 ； (4) 向反应液中添加含有具有 L- 丝氨酸脱氨酶活性的酶的微生物的方法。 2. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其中， 所述有机溶剂为选自甲醛、 苯甲醛、 二氯乙烷 及异丙醇中的一种

5、以上有机溶剂。 3.如权利要求1或2所述的制备方法， 其中， 所述有机溶剂处理及/或加热处理在2价 金属离子存在下进行。 4.如权利要求3所述的制备方法， 其中， 2价金属为选自镁、 锰、 锌、 镍、 钴及铁中的一种 以上金属。 5. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其中， 具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的 微生物， 具有在反应液中在 410mM 的高甲醛浓度下由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性。 6. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其中， 具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的 微生物， 是使用将下述 DNA 整合到载体中形成的重组 DNA 将宿主细胞进行转化而得

6、到的转 化体， 所述 DNA 编码具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的酶活性的酶， 所述酶由具有序列 号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸序列和来自水稻黄单胞菌的 D- 苏氨酸醛缩酶的氨基 酸序列的共有序列的氨基酸序列构成。 7. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其中， 具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的 微生物， 是使用将下述DNA整合到载体中形成的转化体DNA将宿主细胞转化得到的转化体， 所述 DNA 为编码 (a)、 (b) 或 (c) 蛋白质的 DNA、 或者为 (d) 或 (e) 的 DNA， (a) 蛋白质， 由序列号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸

7、序列构成， (b) 来自水稻黄单胞菌的 D- 苏氨酸醛缩酶， (c) 蛋白质， 所述蛋白质由在 (a) 氨基酸序列或 (b) 来自水稻黄单胞菌的 D- 苏氨酸醛 缩酶中缺失、 取代、 插入或添加 1 5 个氨基酸得到的氨基酸序列构成， 并且具有由甘氨酸 和甲醛合成 D- 丝氨酸的酶活性， (d)DNA， 由序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列构成， (e)DNA， 编码来自水稻黄单胞菌的 D- 苏氨酸醛缩酶。 权 利 要 求 书 CN 102226207 A CN 102226214 A2/2 页 3 8. 如权利要求 6 或 7 所述的制备方法， 其中， 对所述来自

8、水稻黄单胞菌的 D- 苏氨酸醛 缩酶进行编码的 DNA 序列为 GenBank 登录号 E05055 的 DNA 序列。 权 利 要 求 书 CN 102226207 A CN 102226214 A1/17 页 4 D- 丝氨酸制备方法 0001 本申请是申请日为 2005 年 10 月 07 日、 申请号为 200580034899.8( 国际申请号为 PCT/JP2005/018906)、 发明名称为 “编码新型的具有 D- 丝氨酸合成活性的酶的 DNA、 该酶的 制备方法、 及利用该酶的 D- 丝氨酸制备方法” 的申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及编码具有由甲醛和甘氨酸合

9、成 D- 丝氨酸的活性的新型酶的 DNA、 将该 DNA 整合到载体中形成的重组 DNA、 由该重组 DNA 转化得到的转化体、 具有由甲醛和甘氨酸 合成 D- 丝氨酸的活性的新型酶及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备 D- 丝氨酸的方法。 背景技术 0003 已知 D- 丝氨酸作为 D- 环丝氨酸等医药品的合成中间体是十分有用的化合物。 0004 目前， 作为具有由甲醛和甘氨酸合成 D- 丝氨酸的活性的酶， 只公开了来自节杆菌 (Arthrobacter)sp.DK-19 的 D- 苏氨酸醛缩酶 ( 以下， 简称 “DTA” )( 参见特开昭 58-116690 号公报 )。 0005 已有报道指出

10、， 使用甲醛及甘氨酸各 50mmol， 在 30下利用所述 DTA 使其进行反 应， 40 小时后 D- 丝氨酸的生成量为 2.5mmol( 相对于甲醛的收率仅为 5 )。 0006 针对于此， 已有报道指出， 来自同为节杆菌属微生物的节杆菌 sp.DK-38 的 DTA， 尽 管具有对 D- 苏氨酸、 D- 羟基苯基丝氨酸、 D- 羟基 - 氨基戊酸等响应的广泛的底 物特异性， 但不对 D- 丝氨酸响应 ( 参见 Eur.J.Biochem.， 1997， 248， p385-393)。 0007 另外， 有报道指出， 通过使用来自黄单胞菌属 (Xanthomonas) 的 DTA， 能够由

11、甘氨 酸和醛类化合物制备 D- 羟基氨基酸类， 但尚无使用来自黄单胞菌属的 DTA 由甲醛和甘 氨酸合成 D- 丝氨酸的报道 ( 参见特开平 5-168484 号公报 )。 发明内容 0008 鉴于上述背景技术， 本发明的目的在于， 提供编码具有由甲醛和甘氨酸合成 D- 丝 氨酸的活性的新型酶的 DNA、 将该 DNA 整合到载体中形成的重组 DNA、 由该重组 DNA 转化得 到的转化体、 具有由甲醛和甘氨酸合成 D- 丝氨酸的活性的新型酶、 及利用该酶由甲醛和甘 氨酸制备 D- 丝氨酸的方法。 0009 本发明人等认为在具有与公知的 DTA 类似的结构的未知酶中， 可能存在具有由 甲醛和甘

12、氨酸合成 D- 丝氨酸的能力的酶， 因此对与公知的 DTA 的氨基酸序列相关的信 息进行了研究。其结果发现了与来自黄单胞菌属 (GenBank 登录号 E05055)、 无色杆菌 (Achromobacter) 属 (GenBank 登录号 AB026892)、 及节杆菌属 (GenBank 登录号 AB010956) 的 DTA 的氨基酸序列相关的信息。比较上述氨基酸序列进行研究， 结果发现， DTA 的 N 末端 区域及 C 末端区域的氨基酸序列具有高度的同源性。 0010 本发明人等以上述氨基酸序列中的 N 末端区域及 C 末端区域为基础设计引物， 尝 试使用此引物通过 PCR 扩增各种

13、微生物的染色体 DNA 时， 成功地扩增了来自无色杆菌属微 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A2/17 页 5 生物、 编码具有由甲醛和甘氨酸合成 D- 丝氨酸的活性的酶的 DNA。 0011 与该DNA相当的氨基酸序列和公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列的同源 性约为 50左右， 是与公知的来自无色杆菌属的 DTA 的氨基酸序列有很大差异的序列。另 一方面， 与公知的来自黄单胞菌属的 DTA 的氨基酸序列的同源性约为 90。 0012 之后本发明人等尝试使用由将上述新型DNA整合到载体中形成的重组DNA转化得 到的重组大肠杆菌 (Escherichi

14、a coli) 使甲醛和甘氨酸反应合成 D- 丝氨酸时， 令人惊奇 地发现， 与现有公知的DTA不同， 能够利用100mM甘氨酸和甲醛以反应收率在70以上的高 收率合成 D- 丝氨酸。 0013 此外， 还确认了如果使用此重组大肠杆菌进行 D- 丝氨酸累积反应， 会生成微量的 L- 丝氨酸。 0014 D- 丝氨酸用于医药中间体等要求高纯度的领域时， 不希望在 D- 丝氨酸中混入 L- 丝氨酸。由于 DL- 丝氨酸的溶解度比 D- 丝氨酸的溶解度低， 因此在制备 D- 丝氨酸时副 生的 L- 丝氨酸会大幅度地降低 D- 丝氨酸的精制收率。 0015 为了解决此问题， 本发明人等进行了更加深入的

15、研究， 结果发现， 通过在 2 价金属 离子存在的条件下实施有机溶剂处理及 / 或加热处理能够抑制 L- 丝氨酸的副生。另外， 发 现即使不进行上述处理， 通过将反应中的甲醛浓度维持在 150mM 以上， 也能够抑制 L- 丝氨 酸的副生。并且发现， 通过使用 L- 丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为生产用于 D- 丝氨 酸合成的 DSA 的宿主， 也能够抑制 L- 丝氨酸的副生。 0016 基于上述发现完成了本发明。即， 本发明内容如下 ： 0017 (1) 一种编码下述 (a) 或 (b) 的蛋白质的 DNA， 0018 (a) 蛋白质， 含有序列号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸

16、序列， 0019 (b)蛋白质， 所述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、 取代、 插入或添加1个或多 个氨基酸得到的氨基酸序列， 并且具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的酶活性。 0020 (2) 下述 (a) 或 (b) 的 DNA， 0021 (a)DNA， 由序列表中序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列构 成， 0022 (b)DNA， 所述 DNA 与含有下述 DNA 序列的 DNA 片段在严格的条件下杂交， 所述 DNA 序列为在序列表中序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少 20 个连续碱基的序列， 并且所述 DNA 编

17、码具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的酶。 0023 (3) 一种将上述 (1) 或 (2) 所述的 DNA 整合到载体中形成的重组 DNA。 0024 (4) 一种使用上述 (3) 所述的重组 DNA 转化宿主细胞得到的转化体。 0025 (5) 如上述 (4) 所述的转化体， 其中， 被转化的宿主细胞为微生物。 0026 (6)如上述(5)所述的转化体， 其中， 被转化的微生物为D-丝氨酸脱氨酶缺失的微 生物。 0027 (7) 下述 (a) 或 (b) 的蛋白质， 0028 (a) 蛋白质， 含有序列号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸序列， 0029 (b)蛋白质， 所

18、述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、 取代、 插入或添加1个或多 个氨基酸得到的氨基酸序列， 并且具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的酶活性。 0030 (8) 一种制备具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的酶的方法， 其特征在 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A3/17 页 6 于， 培养上述(4)(6)中任一项所述的转化体， 从所得的培养物中获取具有由甘氨酸和甲 醛合成 D- 丝氨酸的酶活性的蛋白质。 0031 (9)一种D-丝氨酸的制备方法， 其中， 包含在上述(4)(6)中任一项所述的转化 体或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应。 0032

19、 (10) 一种 D- 丝氨酸的制备方法， 其中， 包含在上述 (7) 所述的蛋白质的存在下使 甘氨酸和甲醛反应。 0033 (11) 一种 D- 丝氨酸的制备方法， 所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝 氨酸的活性的微生物或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应合成 D- 丝氨酸， 其中， 采用 下述 (i) (iv) 中一种以上的方法， 将在所述反应的反应液中副生的 L- 丝氨酸抑制在相 对于 D- 丝氨酸为 1.5 摩尔以下， 0034 (i)对具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物进行有机溶剂处理及/ 或加热处理的方法 ； 0035 (ii)将反应液中的甲醛浓度， 在a)

20、通过所述(i)的方法进行有机溶剂处理及/或 加热处理时， 控制在 2M 以下 ； 在 b) 未进行有机溶剂处理及 / 或加热处理时， 控制在 150mM 以上 2M 以下的方法 ； 0036 (iii)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶、 且L-丝氨酸合成 酶基因缺失的微生物作为催化剂的方法 ； 0037 (iv) 向反应液中添加含有具有 L- 丝氨酸脱氨酶活性的酶的微生物的方法。 0038 (12) 如上述 (11) 所述的制备方法， 其中， 所述有机溶剂为选自甲醛、 苯甲醛、 二氯 乙烷及异丙醇中的一种以上的有机溶剂。 0039 (13)如上述(11)或(12)所述的制备方

21、法， 其中， 所述有机溶剂处理及/或加热处 理在 2 价金属离子存在下进行。 0040 (14) 如上述 (13) 所述的制备方法， 其中， 2 价金属为选自镁、 锰、 锌、 镍、 钴及铁中 的一种以上的金属。 0041 (15)如上述(11)所述的制备方法， 其中， 具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活 性的微生物为上述 (5) 或 (6) 所述的转化体。 0042 1、 编码具有由甲醛和甘氨酸合成 D- 丝氨酸的活性的新型酶的 DNA 的基因的获取 0043 含有序列表的序列号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸序列、 并且编码具有由 甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸的活性的酶 ( 以

22、下， 将具有由甘氨酸和甲醛合成 D- 丝氨酸 的活性的酶简称 “DSA” ) 的 DNA 可以通过下述方法获得， 即， 从细菌中萃取染色体 DNA， 使用具有序列表的序列号 1 及 2 所示的碱基序列的引物， 通过进行 PCR 而获得， 所述细 菌为例如 ： 可从 12301 Parklawn Drive， Rockville， Maryland 20852， U.S.A. 的美国 典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection) 取得的木糖氧化无色杆 菌 (Achromobacter xylosoxidans)(ATCC9220)、 可从独立行政法人产

23、品评价技术基础机 构 (National Institute of Technology and Evaluation) 的生物遗传资源部门 (NITE Biological Resource Center)( 日本千叶县木更津市上縂镰足 2-5-8) 取得的木糖氧化 无色杆菌 (NBRC13495) 和反硝化无色杆菌 (Achromobacter denitrificans)( 等同于 ： 木糖氧化产碱杆菌反硝化亚种 (Achromobacter xylosoxidans subsp.denitrificans) (NBRC15125)。 说 明 书 CN 102226207 A CN 10

24、2226214 A4/17 页 7 0044 进行 PCR 时， 改良扩增时的条件使若干具有错配碱基的基因也扩增是有效的。 可以通过下述方法使难于扩增的基因扩增， 例如， 将退火温度抑制至低温的方法、 向 PCR 反应液中加入 5左右的二甲基亚砜的方法、 或使用 PCR 试剂盒 ( 例如 GC-RICH PCR System(Roche 社制 ) 使富含 GC 的基因易于扩增的方法， 还有将上述方法组合使用的方法 等。 0045 作为编码 DSA 的 DNA 的具体例， 来自木糖氧化无色杆菌 (ATCC9220) 的 DTA 基因的 DNA 碱基序列示于序列号 3， 由该碱基序列翻译得到的氨基

25、酸序列示于序列号 4。来自木糖 氧化无色杆菌(NBRC13495)的DTA基因的DNA碱基序列示于序列号5， 通过该碱基序列翻译 得到的氨基酸序列示于序列号 6。来自反硝化无色杆菌 (NBRC15125) 的 DTA 基因的 DNA 碱 基序列示于序列号 7， 通过该碱基序列翻译得到的氨基酸序列示于序列号 8。 0046 作为编码 DSA 的 DNA， 除上述之外， 只要是与 DNA 片段在严格条件下杂交的、 并且 可编码具有 DSA 活性的蛋白质的 DNA 即可， 可以来自任何生物， 其中所述 DNA 片段含有序列 表中序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少

26、20 个连续碱基的 DNA 序列。例如， 即使是在该生物中没有功能的沉默 DNA， 只要其能够通过将分离的 DNA 连 接到适当的表达载体上产生 DSA 则也可以使用。 0047 并且， 对生物也无特殊限定， 通过将土壤等直接作为模板 DNA 用于 PCR， 也能得到 编码 DSA 的 DNA， 其中 PCR 使用具有序列表中序列号 1 及 2 的碱基序列的引物。 0048 作为编码 DSA 的 DNA 的具体获取方法， 例如可以举出， 将在含有 D- 丝氨酸的培养 基中生长的微生物染色体 DNA 作为模板， 使用具有序列表中序列号 1 及 2 记载的碱基序列 的引物进行 PCR， 扩增得到

27、DNA。 0049 另外， 可以通过在序列表的序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或互补 序列可于严格的条件下进行杂交的范围内、 并且不影响被编码的酶的活性的范围内， 使 用位点特异性诱变法 (Nucleic Acid Res.， 10， pp.6487(1982) ； Nucleic Acid Res.， 13， pp.4431(1985) ； Methods in Enzymol.， 100， pp.448(1983) ； Molecular Cloning 2ndEdt.， Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ； PCR A

28、Practical Approach IRL Press pp.200(1991) ； Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley& ； Sons(1987-1997) ； Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 79， pp.6409(1982) ； Gene， 34， 315(1985) ； Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 82， pp.488(1985) 等， 适当地导入缺失、 取代、 插入、 及 / 或添 加变异， 得到含有在序列号 4、 6、 8 中任一序列号记载的氨基酸序列中缺失、 取代、 插

29、入或添 加 1 个或数个氨基酸的氨基酸序列、 并且可以编码具有 DSA 活性的蛋白质的 DNA。 0050 本说明书中的氨基酸的缺失、 取代、 插入或添加可以通过上述作为本申请提交前 的公知技术的位点特异性诱变法进行， 另外， 1 个或多个氨基酸是指能够通过位点特异性诱 变法缺失、 取代、 插入或添加的氨基酸的数量， 例如 1 5 个氨基酸， 优选 1 3 个氨基酸。 0051 所谓用于杂交的条件， 可以举出本领域技术人员为了检出特定的杂交信号而经常 使用的条件。优选指严格的杂交条件和严格的洗涤条件。具体而言， 例如可以举出， 在含有 6SSC(1SSC 的组成 ： 0.15MNaCl、 0.

30、015M 柠檬酸钠、 pH7.0)、 0.5 SDS、 5Denhardt 及 100mg/ml 鲱鱼精子 DNA 的溶液中， 与探针一同在 55下保温一晚的条件等。接下来可以列 举在 0.2SSC 中、 42下洗涤过滤器等。作为严格的条件， 可以举出过滤器的洗涤工序在 0.1SSC、 50下进行的条件， 作为更加严格的条件可以举出该工序在 0.1SSC、 65下进 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A5/17 页 8 行的条件。 0052 本说明书中使用的 “含有在序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互补 序列中的至少 20 个连续碱基的

31、DNA 序列的 DNA 片段” ， 是指选择下述序列中的一个或多个 得到的 DNA 片段， 该序列是在序列表中序列号 3、 5、 7 中任一序列号记载的碱基序列或其互 补序列中的任意的连续至少 20 个碱基， 优选至少 30 个碱基、 例如 40、 60 或 100 个碱基的序 列。 0053 2、 具有该蛋白质基因的重组 DNA 的制备 0054 通过将编码上述 DSA 的 DNA 整合到载体中可以得到重组 DNA。 0055 作为克隆时的载体， 可以使用由能够在宿主微生物内自主增殖的噬菌体或质 粒构建的用于基因重组的载体。作为噬菌体， 例如在大肠杆菌作为宿主微生物时， 可以 举出 gt10

32、、 gt11 等。另外， 作为质粒， 例如在大肠杆菌作为宿主微生物时， 可以举 出 pBTrp2、 pBTac1、 pBTac2( 都 为 Boehringer Mannheim 社 制 )、 pKK233-2(Pharmacia 社制 )、 pSE280(Invitrogen 社制 )、 pGEME X-1(Promega 社制 )、 pQE-8(QIAGEN 社制 )、 pQE-30(QIAGEN 社制 )、 pBluescript IISK+、 pBluescript II SK(-)(Stratagene 社制 )、 pET-3(Novagen 社制 )、 pUC 18( 宝酒造社制

33、)、 pSTV28( 宝酒造社制 )、 pSTV29( 宝酒造社 制 )、 pUC118( 宝酒造社制 ) 等。 0056 作为启动子， 只要是能够在宿主细胞中表达的启动子即可。例如可以举出 trp 启 动子 (Ptrp)、 lac 启动子 (Plac)、 PL启动子、 PH启动子、 PSE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等 的启动子。另外， 也可以使用 tac 启动子、 lacT7 启动子之类人工设计改变的启动子等。并 且， 为了使其在杆菌属细菌中表达， 还可以使用 Np 启动子 ( 特公平 8-24586 号公报 ) 等。 0057 作为核糖体结合序列， 只要是能够在宿主细胞中表达的序列即可，

34、 可以为任意序 列， 但优选使用将 SD(Shine-Dalgarno) 序列和起始密码子的间隔调整为适当距离 ( 例如 6 18 个碱基 ) 的质粒。 0058 为了高效地进行转录 翻译， 也可以使下述蛋白质表达， 该蛋白质使具有该蛋白质 活性的蛋白质 N 末端或其部分缺失的蛋白质与表达载体编码的蛋白质 N 末端部分融合。 0059 在目标蛋白质的表达中， 转录终止序列并非必须， 但优选在紧靠结构基因的下游 配置转录终止序列。 0060 在克隆时， 通过用于剪切编码上述DSA的DNA的限制酶剪切上述载体， 可以得到载 体片段， 但不必一定使用与用于剪切该 DNA 的限制酶相同的限制酶。使该

35、DNA 片段与载体 DNA 片段结合的方法可以是使用公知的 DNA 连接酶的方法， 例如， 该 DNA 片段的黏性末端与 载体片段的黏性末端退火后， 通过使用适当的 DNA 连接酶， 制备该 DNA 片段和载体 DNA 片段 的重组载体。根据需要， 也可以在退火后导入微生物等宿主中， 利用生物体内的 DNA 连接酶 制备重组载体。 0061 3、 通过将编码 DSA 的 DNA 整合到载体中而得到的重组 DNA 制备转化体 0062 通过将上述重组 DNA 导入宿主细胞中， 可得到被上述重组 DNA 转化的转化体。 0063 作为宿主细胞， 只要是重组载体稳定、 能够自主增殖并且可使外源基因表

36、型表达 的细胞即可， 没有特殊的限制。 作为宿主细胞， 可以举出微生物、 例如细菌， 作为上述细菌可 以举出大肠杆菌 DH5， XL-1Blue 等大肠杆菌。另外， 也可以使用其它的酵母等微生物或昆 虫细胞作为宿主细胞。 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A6/17 页 9 0064 作为将重组 DNA 导入微生物的方法， 例如在微生物为大肠杆菌时， 可以使用由钙 处理的感受态细胞法或电穿孔法等。 0065 作为宿主细胞， 为了抑制生成物D-丝氨酸的分解， 可以使用D-丝氨酸脱氨酶活性 低的微生物或 D- 丝氨酸脱氨酶活性缺失的微生物。作为 D- 丝氨酸脱氨酶

37、活性缺失的微生 物的具体例， 例如可以举出实施例6中所述的重组了D-丝氨酸脱氨酶基因所得的大肠杆菌 等。 0066 另外， 为了抑制在 D- 丝氨酸合成反应中 L- 丝氨酸生成， 也可以通过使用 L- 丝氨 酸脱氨酶活性高的微生物分解生成的 L- 丝氨酸。作为 L- 丝氨酸脱氨酶活性高的微生物， 也可以使用实施例 15 中所述的重组了 L- 丝氨酸脱氨酶基因所得的大肠杆菌等。 0067 作为微生物， 由于使用丙氨酸消旋酶、 丝氨酸羟甲基转移酶、 L- 苏氨酸醛缩酶等与 L- 丝氨酸合成相关的酶的活性低的微生物或缺失上述酶活性的微生物时， 不生成 L- 丝氨 酸， 因此优选。 0068 更优选使

38、用完全缺失上述酶的微生物作为宿主细胞。 0069 4、 DSA 的生成 0070 培养上述转化体， 之后通过收集所得的 DSA， 能够制备 DSA。 0071 转化体的培养可以根据在宿主细胞培养中通常使用的方法进行。 转化体为大肠杆 菌等原核微生物、 酵母菌等真核微生物时， 培养上述微生物的培养基， 只要是含有该微生物 能够同化的碳源、 氮源、 无机盐类等、 可以高效地培养转化体的培养基即可， 可以为天然培 养基、 合成培养基中的任一种。 0072 作为碳源， 只要是转化体能够同化的物质即可， 可以使用葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 含有 上述物质的糖蜜、 淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、 乙酸、 丙

39、酸等有机酸、 乙醇、 丙醇等醇 类。 0073 作为氮源， 可以举出氨、 氯化铵、 硫酸铵、 醋酸铵、 磷酸铵等各种无机酸或有机酸的 铵盐、 其它含氮化合物、 及蛋白胨、 肉萃取物、 酵母提取物、 谷物浸提液、 酪蛋白水解物， 大豆 饼、 大豆饼水解物、 各种发酵菌及其消化物等。 0074 作为无机盐， 可以使用磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 磷酸镁、 硫酸镁、 氯化钠、 硫酸亚 铁、 硫酸锰、 硫酸铜、 碳酸钙等。 0075 在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧的条件下进行培养。培养温度可以为 15 50， 培养时间通常为 16 小时 5 天。培养中 pH 保持在 3.0 9.0。使用无机酸或 有

40、机酸、 碱溶液、 尿素、 碳酸钙、 氨等对 pH 进行调整。另外， 培养中也可以根据需要向培养基 中加入氨苄青霉素或四环素等抗生素。 0076 培养由使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行转化得到的微生物时， 可以 根据需要向培养基中加入诱导物。例如， 在培养由使用 lac 启动子的表达载体进行转化所 得的微生物时， 可以向培养基中加入异丙基 -D- 硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG) 等， 在培 养由使用 trp 启动子的表达载体进行转化所得的微生物时， 可以向培养基中加入吲哚乙酸 (IAA) 等。 0077 可以采用离心、 过滤等手段对含有转化体的培养液进行分离回收转化体。 0078 转化

41、体处理物可以以下列形式得到， 即， 为了破坏细胞对转化体进行机械破坏、 超 声波处理、 冻结融解处理、 干燥处理、 加压或减压处理、 渗透压处理、 自身消化、 表面活性剂 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A7/17 页 10 处理、 酶处理而得到的物质、 及含有通过上述处理所得的 DSA 的部分的固定化物、 转化体的 固定化物。 0079 需要说明的是， 本发明中微生物的处理物也指进行与上述转化体处理物相同处理 所得的物质。 0080 为了从上述转化体或转化体处理物中精制 DSA， 可以通过组合使用下述方法得到 精制酶， 即， 破碎转化体细胞使细胞破碎液通过

42、离子交换树脂或凝胶过滤等色谱进行分馏 或通过硫酸铵等进行盐析等。 0081 5、 D- 丝氨酸的制备方法 0082 在存在上述转化体或其转化体处理物的条件下， 通过使甘氨酸和甲醛反应能够制 备 D- 丝氨酸。 0083 D- 丝氨酸的制备， 优选在 pH6.0 9.0、 温度 20 60、 振荡或搅拌的条件下进 行。 0084 转化体或其转化体处理物的使用量， 只要能够使甲醛和甘氨酸的反应充分进行即 可， 则没有特殊的限制， 通常添加相对于 1g 甘氨酸可以产生至少 10unit、 优选 50unit 以上 DSA活性的量。 转化体或其转化体处理物的添加方法可以在反应开始时一次性添加， 也可以

43、 在反应过程中分批或连续加入。 0085 DSA 活性将能够在 1 分钟内合成 1mol D- 丝氨酸的能力定义为 1unit。 0086 DSA 活性的计算方法如下， 在含有 100mM 甘氨酸、 0.1mM 磷酸吡哆醛、 10mM 氯化镁、 5mM甲醛的pH8.0的200mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)缓冲液中加入酶液， 在30 下保温， 测定 D- 丝氨酸的生成量进行计算。 0087 反应液中甘氨酸的浓度在 100mM 以上， 优选在 1M 以上 5M 以下。对于甘氨酸的添 加方法， 可以在反应开始时一次性添加， 也可以伴随反应的进行分批或连续加入。 0088 对于甲醛，

44、可以向反应液中供给其气体， 也可以制成水溶液或醇溶液供给。另外， 也可以使用多聚甲醛作为甲醛的供给源， 优选使用 37左右的甲醛水溶液。 0089 作为甲醛的添加方法， 可以采用一次性添加或伴随反应进行分批或连续地添加的 方法， 优选将反应液中的甲醛浓度控制在不阻碍 DSA 活性的浓度。所谓不阻碍 DSA 活性的 浓度， 通常在 5M 以下， 优选在 2M 以下， 更优选在 500mM 以下， 特别优选在 300mM 以下。 0090 作为控制反应液中甲醛浓度的方法， 可以采用下述方法， 即 (1) 以一定的速度向 反应液中添加的方法 ； (2) 定量甲醛浓度， 使其为酶活性不失活的浓度后分批

45、添加的方法 ； (3) 添加多聚甲醛， 通过向反应体系中加入高于多聚甲醛游离成甲醛的速度的酶量， 实质地 避免由甲醛造成的阻碍的方法 ； (4) 伴随着反应的进行， 反应液中生成物 D- 丝氨酸累积， 原 料甘氨酸减少。由于 D- 丝氨酸和甘氨酸的等电点分别为 5.68 和 5.97， 因此伴随反应的进 行引起反应液 pH 降低。也可以采用下述方法添加甲醛， 即， 向反应液中添加多于纠正反应 液 pH 降低的量的碱， 添加能够纠正上述 pH 上升部分的量的甲醛的方法。 0091 如果甲醛的添加速度在预先设定了反应液中DSA量的碱添加速度、 即D-丝氨酸的 合成速度以上， 则即使不采用测定甲醛浓

46、度等繁琐的操作也能控制反应液中甲醛的浓度。 0092 作为向反应液中添加的碱， 可以为氢氧化锂、 氢氧化钠、 氢氧化钾等碱金属氢氧化 物、 以及氢氧化铵、 氢氧化钙、 磷酸氢二钾、 磷酸氢二钠、 焦磷酸钾、 氨等溶解于水中使液体 呈碱性的物质。 说 明 书 CN 102226207 A CN 102226214 A8/17 页 11 0093 作为反应液的介质， 可以使用水或水性介质、 有机溶剂、 或、 水或水性介质和有机 溶剂的混合液。 作为水性介质， 例如可以使用磷酸缓冲液、 HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N-乙 磺酸 ) 缓冲液、 Tris 三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷 盐酸缓冲液

47、等缓冲液。作为有机溶剂， 只要为不阻碍反应的溶剂即可， 例如丙酮、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜、 二甲苯、 甲醇、 乙醇、 丁醇 等。 0094 在上述反应中， 通过添加具有 2 价金属离子的化合物、 2- 巯基乙醇、 二硫苏糖醇、 亚硫酸氢钠等还原剂或作为辅酶的磷酸吡哆醛、 铵盐等， 可以提高反应收率。 0095 作为具有 2 价金属离子的化合物， 例如可以举出氯化镁、 氯化锰、 乙酸钴、 硫酸亚 铁、 氯化钙等。 0096 作为上述化合物在反应液中的浓度， 通常为 0.1mM 至 100mM， 优选 0.1mM 至 10mM。 0097 6、 提高反应液中的 D- 丝氨酸的光学纯度的方法 00

48、98 通过在加热处理上述转化体或其转化体处理物所得的处理物存在下， 或在用有机 溶剂处理上述转化体或其转化体处理物所得的处理物存在下， 使甘氨酸和甲醛反应， 可以 抑制副反应生成 L- 丝氨酸。 0099 作为加热处理条件， 只要是加热不使 DSA 活性大幅度降低、 而使生成 L- 丝氨酸的 活性减低或消失的条件即可， 可以为任何条件。作为具体的例子， 例如可以举出 pH6.0 9.0、 温度 40 70、 搅拌 10 分钟至 6 小时的方法。 0100 另外， 也可以组合有机溶剂处理和加热处理。 0101 作为有机溶剂处理的条件， 只要是不使 DSA 活性大幅度降低、 而使生成 L- 丝氨酸

49、 的活性减低或消失的条件即可， 则可以为任何条件。 作为有机溶剂处理的条件， 有机溶剂的 浓度通常在 20mM 以上 2M 以下， 优选在 20mM 以上 1M 以下， 更优选在 50mM 1000mM， 特别 优选在 50mM 300mM 左右。有机溶剂只要是不使 DSA 活性大幅度降低的物质即可， 没有特 殊的限制， 优选使用甲醛、 乙醛、 苯甲醛等醛类、 甲醇、 乙醇、 异丙醇等醇类、 丙酮等酮类、 二 氯乙烷等卤代烃类等有机溶剂。其中， 由于甲醛是酶反应的底物， 所以最优选。由于添加 D-丝氨酸后通过该酶反应生成甲醛， 所以也可以采用代替甲醛添加D-丝氨酸的方法。 作为 D- 丝氨酸的添加浓度优选为 100mM 至 5M 左右。 0102 有机溶剂处理的温度在 10 50的范围内， pH 优选在 6.0 9.0 范围内。有 机溶剂处理中优选进行搅拌， 使处理液的 pH 和有机溶剂浓度均匀。 0103 另外， 也可以在 D- 丝氨酸制备反应开始时， 通过提高甲醛浓度， 使 L- 丝氨酸的生 成活性减低或失活。此时， 保持反应中的甲醛浓度约为 0.1至 5， 保持约 30 分钟至 3 小 时， 之后进行通常反应即可。 0104 在进行上述处理时， 通过添加具有 2 价金属离子的化合物、 2- 巯基乙醇、 二硫苏