伪狂犬病病毒SA215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制备方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101186902 B (45)授权公告日 2010.11.10 CN 101186902 B *CN101186902B* (21)申请号 200610021318.3 (22)申请日 2006.07.04 CCTC No.V20002 2000.03.28 C12N 7/00(2006.01) C12N 15/33(2006.01) A61K 39/245(2006.01) A61P 31/12(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 四川农业大学 地址 625014 四川省雅安市四川农业大学 (72)发明人 郭万柱 (74)专利

2、代理机构 成都立信专利事务所有限公 司 51100 代理人 冯忠亮 CN 1523103 A,2004.08.25,?. EP 0682108 A1,1995.11.15,?. ?.?(?).? ?18 1.2000,18(1),1-3. Thomas C. et al.Characterization of a quadruple glycoprotein-deletedpseudorabies virus mutant for use as a biologically safe livevirus vaccine.Journal of General Virology75.1994,75

3、1723-1733. (54) 发明名称 伪狂犬病病毒 SA215 和伪狂犬病毒多基因缺 失疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明属于动物病毒学及基因工程学技 术领域， 涉及缺失伪狂犬病病毒闽 A 株的部分 毒力基因的伪狂犬病病毒， 并用所述病毒制备 成疫苗的方法。利用 DNA 重组技术人工去除 PRV(Pseudorabies Virus， PRV) 中影响毒力的几 个病毒复制非必须基因 TK、 gE、 gI、 11K、 28k 的全 部或部分蛋白编码区， 降低 PRV 的毒力， 获得减毒 基因工程缺失弱毒疫苗株SA215， 并用SA215病毒 制备疫苗， 免疫动物能有效地预防和控制伪狂犬

4、 病的发生和流行。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 ? (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 3 页 说明书 18 页 附图 8 页 CN 101186902 B1/3 页 2 1. 伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus)SA215， 其保藏编号为 CCTCC No ： V200002， 保 藏日期为 2000 年 3 月 28 日。 2. 根据权利要求 1 所述的伪狂犬病病毒 SA215， 其特征在于 ： 1) 其缺失部分 TK、 gI、 28K 基因序列和全部的 gE、 11K 基因序列 ； 2) 其重组

5、病毒含有的特征序列为 ： GCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACC AGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAACGACGAGAGCTTCAGGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTG ACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGCG GGCCTACGCCCCCGCCACGCCGTACGCCATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGGCTCG

6、CCGAGGCCCAGGCCCCGGC CCCGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGTGACGCCCGCGCCCCCCGGCCGCCTGCCCGAGCCGGCGACGCGG GACCACGCCGCCGGGGGCCACCCCACGCCGCGACCCCCGAGGCCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGC CGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCCCGCGGAGCCGTTCCAGCCGCGGACCCCCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGC CACCGCTCGGTGATCGTCGGCACGGGCACCGCGATGGGCGCGCTCCT

7、GGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCC GCCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGCCTCCTGGGCGGTCCCGCGGACACCGACGAGCTAAAAGCGCAGCCCGGTCCG TAGCCTCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGACGTGACCCGGCTCCCCGCGGGGCTCCTCCTCGC CGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTC GCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAA

8、CCTGACGATCGACGGGACGCTGCTGTTTCTGGAGGGGC CCTCGCCGAGCAACTACAGCGGGCGCGTGGAGCTGCTGCGCCTCGACCCCAAGCGCGCCTGCTACACGCGCGAGTA CGCCGCCGAGTACGACCTCTGCCCCCGCGTGCACCACGAGGAATTCGAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGTTACATAA CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCA TAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGAC

9、GTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAG TACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGT TTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAA

10、AATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATG GGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCC ATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCCGGTACTCGA GGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGG TGCAAATCAAAGA

11、ACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAA AAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCAATTCCCGGGGATCGAAAGAGCCTGCTAAAGCAAAAAAGAAGTCACCATG TCGTTTACTTTGACCAACAAGAACGTGATTTTCGTTGCCGGTCTGGGAGGCATTGGTCTGGACACCAGCAAGGAGCT GCTCAAGCGCGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAG C

12、ACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTG AATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGA GGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATC CCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAA

13、TGTTGATGAA AGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCG CTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACC GCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATT 权 利 要 求 书 CN 101186902 B2/3 页 3 TTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCA

14、TAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGA TTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTT TATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTAT GCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGC GGTGGTTGAAC

15、TGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGA TTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTG CATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCG CTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCA

16、 ATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGC GTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGG CGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAG CCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTC

17、CCGGCTGTGCCG AAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGAT GGGTAACAGTCTTGGCGG TTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGT CTGGGACTGGGTGG ATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTT TGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGAC

18、CGCACGCCGCATCCAGCGCTGA CGGA AGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACC TGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTG CCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACT CTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGT

19、CAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGT GGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATG GATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGG CGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCA CCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGT GAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGT

20、CGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTT GTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAA CCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCG AGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGG ATTAGGGCCGCAAGAAAACT

21、ATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACA TGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAG TGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCT GCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGT CAGTATCG

22、GCGGAATTACAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCG GGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCGCGTAAGGAAATCCATTATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGGATGTT CGGTTTATTCTTTTTCTTTTACTTTTTTATCATGGGAGCCTACTTCCCGTTTTTCCCGATTTGGCTACATGACATCA ACCATATCAGCAAAAGTGATACGGGTATTATTTTTGCCGCTATTTCTCTGTTCTCGCTATTATTCCAACCGCTG

23、TTT GGTCTGCTTTCTGACAAACTCGGCCTCGACTCTAGGCGGCCGCGGGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT TTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTA ACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG GGAGGTTTTTTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCACCTTCCGCGGCTGTCTGCG

24、CAAGCGCGAGCCGCT 权 利 要 求 书 CN 101186902 B3/3 页 4 CGCCCGGCGCGCGTCCGCCGCGGTGGAGGCGCGCCGGCTGCTGTTCGTCTCGCGCCCGGCCCCGCCGGACGCGGGGT CGTACGTGCTGCGGGTCCGCGTGAACGGGACCACGGACCTCTTTGTGCTGACGGCCCTGGTGCCGCCCAGGGGGCGC CCCCACCACCCCACGCCGTCGTCCGCGGACGAGTGCCGGCCCGTCGTCGGATCGTGGCACGACAGCCTGCGCGTCGT GGACCCCGCCGAGGACGC

25、CGTGTTCACCACGCCGCCCCCGATCGAGCCAGAGCCGCCGACGACCCCCGCGCCCCCCC GGGGGACCGGCGCCACCCCCGAGCCCCGCTCCGACGAAGAGGAGGAGGACGAGGAGGGGGCGACGACGGCGATGACC CCGGTGCCCGGGACCCTGGACGCGAACGGCACGATGGTGCTGAACGCCAGCGTCGTGTCGCGCGTCCTGCTCGCCGC CGCCAACGCCACGGCGGGCGCCCGGGGCCCCGGGAAGATAGCCATGGGGGTGACGGCCATCACCGTGGTCACGCTGA TGGACG

26、GGTCCGGGCGCATCCCCGCCTTCGTGGGCGAGGCGCACCCGGACCTGTGGAAGGTGCTCACCGAGTGGTGC TACGCGTCGCTGGTGCAGCAGCGGCGCGCCGCCGACGAGGACACGCCGCGGCAACACGTGGTGCTGCGCTCCTCGGA GATCGCCCCCGGCTCGCTGGCCCTGCTGCCGCGCGCCACGCGCCCCGTCGTGCGGACACGGTCCGACCCCACGGCGC CGTTCTACATCACCACCGAGACGCACGAGCTGACGCGGCGCCCCCCGGCGGACGGCTCGAAGCCCGGGGAGC

27、CCCTC CGTATCAGCCCGCCCCCGCGGCTGGACACGGAGTGGTCCTCCGTCATCAACGGGATCC。 3. 伪狂犬病病毒多基因缺失疫苗， 其特征在于按 5108PFU/ml 的保藏编号为 CCTCC No ： V200002的伪狂犬病病毒SA215蔗糖脱脂牛乳50ml2.5g50ml的比例制成。 权 利 要 求 书 CN 101186902 B1/18 页 5 伪狂犬病病毒 SA215 和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制 备方法 技术领域 ： 0001 本发明属于动物病毒学及基因工程学技术领域， 涉及缺失伪狂犬病病毒闽 A 株的 部分毒力基因的伪狂犬病病毒， 并用所

28、述病毒制备成疫苗的方法。 背景技术 ： 0002 伪狂犬病 (Pseudorabies， PR) 是由疱疹病毒科， - 疱疹病毒亚科的伪狂犬病病 毒(Pseudorabies Virus， PRV)引起的多种家畜和野生动物的以发热、 奇痒及脑脊髓炎为主 要症状的一种急性传染病。猪是本病的原发感染宿主， 又是病毒的长期储存和排毒者。该 病的发生和流行有两大主要特点 ： 即以神经症状为主的两周龄内仔猪大批量发病、 死亡和 以母源性繁殖障碍为特点的生产母猪流产、 死胎和木乃伊胎或者产出弱胎和死胎。 目前， 该 病在世界上分布广泛， 并有不断蔓延扩大的趋势。 据专家估计， 其已成为仅次于口蹄疫和猪 瘟

29、的危害养猪业的重要疫病。 本病在美国、 日本、 前苏联及欧洲的一些国家被列为重点防制 的猪病之一。 0003 疫苗接种是防制伪狂犬病的重要手段之一。应用的常规疫苗有两类， 即弱毒疫苗 和灭活苗， 两者在临床应用时均有缺陷。灭活苗虽然安全， 但它具有免疫效力不佳、 接种剂 量较大， 而且在接种 24 小时后偶尔出现过敏反应等缺陷。一次接种产生的免疫持续时间明 显短于二次接种， 因此需要进行二次免疫接种。这给防疫工作带来诸多不便。在弱毒苗方 面， 各国培育的弱毒苗品系很多， 最常用的为Bartha株、 Bucharest株。 弱毒苗免疫原性好， 但在接种后虽然能预防临床症状的出现， 但不能防止强毒

30、在被感染动物体内复制、 排出和 形成潜伏感染。因此， 被接种猪仍可能是潜在传染源， 并可能发生复发性感染。这是尽管使 用了伪狂犬病常规疫苗， 该病仍对养猪业生产产生深远的影响的原因。许多国家对伪狂犬 病采取了严格的控制政策。为保证伪狂犬病消除措施的施行， 需要接种比常规疫苗更有效 的疫苗， 此外， 使用这些疫苗后， 应保证采取血清学方法能鉴别开来接种猪和野毒感染猪。 0004 随着现代分子生物学的发展， 通过在分子水平上对伪狂犬病病毒基因组的研究， 导致兽医疫苗领域发生了一场革命。当前接种常用的伪狂犬病疫苗是通过基因操作， 对病 毒生长所非必需的且与毒力有关的基因如 TK， gE(gI)， g

31、I(gp63)， gG(gX)， gC(gIII) 进行缺 失而获得的基因缺失疫苗(标志疫苗)。 伪狂犬病基因缺失疫苗有以下优点而被广泛接受 ： (1) 由于伪狂犬病基因缺失疫苗都缺失了目的基因的几百甚至几千个碱基， 缺失区域明确， 缺失片段大， 所以它们返祖的可能性极小。 (2)伪狂犬病基因缺失株都缺失一个或几个影响 毒力的基因， 所以对鼠、 猪无毒力或仅有相当低的毒力。 且大多数的伪狂犬病基因缺失株都 有较强的免疫原性， 免疫动物都获得了较强的保护力。 攻毒后， 免疫猪不出现伪狂犬病临床 症状， 猪排毒时间大大缩短， 排毒量大为降低。(3) 大多数伪狂犬病基因缺失株在体内复制 和扩散能力大

32、大减弱， 不能侵入中枢神经系统， 很难形成潜伏感染。 且其在三叉神经节的预 先定殖能阻止强毒侵入中枢神经组织， 也使强毒很难在中枢神经组织形成潜伏。(4) 可以 把缺失基因表达蛋白作为标志蛋白， 然后通过对抗标志蛋白抗体的检测将疫苗免疫动物和 说 明 书 CN 101186902 B2/18 页 6 野毒感染动物区分开， 以便对野毒感染动物采取针对性的防制措施。可用作缺失标志的基 因有 gE， gG 和 gC。但在美国的应用实践表明， 因为抗 gG 抗体的产生易受母源抗体影响， 所 以检测抗 gG 抗体的鉴别性诊断方法的特异性存在缺陷。gC 是重要的免疫原， 抗 gC 抗体水 平与对野毒株的抵

33、抗力、 攻毒后生长增重和阻止强毒释放呈正相关。而 gE 基因在所有伪狂 犬病病毒野毒株中均稳定表达， 野毒感染猪中均存在抗 gE 糖蛋白的抗体， 抗体持续时间可 达 2 年， 且不是刺激机体产生保护性免疫所必需， 所以被作为最佳标志基因， gE 基因缺失株 疫苗是无毒的， 并且他们缺失编码 gE 糖蛋白的 DNA 序列， 不能表达 gE 糖蛋白来刺激机体产 生抗 gE 抗体， 因此可通过使用商业化 gE-ELISA 检测抗 gE 抗体来区分开接种血清阳性猪和 野毒感染血清阳性猪。这种接种 gE 基因缺失疫苗结合鉴别性诊断能力现在已成为在美国 和各欧共体成员国及中国台湾地区推广的规章化的伪狂犬病

34、消除计划的理论基础。gE 基 因缺失疫苗是在欧共体成员国中唯一被允许使用的修饰活疫苗。丹麦规定于 1993 年 9 月 起， 法国规定于 1995 年 10 月起， 强制使用伪狂犬病 gE 基因缺失疫苗。1992 年 4 月美国家 畜保护研究所伪狂犬病委员会决定 ： 至 1993 年 7 月 1 日， 将终止未包含 gE 缺失的伪狂犬病 疫苗的分发和销售工作 ； 至 1994.1.1， 未包含 gE 缺失的伪狂犬病疫苗的使用也将被终止。 0005 gE 虽然是伪狂犬病病毒在体内和体外复制生长所非必需的， 但它决定毒力和病毒 复制。gE 在决定病毒从细胞上释放和由细胞到细胞传播起着重要作用。它的

35、另一重要功 能是通过促进伪狂犬病病毒通过突触相连的神经元而促进其进入中枢神经系统和在其中 转运扩散。因而， gE 对于伪狂犬病病毒的毒力是很重要的。对 PRV 进行缺失后， 缺失株的 噬神经性减弱， 在体内复制能力和顺神经传播(从神经细胞体由轴突向外传播)能力减弱， 所以病毒株的毒力显著降低， 对 3-10 周龄的猪接种后未能引起典型的 AD 症状 ( 如死亡、 神 经、 呼吸症状、 体重减轻、 发热)。 然而， 伪狂犬病病毒的毒力是受多基因控制的， 其毒力不只 是 gE+ 表现型的功能。事实上， 伪狂犬病病毒仅只缺失 gE 基因是仍能在体内和体外复制并 保持一定程度的毒力， 商业用 gE 基

36、因缺失疫苗的毒力减弱是通过对 gE 基因和其他与毒力 相关联的基因的共同缺失造成的。 现报道的包含gE基因缺失的疫苗株有 ： 以高毒力的和高 免疫原性的 NIA-3 株为起始材料获得的 2.4-N3A(gE-)， 对 2.4-N3A 株 TK 基因缺失获得的 PRV783(gE-/TK-)， gE-/TK-， M301(gE-)( 在 124 位氨基酸处引入 10 个核苷酸导致移码即读 框移位 )， M303(gE-)( 对 125 位结氨酸和 126 位半胱氨酸缺失， 导致不连续的抗原区域 C、 E 丢失)， gE-/gI-株， gE-/gG-/TK-株， IowaS62株(Ge-/gG-/

37、TK-)和PRV-Ba-UL10-(gE-/gI-/ gM-)等。 gE基因缺失株的免疫原性要高于常规弱毒苗和其它类基因缺失苗， gE基因缺失株 疫苗接种猪后引起的中和抗体滴度不一致， 但均可抵御强毒感染。攻毒后不引起发热或引 起低热， 生长没受阻碍或受短时间的影响， 不向外散毒或散毒滴度低。正是由于 gE 基因缺 失株的高免疫原性， 同时结合 gE-ELISA 检测淘汰野毒感染阳性猪， 可使根除伪狂犬病成为 可能。四川农业大学郭万柱自 20 世纪 80 年代等以来自发病牛的 PRV 闽 A 株为材料， 通过 外切酶消化缺失了部分 TK 基因， 构建了 pTD 转移载体， 同时通过限制性内切酶

38、缺失构建了 pP63LacZ 转移载体质粒， 在此基础上通过同源重组技术构建了 PRV Fa 基因缺失株 SA215。 本发明中所构建的 PRV Fa 基因缺失株， 删除了 PRV TK、 gE 和 gI 等重要毒力基因， 这些基因 为病毒复制非必需基因， 其缺失不影响病毒的复制而同时保留了病毒的免疫原性。 PRV多基 因缺失疫苗株缺失了全部的 gE、 11K 的基因和部分 TK、 gI 和 28K 蛋白基因。该基因的缺失 使得 PRV 基因缺失疫苗突变株中不包含有任何 gE 基因的序列， 不存在表达任何 gE 基因或 说 明 书 CN 101186902 B3/18 页 7 者部分 gE 基

39、因肽段的可能性， 为伪狂犬病的根除计划提供坚实可靠的理论和实际操作可 行性。华中农业大学陈焕春等于 20 世纪 90 年代末开始了伪狂犬病 TK-/gG- 双基因缺失疫 苗的研究， 但由于 gG 基因并不是毒力基因， 因此获得的突变疫苗株并不是理想的疫苗株， 毒力不能得到有效地减低， 为了进一步减低该毒株的毒力， 提高安全性， 陈焕春在 TK 基因 缺失的基础上， 用BstEII和StuI双酶切质粒pSKFB， 弃去1247bp的片段， 回收大小为5.7kb 的片段， 用 Klenow 酶补平， T4DNA 连接酶连接， 通过同源重组技术缺失了 gE 和 gI 基因， 从 而获得了 PRVTK

40、-/gE-/gI- 基因缺失突变疫苗。该疫苗株缺失的基因为部分 gI、 gE、 28K 和 全部的 11k 基因。对于在伪狂犬病的根除计划中具有非常重要意义的 gE 基因只缺失了部 分基因， 存在表达部分 gE 糖蛋白从而影响鉴别诊断疫苗免疫猪和强毒感染猪的可能性， 因 此该毒株存在干扰诊断的潜在隐患。 发明内容 ： 0006 本发明人为了克服现有的疫苗免疫原性不好、 安全性不高、 难于区分野毒感染猪 和疫苗免疫猪等技术难题， 以伪狂犬病病毒闽 A 株为原始材料， 通过同源重组的方法人工 缺失了伪狂犬病病毒中影响毒力的几个基因 TK、 gE、 gI、 11K、 28K， 获得了一株毒力减低且不

41、 影响伪狂犬病病毒免疫原性的 SA215 病毒。所述病毒制备成疫苗后能有效地预防和控制伪 狂犬病的发生和流行。 0007 本发明的第一个目的是提供 SA215 病毒 ； 0008 本发明的第二个目的是提供 SA215 病毒制备的疫苗及该疫苗的制备方法。 0009 本发明是这样实现 ： 0010 本发明伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)SA215(CCTCC， 保藏日期 ： 2000年3月 28 日， 保藏编号 ： V200002)。 0011 本发明伪狂犬病病毒 SA215 0012 1) 其缺失部分 TK、 gI、 28K 基因序列和全部的 gE、 11K 基因序列 ； 0

42、013 2) 其重组病毒含有的特征序列为 ： 0014 GCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGT 0015 GGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAACGACGAGAGCTTCAGGCGGGGCGTGGACGTGA 0016 TGCGATTCCTGACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAAC 0017 GGCCGGACGCTCCCGCGGGCCTACGCCGCCGCCACGCCGTACGCC

43、ATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGG 0018 CTCGCCGAGGCCCAGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGTGACGCCCGCGCCCC 0019 CCGGCCGCCTGCCCGAGCCGGCGACGCGGGACCACGCCGCCGGGGGCCACCCCACGCCGCGACCCCCGAGG 0020 CCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGCCGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCCCGCGGAGCC 0021 GTTCCAGCCGCGGACCCCCGCCGCGCCGGGCGTCTCG

44、CGCCACCGCTCGGTGATCGTCGGCACGGGCACCG 0022 CGATGGGCGCGCTCCTGGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCCGCCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGC 0023 CTCCTGGGCGGTCCCGCGGACACCGACGAGCTAAAAGCGCAGCCCGGTCCGTAGCCTCCGCAGTACCGGCG 0024 TCGATGATGATGGTGGCGCGCGACGTGACCCGGCTCCCCGCGGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGC 0025 CGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCC

45、TCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCG 0026 CCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATCGACGGGACGCTGCTGTTTCTGGAGGGGCCCTCG 0027 CCGAGCAACTACAGCGGGCGCGTGGAGCTGCTGCGCCTCGACCCCAAGCGCGCCTGCTACACGCGCGAGTA 说 明 书 CN 101186902 B4/18 页 8 0028 CGCCGCCGAGTACGACCTCTGCCCCCGCGTGCACCACGAGGAATTCGAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGT

46、TA 0029 CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACG 0030 TATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC 0031 CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGC 0032 CCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA

47、CGTATTAGTC 0033 ATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGG 0034 ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAA 0035 AATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC 0036 AGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTT

48、TGACCTCCATAGAAGACA 0037 CCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACT 0038 GGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTC 0039 CTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATT 0040 TACCCGCGGCCGCAATTCCCGGGGATCGAAAGAGCCTGCTAAAGCA

49、AAAAAGAAGTCACCATGTCGTTTAC 0041 TTTGACCAACAAGAACGTGATTTTCGTTGCCGGTCTGGGAGGCATTGGTCTGGACACCAGCAAGGAGCTGC 0042 TCAAGCGCGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTT 0043 GCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTT 0044 GCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGG 0045 AGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCC 0046 ATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTG 0047 TTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTT