多核苷酸标志物.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 200880100228.0 (22)申请日 2008.05.23 07108777.9 2007.05.23 EP C12N 15/82(2006.01) (73)专利权人 先正达参股股份有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 约翰尼斯JL吉伦 托马斯克拉夫特 皮埃尔平 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 张文辉 U. Hohmann 等 .A bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugar beet and a physical map of

2、 the region encompassing the bolting gene B. Mol Gen Genomics .2003, 第 269 卷 ( 第 1 期 ), 第 126-136 页 . R. M. Gaafar 等 .Bacterial artificial chromosome-derived molecular markers for early bolting in sugar beet.Theor Appl Genet .2005, 第 110 卷 ( 第 6 期 ), 第 1027-1237 页 . A.El-Mezawy 等 .High-resolution ma

3、pping of the bolting gene B of sugar beet. Theor Appl Genet .2002, 第 105 卷 ( 第 1 期 ), 第 100-105 页 . J.Mitchell McGrath.MM5_H06 Yonung roots probed with 3 and 7 week old root enriched transcripts Bets vulgaris cDNA,mRNA sequence.GenBank .2004, 全文 . (54) 发明名称 多核苷酸标志物 (57) 摘要 本发明涉及糖用甜菜基因组内与抽苔基因或 B 基因紧密

4、连锁的且能用于开发分子标志物的多 核苷酸。本发明进一步涉及分子标志物和包含所 述标志物的试剂盒， 其能用于糖用甜菜基因组中 抽苔基因或 B 基因的定位、 鉴定和分离及用于一 年生与二年生基因型之间或显示二年生基因型的 糖用甜菜植株的植物分组内不同单元型之间的区 分。本发明还涉及牵涉所述标志物的糖用甜菜植 物育种的测定法和方法。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2010.01.25 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2008/056390 2008.05.23 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2008/142167 EN 2008.11.27 (51)

5、Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吕小蒙 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书46页 序列表36页 附图8页 (10)授权公告号 CN 101772575 B (45)授权公告日 2015.03.11 CN 101772575 B 1/2 页 2 1. 引物对， 其由正向引物和反向引物组成， 所述引物能够 (1) 与 SEQ ID NO ： 51 所示的 B 基因的启动子区退火， 和 (2) 在 PCR 反应中扩增其信息片段， 其中所述信息片段包含选自 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸位置 #87、 #160、 #406、 #3827、 #

6、3954、 #5284、 #5714、 #10954、 #11220、 #11391、 #12053、 #12127、 和 #12837 的多态性， 该多态性鉴定 B 基因座处的 B 等位基因且容 许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组 内的不同单元型。 2. 依照权利要求 1 的引物对， 其中多态性是包含位于 #3827 的 A/C SNP 和 / 或位于 #3954 的 A/T SNP 和 / 或位于 #5714 的 T/G SNP 和 / 或位于 #11220 的 C/ASNP 和 / 或位于 #11391 的 G/A SNP 和 / 或位于 #12

7、053 的 A/G SNP 和 / 或位于 #12127 的 C/T SNP 的多态 性。 3. 依照权利要求 2 的引物对， 其包含用于扩增包含 SNP#3827 的片段的 SEQ ID NO ： 27 所示正向引物 F3806 和 SEQ ID NO ： 28 所示反向引物 R3807。 4. 依照前述权利要求 1-3 中任一项的引物对， 其包含用于扩增包含 SNP#160 的片段的 SEQ ID NO ： 7 所示正向引物 PRR7-F 和 SEQ ID NO ： 8 所示反向引物 PRR7-R。 5. 探针多核苷酸组， 其包含与如 SEQ ID NO ： 51 中提供的 BvPRR7

8、基因启动子区的信息 片段内的亚区互补的至少两种不同探针(two separate probe)分子， 其中所述信息片段内 的所述亚区包含选自 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸位置 #87、 #160、 #406、 #3827、 #3954、 #5284、 #5714、 #10954、 #11220、 #11391、 #12053、 #12127、 和 #12837 的多态性， 且其中所述探针多核 苷酸扩增在交叠区域中只因代表上述 SNP 之一的一个碱基错配而不同的所述信息片段内 亚区的部分交叠片段， 其中用第一荧光染料标记的第一探针呈现一种等位基因， 而用不同 于第一染料的第二荧光染料标记

9、的第二探针呈现另一种等位基因。 6. 一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法， 包括 ： a. 自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品 ； b. 分析所述样品中与 SEQ ID NO ： 51 所示序列互补的基因组区域的核苷酸序列 ； 并 c.比较所述序列与SEQ ID NO ： 4或SEQ ID NO ： 5的序列， 其是与糖用甜菜植物二年生 表型有关的等位基因序列， 或与SEQ ID NO ： 3的序列比较， 其是与糖用甜菜植物一年生表型 有关的等位基因序列 ; 其中在步骤 (b) 中， 使用 SEQ ID NO ： 51 序列的包含选自 SEQ ID NO ： 5

10、的在核苷酸位 置 #87、 #160、 #406、 #3827、 #3954、 #5284、 #5714、 #10954、 #11220、 #11391、 #12053、 #12127、 和 #12837 的多态性组成组的多态性的亚区侧翼的正向和反向引物通过 PCR 反应分析内含 子区， 且其中在步骤(c)中将扩增的所述亚区与SEQ ID NO ： 4或SEQ ID NO ： 5的序列比较， 所述 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 是与糖用甜菜植物二年生表型有关的等位基因的序列， 或与 SEQ ID NO ： 3 的序列比较， 所述 SEQ ID NO ： 3 是与糖

11、用甜菜植物一年生表型有关的等 位基因的序列。 7. 一种依照前述权利要求 6 的用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的 缺失或存在的方法， 包括 ： a) 自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品 ； b)通过基于SEQ ID NO ： 7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO ： 8所示反向引物PRR7-R 的 PCR 扩增， 分析自糖用甜菜基因组可获得的内含子区的核苷酸序列 ； 并 权 利 要 求 书 CN 101772575 B 2 2/2 页 3 c) 分别比较所述序列与 SEQ ID NO ： 4 的序列， 其是与糖用甜菜植物二年生表型有关的 等位基因序列， 或与SEQ I

12、D NO ： 3的序列比较， 其是与糖用甜菜植物一年生表型有关的等位 基因序列， 其中在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 87 的位置存在胸腺嘧啶和 / 或在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 160 的位置存在胸腺嘧啶和 / 或在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 406 的位置存 在鸟嘌呤是存在与糖用甜菜植物一年生表型有关的等位基因的表征， 和其中在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 87 的位置存在胞嘧啶和 / 或在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 160 的位置存 在胞嘧啶和/或在对应于SEQ ID NO ： 5的位置406的位置存在腺嘌呤是

13、存在与糖用甜菜植 物二年生表型有关的等位基因的表征。 8. 依照权利要求 7 的方法， 其中所述内含子区具有 SEQ ID NO ： 2 所示核苷酸序列。 9. 一种用于鉴定糖用甜菜基因组中与一年生表型共分离的基因组区域中 的多态性的 等位基因区分测定法， 该多态性鉴定 B 基因座处的 B 等位基因且容许区分一年生与二年生 表型， 其中所述测定法包括多核苷酸 SNP 标志物的应用并且其中所述多核苷酸 SNP 标志物 由依照权利要求 1-4 中任一项的引物对代表。 10. 一种在糖用甜菜植物中鉴定与二年生有关的等位基因的缺失或存在的方法， 包 括 ： a) 自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品

14、； b) 使用与 BvPRR7 基因的启动子区中存在的核苷酸序列互补并与之结合的引物或引物 对自所述样品 DNA 扩增片段 ； 和 c) 比较所述序列与 SEQ ID NO ： 4 的序列， 其是与糖用甜菜植物二年生表型有关的等位 基因序列， 其中在对应于 SEQ ID NO ： 5 的位置 87 的位置存在胞嘧啶和在对应于 SEQ ID NO ： 5 的 位置160的位置存在胞嘧啶和在对应于SEQ ID NO ： 5的位置406的位置存在腺嘌呤是存在 与糖用甜菜植物二年生表型有关的等位基因序列的表征。 11. 权利要求 10 的方法， 其中在步骤 b) 中 BvPRR7 基因的启动子区中存在

15、的核苷酸序 列是 SEQ ID NO ： 51 所示的 BvPRR7 基因的启动子区。 权 利 要 求 书 CN 101772575 B 3 1/46 页 4 多核苷酸标志物 发明领域 0001 本发明属于糖用甜菜种子的标志物辅助育种和质量控制的领域。具体而言， 本发 明涉及糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁的或位于抽苔基因或B基因内的且 能用于开发分子标志物的多核苷酸。 本发明进一步涉及分子标志物和包含所述标志物的试 剂盒， 其能用于糖用甜菜基因组中抽苔基因或 B 基因的定位、 鉴定和分离及用于一年生与 二年生基因型之间或显示二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内不同单元型之间的 区

16、分。本发明进一步涉及转基因方法， 其中提供 B 基因或是过表达或是下调的转基因植物。 0002 发明背景 0003 栽培的糖用甜菜 (Beta vulgaris ssp.vulgaris L.) 是二年生植物， 其在第一年 形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝条延长 ( 抽苔 ) 和花形成。与此相反， B.vulgaris ssp.maritima 属的许多野生甜菜显示一年生生长习性， 这是由于 B 基因座处 存在抽苔基因 B， 其位于染色体 II 的中央区。基因座 B 的显性等位基因在野生甜菜中是 丰富的， 而且在长日照下引起抽苔 (bolting)， 无需对于携带隐性等位基因的二年

17、生栽培种 (cultivars) 而言通常至关重要的冷 ( 低温， cold) 要求 (Abe 等， 1997)。 0004 抽苔 ( 茎延长 ) 是营养性向生殖性生长转换中明显可见的第一步。 0005 在栽培的糖用甜菜中， 抽苔是不想要的现象， 因为它导致产量降低而且引起收获 和提取糖期间的问题。由于 B 等位基因的不完全外显率及其环境依赖性， 需要紧密连锁的 分子标志物来筛选它在育种系中的存在。 0006 糖用甜菜的商业性种子生产常常在生长有一年生杂生 (weed) 甜菜的地区进行， 它们能在种子生产中引起花粉污染， 导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受 的。为了鉴定一年生植物的

18、污染， 在收获种子后立即在没有野生型一年生甜菜生长的地区 种植各批次的商业性种子。不对植物春化， 而且通过抽苔者的存在来鉴定污染。非常希望 用基于标志物的筛选测定法来替代此测试， 因为能更早地得到结果， 这会导致种子加工中 成本节约。 0007 基于标志物的方法还能有利地用于糖用甜菜育种， 例如用于加快育种过程， 或用 于引入来自野生海甜菜的新变异。在这些情况中， 重要的是要有与 B 基因紧密连锁的能够 精确选择一年生植物或二年生植物的标志物。 0008 本发明现在提供了用于开发此类标志物的手段。 0009 发明概述 0010 具体而言， 本发明涉及在糖用甜菜基因组中鉴定的多核苷酸， 特别是分

19、离的多核 苷酸， 包括其变体和衍生物， 该多核苷酸与抽苔基因或 B 基因在遗传上紧密连锁， 或者优选 的是， 该多核苷酸位于抽苔基因或 B 基因内。本发明进一步涉及所述多核苷酸用于开发标 志物的用途， 该标志物能用于糖用甜菜基因组中抽苔基因或 B 基因的定位、 鉴定和分离。 0011 在本发明的一个方面中， 依照本发明的所述多核苷酸在糖用甜菜中显示与抽苔基 因 (B 基因 ) 相关表型的完美共分离。 0012 在一个实施方案中， 本发明涉及依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸， 包 说 明 书 CN 101772575 B 4 2/46 页 5 括其信息片段， 该多核苷酸可自位于标志物MP0

20、176和GJ01上游1cM且与标志物GJ131共分 离的， 在糖用甜菜中显示与抽苔基因 (B 基因 ) 相关表型完美共分离的基因组 DNA 区获得。 0013 在另一个实施方案中， 本发明涉及依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷酸， 其是自位于以标志物 GJ131 和 GJ01 定界的间隔 的基因组 DNA 可获得的。 0014 在本发明的一个实施方案中， 提供了多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多 核苷酸， 该多核苷酸是自糖用甜菜基因组中与抽苔基因或 B 基因遗传连锁的且包含一种或 多种下述元件的基因组糖用甜菜 DNA 可获得的 ： 0015

21、 a) 内含子区， 其在使用基因组糖用甜菜 DNA 作为模板时在使用 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 分别所示正向引物 PRR7-F 和反向引物 PRR7-R 或与 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 分别所示序列具有至少 90、 特别是至少 95、 更特别的是至少 98和多至 99序 列同一性的引物对的 PCR 反应中生成大约 0.5kb 的扩增产物， 特别是多核苷酸片段， 显示 SEQ ID NO ： 2、 3 或 4 所示核苷酸序列或其中具有至少 70、 特别是至少 75、 更特别的是 至少 80、 甚至更特别的是至少 85、 但尤其是

22、至少 90和多至至少 95 -99序列同一 性的序列 ； 0016 b)包含与SEQ ID NO ： 1或SEQ ID NO ： 52所示核苷酸序列具有70、 特别是75、 更特别的是 80、 甚至更特别的是 85、 但尤其是 90和多至 95 -99序列同一性的核 苷酸序列的多核苷酸片段 ； 0017 c) 多核苷酸片段包含 SEQ ID NO ： 5 所示核苷酸序列或与 SEQ ID NO ： 5 或 SEQ ID NO ： 51 所示核苷酸序列具有 70、 特别是 75、 更特别的是 80、 甚至更特别的是 85、 但 尤其是 90和多至 95 -99序列同一性的序列 ； 0018 d)

23、 在剪接后编码与 SEQ ID NO ： 6 所示核苷酸序列具有至少 80、 特别是至少 85、 更特别的是至少90、 甚至更特别的是至少95、 但尤其是至少98和多至100序 列同一性的多肽的多核苷酸片段 ； 和， 任选地， 此外 0019 e)编码氨基末端附近的假应答调控物接受者域基序(Pseudo ResponseRegulator Receiver Domain motif(PRR) 和羧基末端附近的 CCT 基序的高度保守部分。 0020 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在使用SEQID

24、NO ： 7和SEQ ID NO ： 8分别 所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO ： 7和SEQ ID NO ： 8分别所示序列 对具有至少90、 特别是至少95、 更特别的是至少98和多至99序列同一性的引物的 PCR 反应中产生大约 0.5kb 扩增产物的内含子区。 0021 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下多核苷酸片段， 该多核苷酸片段显示SEQ ID NO ： 1所示核苷酸序列或其中具 有至少70、 特别是至少75、 更特别的是至少80、 甚至更特别的是至少85、 但尤其是 至少 90和多

25、至至少 95 -99序列同一性的序列。 0022 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下多核苷酸片段， 该多核苷酸显示SEQ ID NO ： 2、 3或4所示核苷酸序列或其中 具有至少70、 特别是至少75、 更特别的是至少80、 甚至更特别的是至少85、 但尤其 是至少 90和多至至少 95 -99序列同一性的序列。 说 明 书 CN 101772575 B 5 3/46 页 6 0023 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其在剪接后编码与SEQ ID NO ： 6所示核苷酸序列具有

26、至少80、 特别是至少85、 更特 别的是至少 90、 甚至更特别的是至少 95、 但尤其是至少 98和多至 100序列同一性 的多肽。 0024 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 该多核苷酸片段包含 SEQ IDNO ： 5 所示核苷酸序列或与 SEQ ID NO ： 5所示核苷酸序列具有至少70、 特别是至少75、 更特别的是至少80、 甚至 更特别的是至少 85、 但尤其是至少 90和多至至少 95 -99序列同一性的序列。 0025 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多

27、核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 该多核苷酸片段包含 SEQ IDNO ： 51 所示核苷酸序列或与 SEQ ID NO ： 51 所示核苷酸序列具有至少 70、 特别是至少 75、 更特别的是至少 80、 甚 至更特别的是至少 85、 但尤其是至少 90和多至至少 95 -99序列同一性的序列。 0026 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 该多核苷酸片段包含 SEQ IDNO ： 52 所示核苷酸序列或与 SEQ ID NO ： 52 所示核苷酸序列具有至少 70、 特别是至少 75、 更特别的是至少 80

28、、 甚 至更特别的是至少 85、 但尤其是至少 90和多至至少 95 -99序列同一性的序列。 0027 本发明应当同样地覆盖落在本文所述 70 -99范围中的所有个别数值 (individual numerical values)， 即 71、 72、 73、 74、 75、 .90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99。 0028 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO ： 1所示 核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特

29、别的是在严格杂交条件下。 0029 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO ： 2、 3或 4 所示核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特别的是在严格杂交条件下。 0030 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO ： 5所示 核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特别的是在严格杂交条件下。 0031 在一个实施方案中， 本发

30、明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与 SEQ ID NO ： 51 所 示核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特别的是在严格杂交条件下。 0032 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与编码具有 SEQ ID NO ： 6 所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特别的是在 严格杂交条件下。 0033 在一个实施方案中， 本发明涉及多核苷酸， 包括其信息片段，

31、特别是分离的多核苷 酸， 其包含如下的多核苷酸片段， 其中所述多核苷酸片段的互补链能够与 SEQ ID NO ： 52 所 示核苷酸序列杂交， 特别是在中等杂交条件下， 更特别的是在严格杂交条件下。 0034 在本发明的一个实施方案中， 多核苷酸， 包括其信息片段， 特别是分离的多核苷 说 明 书 CN 101772575 B 6 4/46 页 7 酸， 所述多核苷酸在糖用甜菜基因组中与抽苔基因或 B 基因遗传连锁的基因组糖用甜菜 DNA 中可得到， 0035 a) 在 PCR 反应中使用 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 分别所示正向引物 PRR7-F 和 反向引物

32、 PRR7-R 或与 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 分别所示序列具有至少 90、 特别是 至少 95、 更特别的是至少 98和至多 99序列同一性的引物对筛选自二年生商业性栽 培种 H20 开发的 BAC 文库， 特别是在如下条件下 ： 初始变性 95 5 分钟， 接着 35 个扩增循 环 30 秒钟 95、 30 秒钟 60、 30 秒钟 72， 再接着 5 分钟 72 ； 0036 b) 选择包含均与 SEQ ID NO ： 1 所示 EST CV301305 共享序列同源性的两个非交叠 毗连序列群的 BAC SBA079-L24 并将它们组合成一条单一序列

33、； 0037 c) 基于 BAC 序列毗连序列群与 SEQ ID NO ： 1 所示 EST CV301305 的比对及基于与 来自拟南芥的 PRR7 基因的序列同源性， 获得包含内含子和外显子的甜菜 BvPRR7 基因的基 因结构。 0038 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 1 所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0039 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 2 所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0040 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 3 所示核 苷酸序列的

34、核苷酸序列。 0041 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 4 所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0042 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0043 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO ： 51所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0044 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO ： 52所示核 苷酸序列的核苷酸序列。 0045 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO

35、： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 T、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 A、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 A、 位于 11391 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 A、 位于 12337 的 G、 和位于 12837 的 G， 代表 一年生等位基因 1。 0046

36、 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的T、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 T、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 A、 位于 11238 的 A、 位于 11299 的 T、 位于 11391 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 G、 位于 12337

37、 的 G、 和位于 12837 的 G， 代表 一年生等位基因 2。 0047 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 说 明 书 CN 101772575 B 7 5/46 页 8 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 G、 位于 11143 的 T、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 A、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 T、 位于 1139

38、1 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 G、 位于 12337 的 G、 和位于 12837 的 G， 代表 一年生等位基因 3。 0048 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 T、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 T、 位于 11220 的

39、 A、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 T、 位于 11391 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 A、 位于 12337 的 G、 和位于 12837 的 G， 代表 一年生等位基因 4。 0049 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 T、

40、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 A、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 T、 位于 11391 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 A、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 A、 位于 12337A、 和位于 12837 的 G， 代表一 年生等位基因 5。 0050 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于3827的C、 位于3954的T、 位 于 5284 的 T、 位于 5

41、714 的 G、 位于 10954 的 G、 位于 11043 的 T、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 A、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 T、 位于 11391 的 A、 位于 12053 的 G、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 T、 位于 12193 的 A、 位于 12337A、 和位于 12837 的 G， 代表一 年生等位基因 6。 0051 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有 SEQ ID NO ： 5 所示核 苷酸序列的核苷酸序列， 其中所述序列具有位于3695的G、 位于

42、3827的A、 位于3954的A、 位 于 5284 的 C、 位于 5714 的 T、 位于 10954 的 A、 位于 11043 的 G、 位于 11143 的 C、 位于 11150 的 C、 位于 11220 的 C、 位于 11238 的 C、 位于 11299 的 T、 位于 11391 的 G、 位于 12053 的 A、 位于 12086 的 G、 位于 12127 的 C、 位于 12193 的 G、 位于 12337G、 和位于 12837 的 A， 代表二 年生等位基因 7。 0052 在一个具体的实施方案中， 依照本发明的多核苷酸包含具有编码如下多肽的核苷 酸序列的核

43、苷酸序列， 该多肽具有 SEQ ID NO ： 6 所示氨基酸序列。 0053 在一个实施方案中， 本发明涉及大约 0.5kb 的扩增产物， 包括信息片段， 其在使 用基因组糖用甜菜 DNA 作为模板时在用 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 分别所示正向引物 PRR7-F 和反向引物 PRR7-R 进行的 PCR 反应中可得到。 0054 在本发明的一个具体实施方案中， 提供了一组多核苷酸标志物， 其包含众多标志 物个体， 所述标志物是基于SEQ ID NO ： 5所示多核苷酸， 包括上文所述任何其等位基因变体 1-7 开发的， 且能够检测位于表 5 所示核苷酸位置处

44、的各种 SNP， 其中所述标志物组能够鉴 定不同等位基因并如此区分一年生和二年生糖用甜菜系。 0055 在一个实施方案中， 本发明涉及一种或众多探针分子和 / 或一种或众多引物， 特 说 明 书 CN 101772575 B 8 6/46 页 9 别是一种或众多引物对， 但尤其是由正向引物和反向引物组成的一种或众多引物对， 该引 物能够与糖用甜菜基因组中与 B 基因遗传紧密连锁基因组区域 ( 特别是 B 基因内的区域 ) 内的核苷酸序列退火， 且包含依照本发明和如本文所述的多核苷酸， 包括其信息片段， 其中 所述片段包含多态性， 特别是基于 SNP、 SSR、 至少一个核苷酸的缺失或插入的多态

45、性， 但尤 其是基于 SNP 的多态性， 该多态性鉴定 B 基因座处的 B 等位基因且容许区分一年生与二年 生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。 0056 在本发明的一个实施方案中， 提供了多核苷酸标志物， 其能自选自下组的多核苷 酸分子或其信息片段开发 ： SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 51 和 SEQ ID NO ： 52 所示多核苷酸及编码包含 SEQ ID NO ： 6 所示氨 基酸序列的多肽的多核苷酸，

46、其中所述多核苷酸标志物包含一处或多处多态性， 特别是基 于 SNP、 SSR、 至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性， 但尤其是基于 SNP 的多态性， 该多态 性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生 基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。 0057 在本发明的一个具体实施方案中， 提供了基于 SEQ ID NO ： 2 所示多核苷酸开发的 多核苷酸标志物， 该标志物能够检测 BvPRR7 基因第 3 内含子中的至少一种下述 SNP ： 0058 a) 位于 87 的胞嘧啶或胸腺嘧啶， 0059 b) 位于 160 的胞嘧啶或胸腺嘧啶， 0060

47、c) 位于 406 的腺嘌呤或鸟嘌呤， 0061 并如此区分一年生与二年生单元型。 0062 在一个实施方案中， 所述多核苷酸标志物表现为一种或众多探针分子和 / 或一种 或众多引物， 特别是一种或众多引物对， 但尤其是由正向引物和反向引物组成的一对引物， 所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的显示SEQ ID NO ： 2所示核苷酸 序列的基因组区域内的核苷酸序列退火显示且能够扩增其信息片段， 其中所示片段包含一 处或多处多态性， 特别是基于 SNP、 SSR、 或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性， 但尤其 是表 1 所示基于 SNP 的多态性， 该多态性鉴定 B 基因座处的

48、 B 等位基因且容许区分具有一 年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内 的不同单元型。 0063 在一个具体的实施方案中， 提供了依照本发明的和如本文所述的一对引物， 其与 SEQ ID NO ： 2 所示第 3 内含子内的核苷酸序列退火， 且自所示区域扩增包含多态性的信息 片段， 特别是包含位于 #87 的 C/T SNP 和 / 或位于 #160 的 C/T SNP 和 / 或位于 #406 的 A/ G SNP 的多态性。 0064 具体而言， 一对引物包含用于扩增包含 SNP#160、 SNP#87 和 SNP#406 的片段的 SEQ ID NO

49、 ： 7 所示正向引物 PRR7-F 和 SEQ ID NO ： 8 所示反向引物 PRR7-R。 0065 在一个实施方案中， 依照本发明的多核苷酸标志物表现为一种或众多探针分子和 / 或一种或众多引物、 特别是一种或众多引物对、 但尤其是由正向引物和反向引物组成的一 对引物， 所述引物能够与糖用甜菜基因组中与 B 基因遗传紧密连锁的基因组区域内的核苷 酸序列 ( 特别是 B 基因内的核苷酸序列， 特别是 SEQ ID NO ： 5 所示核苷酸序列 ) 退火， 且扩 增其信息片段， 其中所述片段包含一处或多处多态性， 特别是基于 SNP、 SSR、 至少一个核苷 酸的缺失或插入的多态性， 但尤其是例如表 5 所示基于 SNP 的多态性， 该多态性鉴定 B 基因 说 明 书 CN 101772575 B 9 7/46 页 10 座处的 B 等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生 基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。 0066 在一个具体的实施方案中， 提供了依照本发明的和如本文所述的一对引物， 其与 SEQ ID NO ： 5 所示 BvPRR7 基因的编码区内的核苷酸序列退火且自所述编码序