多价疫苗.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102177175 A (43)申请公布日 2011.09.07 CN 102177175 A *CN102177175A* (21)申请号 200980140421.1 (22)申请日 2009.08.14 12/192,015 2008.08.14 US C07K 14/155(2006.01) C12N 15/49(2006.01) A61K 39/21(2006.01) (71)申请人 洛斯阿拉莫斯国家安全股份有限公 司 地址 美国新墨西哥州 申请人 贝斯以色列女执事医疗中心 杜克大学 UAB 研究基金会 (72)发明人 贝特T科贝尔 威廉费舍尔 诺曼莱文 廖

2、华新 巴顿F海恩斯 比阿特里斯H哈恩 (74)专利代理机构 中国商标专利事务所有限公 司 11234 代理人 万学堂 (54) 发明名称 多价疫苗 (57) 摘要 本发明总体而言涉及一种免疫原性组合物 ( 例如疫苗 )， 具体而言涉及一种多价免疫原性 组合物， 例如多价 HIV 疫苗， 并且涉及使用它的方 法。本发明还涉及使用遗传算法以创建适于用例 如疫苗接种策略的多价抗原组的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.04.11 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/004664 2009.08.14 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/01

3、9262 EN 2010.02.18 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 27 页 附图 110 页 CN 102177179 A1/1 页 2 1. 一种多肽或蛋白， 其包含至少一条图 21 或图 22 所示的氨基酸的序列。 2. 一种核酸， 其编码权利要求 1 的多肽或蛋白。 3. 一种核酸， 其包含至少一条图 22 所示的核苷酸的序列。 4. 一种载体， 其包含权利要求 2 或 3 的核酸。 5. 权利要求 3 的载体， 其中所述载体为病毒载体。 6. 一种组合物， 其包含至少一种权利要求 1 的多肽或蛋白以及载

4、体。 7. 一种组合物， 其包含至少一种权利要求 2 或 3 的核酸以及载体。 8. 一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法， 包括给所述哺乳动物施用足以产生所述诱 导的量的至少一种权利要求 1 的多肽或蛋白。 9. 一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法， 包括给所述哺乳动物施用足以产生所述诱 导的量的至少一种权利要求 2 或 3 的核酸。 权 利 要 求 书 CN 102177175 A CN 102177179 A1/27 页 3 多价疫苗 0001 本申请是提交于 2008 年 2 月 8 日的美国第 11/990,222 号申请的部分继续申请， 后者是提交于 2006 年 8 月 23 日的

5、第 PCT/US2006/032907 号国际申请的美国国家阶段， 其 指定了美国并且要求了提交于 2005 年 8 月 23 日的美国第 60/710,154 号临时申请和提交 于 2005 年 11 月 25 日的美国第 60/739,413 号临时申请的优先权， 这些申请的全部内容以 参照的方式并入于此。 技术领域 0002 本发明总体而言涉及一种免疫原性组合物 ( 例如疫苗 )， 具体而言涉及一种多价 免疫原性组合物， 例如多价 HIV 疫苗， 并且涉及使用它的方法。本发明还涉及使用遗传算法 以创建适于用例如疫苗接种策略的多价抗原组的方法。 背景技术 0003 设计一种有效的 HIV

6、疫苗是多面性的挑战。该疫苗优选引起免疫应答， 该免疫 应答要么能预防感染， 要么至少也能在发生感染时控制病毒的复制， 尽管对自然感染的免 疫应答已失效， 从而消除病毒 (Nabel， Vaccine 20 ： 1945-1947(2002) 或者免受重复感染 (Altfeld et al， Nature 420 ： 434-439(2002)。需要一种强力疫苗， 其具有优化的载体、 免疫学流程和佐剂 (Nabel， Vaccine 20 ： 1945-1947(2002)， 并结合有能针对多种谱系的 流行病毒来激发交互反应性应答的抗原(Gaschen et al， Science 296 ：

7、2354-2360(2002)， Korber et al， Br.Med.Bull.58 ： 19-42(2001)。 困扰了流感疫苗学家数十年的问题突显了 由 HIV-1 造成的挑战 ： 遭受抗原漂移的人流感病毒株每年在相互之间偏移约 1 2， 而疫 苗抗原通常年复一年地不能引起交互反应性 B 细胞应答， 这就需要对同期的病毒株进行持 续监测， 并每隔几年就要对疫苗进行更新(Korber et al， Br.Med.Bull.58 ： 19-42(2001)。 相比之下， 共流行的个体 HIV-1 病毒株彼此之间的差异在相对保守的蛋白质中达 20或更 多， 而在包膜蛋白中高达35(Gasc

8、hen et al， Science 296 ： 2354-2360(2002)， Korber et al， Br.Med.Bull.58 ： 19-42(2001)。 0004 在地区性 HIV-1 流行病中病毒多样性的不同程度为疫苗设计策略提供了潜在 有用的层次。某些地域再现了全球多样性， 在这些地域中， 大部分的已知 HIV-1 亚型或 进化枝共流行 ( 例如刚果民主共和国 (Mokili & Korber， J.Neurovirol 11(Suppl.1) ： 66-75(2005)， 其余地域主要为两种亚型和它们的重组体 ( 例如乌干达 (Barugahare et al， J.V

9、irol.79 ： 4132-4139(2005)， 剩下的为单一亚型 ( 例如南非 (Williamson et al， AIDS Res.Hum.Retroviruses 19 ： 133-144(2003)。即使是单一亚型流行病占主导地 位的地区， 也必须注意大范围的进化枝内多样性 (Williamson et al， AIDS Res.Hum. Retroviruses 19 ： 133-44(2003)， 但是， 由于可期待国际旅行能进一步使地理性差异模糊 化， 所有的国家都可受益于一种全球性疫苗。 0005 于此提出了多价疫苗抗原集合的设计， 其注重于 T 淋巴细胞应答， 并且为通

10、常的 B 亚型和 C 亚型而优化， 或是为在全球流行的所有 HIV-1 变体 HIV-1 主 (M) 组 而优化。细 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A2/27 页 4 胞毒T淋巴细胞(CTL)直接杀死受感染的产生病毒的宿主细胞， 其利用人白细胞抗原(HLA) 分子通过存在于受感染细胞表面的病毒蛋白片段 ( 抗原表位 ) 来识别它们。辅助性 T 细 胞的应答通过细胞因子的释放来控制免疫应答的各个方面。二者对于 HIV-1 疫苗来说可 能都是至关重要的 ： 早已指出 CTL 应答与减缓疾病进展有关 (Oxenius et al， J.Infect. Dis.1

11、89 ： 1199-208(2004) ； 非人灵长类动物中由疫苗引发的细胞免疫应答有助于控制病 原性 SIV 或 SHIV， 降低免疫激发 (challenge) 后生病的可能性 (Barouch et al， Science 290 ： 486-92(2000) ； 并且 CD8+T 细胞的实验性耗尽导致感染 SIV 的恒河猴体内病毒血症 的增长 (Schmitz et al， Science 283 ： 857-60(1999)。此外， CTL 逃逸突变与疾病进展有 关(Barouch et al， J.Virol.77 ： 7367-75(2003)， 所以阻塞潜在逃逸路径的由疫苗刺激

12、的 记忆应答可能是有价值的。 0006 高可变性包膜蛋白是用于针对 HIV 来中和抗体的首要目标 ； 由于免疫防护有可能 同时要求 B 细胞和 T 细胞应答 (Moore and Burton， Nat.Med.10 ： 769-71(2004)， 同样需 要对包膜疫苗抗原进行单独优化以引起抗体应答。相比之下， 由 T 细胞引导的疫苗成分可 定位于更加保守的蛋白质， 但即使是最保守的 HIV-1 蛋白也是非常多样化的， 这样变异就 成为了一个问题。人工中央序列疫苗法 ( 例如共有序列其中每种氨基酸可见于多条序 列， 或者是祖先序列的最大可能重构物(Gaschen et al， Science

13、296 ： 2354-60(2002)， Gao et al， J.Virol.79 ： 1 154-63(2005)， Doria-Rose et al， J.Virol.79 ： 1 1214-24(2005)， Weaver et al， J.Virol.， 印刷中 ) 是有前景的 ； 尽管如此， 即使是中央化的病毒株也只 能提供 HIV-1 变体的有限覆盖， 而基于共有序列的试剂无法检测出多种自体 T 细胞应答 (Altfeld et al， J.Virol.77 ： 7330-40(2003)。 0007 单个氨基酸的改变会让表位从 T 细胞的监视下逃逸 ； 由于在各种 HIV-1

14、病毒 株之间很多 T 细胞表位在一个或多个位置处不同， 对任意单种疫苗抗原的潜在应答是 有限的。某一特定突变是否导致逃逸取决于特定表位 /T 细胞的组合， 尽管某些改变会 宽泛地影响亚型之间的交互反应性 (Norris et al， AIDS Res.Hum.Retroviruses 20 ： 315-25(2004)。在多价疫苗中包括多个变体能对更广范围的流行变体进行应答， 还能使 免疫系统针对通常的逃逸突变做好准备 (Jones et al， J.Exp.Med.200 ： 1243-56(2004)。 从一个 T 细胞受体中逃逸会创建出易受他者影响的一个变体 (Allen et al，

15、J.Virol.79 ： 12952-60(2005)， Feeney et al， J.Immunol.174 ： 7524-30(2005)， 所以激发针对表位变体 的多克隆应答可能是有益的(Killian et al， Aids 19 ： 887-96(2005)。 抑制操作(Milicic et al， J.Immunol.175 ： 4618-26(2005) 或 HLA 结合 (Ammaranond et al， AIDS Res.Hum. Retroviruses 21 ： 395-7(2005) 的逃逸突变无法由具有不同特异性的 T 细胞来直接对抗， 但是针对重叠区表位的应答可

16、至少阻塞这些逃逸途径的其中一些。 0008 本发明涉及一种多价疫苗， 其包含几个 “镶嵌” 蛋白 ( 或编码这些蛋白的基因 )。 候选疫苗抗原可以是 k 种复合蛋白的混合物 (k 为混合物中序列变体的数目 )， 其经优化以 在一组输入的病毒蛋白中包括最大数目的潜在 T 细胞表位。镶嵌体由天然序列产生 ： 它们 类似于天然蛋白， 并包括潜在表位的最常见形态。由于 CD8+ 表位是毗连的， 并且通常为 9 个氨基酸那么长， 所以镶嵌体组可由天然序列中九聚物 ( 九聚体 ) 的 “覆盖率” 来打分 ( 相 似长度的片段都能良好地得到表示 )。至少三次未被发现的九聚体可被排除。这种策略使 得多样性覆盖

17、率的水平由非常多价的多联肽疫苗实现， 但其具有重要的优势 ： 其使得疫苗 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A3/27 页 5 能像完整的蛋白质或基因那样递送， 排除了与流行病毒株无关的低频率或非天然的表位， 并且其完整的蛋白抗原更加可能像是在自然感染中那样进行处理。 发明内容 0009 总体而言， 本发明涉及一种免疫原性组合物。 更具体而言， 本发明涉及一种多价免 疫原性组合物(例如HIV疫苗)， 并且涉及使用它的方法。 本发明还涉及使用遗传算法以设 计适于作为疫苗使用的多价抗原组的方法。 0010 本发明的目的和优点通过后述的描述将会更加清晰。 附图说明

18、0011 图 1A 图 1F ： HIV-1M 组的潜在表位覆盖率的上限。示出了针对增加变体数目的 九聚体的群体覆盖率的上限， k 1 8 个变体。长度为 9 的移动窗口放在比对序列上， 逐 次下移一个位置。不同颜色表示不同数目序列的结果。在每个窗口中， 针对 Gag( 图 1A 和 图 1B)、 Nef( 图 1C 和图 1D) 和 Env gp120( 图 1E 和图 1F)， 以 k 个最常见的 9 聚物给出的覆 盖率制图。为维持比对而插入的间隙被视作字符。加入更多变体时， 返回结果会明显减少， 这是因为当 k 增大时， 愈加稀有的形式也会增加。在图 1A、 图 1C 和图 1E 中，

19、每条连续九聚 体的得分都按照它们的天然顺序作图， 以示出多样性在不同蛋白区域中是如何变化的 ； Gag 中心的 p24 和 Nef 的中心区域的保守程度都特别高。在图 1B、 图 1D 和图 1F 中， 每条九聚体 的得分都按覆盖率重新排列(图4中同样使用的一种策略)， 以提供对给定蛋白的整个群体 覆盖率的判断。gp120 的覆盖率即使采用 8 种变异九聚体也是特别差的 ( 图 1E 和图 1F)。 0012 图2A图2C ： 镶嵌体的初始化、 打分和优化。 图2A) ： 通过天然序列的随机两点重 组产生一组 k 个群体 (1 6 个具有 50 500 条序列的群体， 每个群体均经过测试 )。

20、从 每一群体中选择一条序列 ( 最初是随机的 ) 用于该镶嵌体混合物， 其随后被优化。通过计 算覆盖率 ( 定义为包括在该混合物中的天然序列九聚体的平均分数， 有输入数据组中的所 有天然序列平均而得到 ) 来对该混合物序列打分。覆盖更多表位的任何新序列都会提高整 个混合物的得分。图 2B) ： 任何个体序列的适合度得分为含有该序列以及来自其他群体的 当前代表的混合物的覆盖率。图 2C) ： 优化 ： 1) 选择两个 “亲代” ： 随机选择的一对重组序列 的较高得分者， 以及要么是 (50可能性 ) 随机的第二对中的较高得分序列， 要么是随机选 择的天然序列。2) 使用两个亲代之间的两点重组以产

21、生 “子代” 序列。如果该子代包含非 天然的或稀有的九聚体， 则立即将其剔除， 相反则对其打分 (Gaschen et al， Science 296 ： 2354-2360(2002)。如果该得分高于四个随机选择的群体成员中任一者的得分， 则将该子 代插入到该群体中， 以取代这四个中的最弱者， 由此进化出改良的群体 ； 4) 如果其得分为 最高得分， 则用该新的子代取代群体中的当前混合物成员。依次对于每一群体重复进行十 次循环的子代生成， 重复进行该过程直至改进停止。 0013 图 3 ： 所有 HIV 蛋白的镶嵌株覆盖率。示出了由每种 HIV 蛋白的四个镶嵌蛋白组 获得的九聚体覆盖率的水平

22、， 其中使用用 M 组或 C 亚型优化的镶嵌体。对 C 亚型进行优化 ( 进化枝内优化 ) 的镶嵌体所覆盖的 C 亚型序列九聚体的部分以灰色示出。由 C 亚型优化 的镶嵌体在非 C 亚型 M 组序列中得到的九聚体覆盖率 ( 进化枝间覆盖率 ) 以白色示出。由 M 组优化的镶嵌体得到的 C 亚型序列的覆盖率以黑色示出。B 进化枝的比较得到了类似结 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A4/27 页 6 果 ( 数据未示出 )。 0014 图 4A 图 4F ： 不同候选疫苗的 M 组序列覆盖率， 每个九聚体逐个进行。每幅图 由单个三价候选疫苗得到的 M 组天然序列

23、比对的逐个位点的覆盖率 ( 即， 对于每一个九聚 体 )。沿 x 轴的竖条代表对于给定比对位置， 与候选疫苗匹配的序列的比例 ： 9/9 匹配 ( 红 色 )， 8/9 匹配 ( 黄色 )， 7/9 匹配 ( 蓝色 )。比对的九聚体沿 x 轴按完全匹配的覆盖率值分 类。656 个位置包括完整的 Gag 以及 Nef 的中心区域。对于每一个比对位置， 最大可能的匹 配值 ( 即， 在该九聚体中没有间隙的比对序列的比例 ) 以灰色示出。图 4A) ： 从在疫苗研究 中使用的病毒株中选出的非最优天然序列(Kong et al， J.Virol.77 ： 12764-72(2003)， 包 括个体进化

24、枝A、 B和C的病毒序列(Gag ： GenBank编号AF004885、 K03455和U52953 ； Nef核 心序列 ： AF069670、 K02083和U52953)。 图4B) ： 通过选择具有最大覆盖率的单条序列而选定 的天然序列 分离序列 US2(B 亚型， USA)， 70177(C 亚型， 印度 ) 和 99TH。R2399(CRF15_01B 亚型， 泰国 ) ； 编号 AY173953、 AF533131 和 _AF530576 的最优组， 随后是在与针对 M 组覆盖 率所选择的第一序列 ( 即， 最佳互补序列 ) 等结合时具有最佳覆盖率的序列。图 4C) ： 共有

25、序列混合物(M组、 B亚型和C亚型)。 图4D) ： 三条镶嵌序列， 图4E) ： 四条镶嵌序列， 图4F) ： 六条镶嵌序列。图 4D 图 4F 均针对 M 组覆盖率进行了优化。 0015 图 5A 和图 5B ： 候选疫苗的总体覆盖率 ： C 进化枝序列中的九聚体的覆盖率， 其使 用针对镶嵌体优化的不同输入数据组， 提供不同数目的抗原， 并与不同的候选疫苗进行比 较。对于如下四种测试情况 ： 进化枝内 ( 对 C 进化枝覆盖率打分的 C 进化枝优化的候选序 列 )、 进化枝之间 ( 对 C 进化枝覆盖率打分的 B 进化枝优化的候选序列 )、 全球性抗单一亚 型(对C进化枝覆盖率打分的M组优

26、化的候选序列)、 全球性抗全球性(对全球性覆盖率打 分的 M 组优化的候选序列 )， 针对 Gag( 图 5A) 和 Nef( 核心序列 )( 图 5B) 的单价和多价候 选疫苗计算完全匹配 ( 蓝色 )、 8/9 匹配 ( 一个不匹配， 红色 ) 和 7/9 匹配 ( 两个不匹配， 黄 色 ) 的覆盖率。在每组结果中， 候选疫苗按照混合物中的序列数目 (1 6) 进行分组 ； 镶嵌 序列用较深颜色绘制。 “非优化序列 (Non-opt)” 指的是一组进入疫苗实验的序列 (Kong et al， J.Virol.77 ： 12764-72(2003) ；“镶嵌体 (mosaic)” 表示由遗传

27、算法产生的序列 ；“优化 的天然序列 (opt.natural)” 表示根据最大九聚体覆盖率而选择的完整天然序列 ；“MBC 共 有序列 (MBC consensus)” 表示 M 组、 B 亚型和 C 亚型的三条共有序列的混合物。为便于比 较， 用虚线标出 M 组镶嵌体的四序列组的覆盖率 (73.7 75.6 )。测试了镶嵌体数目、 病 毒亚群、 蛋白区域以及优化和测试组的超过 150 种组合。在该图中描绘的 C 进化枝 /B 进化 枝 /M 组的比较通常是进化枝内、 进化枝之间以及 M 组覆盖率的代表。具体而言， B 进化枝 和 C 进化枝的镶嵌体覆盖率水平非常接近， 尽管在 Gag 集合

28、中有更多的 C 进化枝序列， 而在 Nef 集合中有更多的 B 进化枝序列 ( 见图 6 的对 B 进化枝和 C 进化枝的完整比较 )。在比对 中A进化枝和G进化枝的序列相对较少(24Gag， 75Nef)， 而M组优化的镶嵌体的九聚体覆盖 率不如 B 进化枝和 C 进化枝的亚型高 (A 亚型和 G 亚型的四镶嵌体覆盖率对于 Gag 为 63， 对于 Nef 为 74 )， 这比非优化的混合物要好得多 ( 对于 Gag 为 52， 对于 Nef 为 52 )。 0016 图 6A 和图 6B ： 候选疫苗的总体覆盖率 ： B 进化枝、 C 进化枝和 M 组序列中的九聚体 的覆盖率， 其使用针对

29、镶嵌体优化的不同输入数据组， 提供不同数目的抗原， 并与不同的候 选疫苗进行比较。对于如下七种测试情况 ： 进化枝内 (B 进化枝或 C 进化枝优化的候选序 列， 对同一进化枝打分 )、 进化枝之间 (B 进化枝或 C 进化枝优化的候选序列， 对另一进化枝 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A5/27 页 7 打分 )、 全球性疫苗抗单一亚型 ( 对 B 进化枝或 C 进化枝打分的 M 组优化的候选序列 )、 全 球性疫苗抗全球性病毒 ( 对所有 M 组序列打分的 M 组优化的候选序列 )， 针对 Gag( 图 6A) 和 Nef( 核心序列 )( 图 6B)

30、 的单价和多价候选疫苗计算完全匹配 ( 蓝色 )、 8/9 匹配 ( 一个 不匹配， 红色 ) 和 7/9 匹配 ( 两个不匹配， 黄色 ) 的覆盖率。在每组结果中， 候选疫苗按照 混合物中的序列数目 (1 6) 进行分组 ； 镶嵌序列用较深颜色绘制。 “非优化序列” 指的是 先前提出用于疫苗的一组特定天然序列 (Kong， W.P.et al.J Virol 77， 12764-72(2003) ； “镶嵌体” 表示由遗传算法产生的序列 ；“优化的天然序列” 表示根据最大九聚体覆盖率而选 择的完整天然序列 ；“MBC 共有序列” 表示 M 组、 B 亚型和 C 亚型的三条共有序列的混合物。

31、对于针对 M 组优化的四价镶嵌体组的完全匹配 M 组覆盖率的水平标以虚线。 0017 图 7A 和图 7B ： 在天然序列、 共有序列和镶嵌序列中九聚体的出现频率的分布。对 于由几种方法制备的疫苗混合物， 不同九聚体的频率为 x 轴， 发生次数为 y 轴。图 7A ： 0 60的频率 ( 九聚体频率 60时， 所有方法的分布是相当的 )。图 7B ： 低频率九聚体的 详细情况。天然序列具有大量的稀有或分离方式独特 (unique-to-isolate) 的九聚体 ( 图 7A 和图 7B 的下右部分 ) ； 它们不大可能引发有用的疫苗应答。选择最优的天然序列确实是 在选择那些更加常见的九聚体，

32、 但仍然会包括稀有和独特的九聚体 ( 图 7A 和图 7B 的上右 部分 )。与之相比， 共有序列混合物不能代表并非常见的九聚体， 特别是频率低于 20 ( 图 7A 和图 7B 的下左部分 )。对于镶嵌序列来说， 较低频率的九聚体的数目随着序列的数目而 单调增加 ( 每幅图的上左部分 )， 但分离方式独特的九聚体完全排除在外 ( 右图的上左部 分 ： * 标示出缺少频率 0.005 的九聚体 )。 0018 图 8A 图 8D ： 候选疫苗的 HLA 结合潜能。图 8A 和图 8B) ： HLA 结合基序计数。图 8C和图8D) ： 不理想的氨基酸的数目。 在所有图中 ： 天然序列标示为黑色

33、圆形()， 共有序 列标示为蓝色三角形 ( )， 推断的祖先序列标示为绿色正方形 ( )， 而镶嵌序列标示为 红色菱形 ( )。左侧的图 ( 图 8A 和 8C) 显示了对于个体序列计算出的 HLA 结合基序计数 (图8A)以及不理想的氨基酸的计数(图8C) ； 右侧的图(图8B和8D)显示了对于序列混合 物计算出的 HLA 结合基序计数 ( 图 8B) 以及不理想的氨基酸的计数 ( 图 8D)。每一幅图的 顶部 ( 箱线图 ) 显示了基于 M 组序列的比对 ( 对于个体序列， 图 8A 和图 8C) 或基于 100 种 随机组成的三序列 (A 亚型、 B 亚型和 C 亚型各一 ) 的混合物

34、( 对于序列混合物， 图 8B 和图 8D) 的各自计数 ( 基序计数或不理想的氨基酸的计数 ) 的分布。该比对下载自 Los Alamos HIV 数据库。箱部从 25 百分点延伸至 75 百分点， 线段位于中值处。延伸到箱部之外的线部 显示了最高值和最低值。作为 C 端锚定残基而非常罕见的氨基酸为 G、 S、 T、 P、 N、 Q、 D、 E 和 H， 并且倾向于很小、 有极性或带负电荷 (Yusim et al， J.Virol.76 ： 8757-8768(2002)。显 示了Gag的结果， 但同样的定性结果也适用于Nef核心序列和完整Nef。 对超型基序进行了 同样的过程， 其结果就

35、定性而言与 HLA 结合基序 ( 数据未示出 ) 的结果类似。 0019 图 9 ： 限制为 4 条序列 (k 4) 的镶嵌蛋白组， 跨过 Gag 以及 Nef 的中心区域， 针 对 B 亚型、 C 亚型和 M 组进行了优化。 0020 图 10 ： Env 和 Pol 的镶嵌体组。 0021 图 11 ： 该图不依赖于比对， 其基于将所有 M 组的蛋白 ( 数据库和 CHAVI， 每人一条 序列 ) 分解为所有可能的九聚体， 其关注它们的频率， 然后寻找每一疫苗抗原或混合物与 数据库的匹配和接近匹配的情况。 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A6/27 页

36、8 0022 图 12 ： 另外的覆盖率概览。 0023 图 13 ： 九聚体覆盖率相对于位置的图 (Mos.3 疫苗混合物 )。 0024 图 14A 图 14D ： 与提议使用的每种疫苗匹配的九聚体频率的图。 0025 图 15A 图 15D ： 标示出全部数据库比对中的每条序列中每一氨基酸的图。 0026 图 16 ： 3 个镶嵌体， M 组优化。 0027 图 17 ： HIV 数据库连同 CHAVI 序列 (N 2020) 的覆盖率。 0028 图 18 ： 急性感染患者的序列与患者共有序列相比的差异。 0029 图 19 ： 在 Env M 组覆盖率对亚型特异性设计方面的折中和益处

37、。 0030 图 20 ： 所提议的 Gag 和 Env 的疫苗镶嵌体的覆盖率。 0031 图 21 ： Gag、 Nef 和 Env 序列。 0032 图 22 ： 镶嵌体的 gag 和 nef 基因， 以及 M 共有序列的 gag 和 nef 基因。 具体实施方式 0033 本发明源自于以下认识， 即含有合成病毒蛋白的多价抗原组能构成良好的候选疫 苗， 所述合成病毒蛋白的序列提供了对流行病毒序列的非稀有短链的最大覆盖率。本发明 提供了 “遗传算法” 策略以建立作为天然蛋白序列的不确定组的片段的镶嵌体混合物的多 价抗原组， 所述天然蛋白序列作为输入序列而提供。对于 HIV 的情形， 蛋白 G

38、ag 和 Nef 是这 种抗原的理想候选序列。为扩大覆盖率， 还可使用 Pol 和 / 或 Env。本发明还提供了这些蛋 白的优化组。 0034 本发明的遗传算法策略利用来自普通群体的未经比对的蛋白序列作为输入数据 组， 从而具有 “不依赖比对” 的优点。其建立了类似于自然界所发现的蛋白的人造镶嵌蛋 白， 在小型动物模型中共有抗原的成功证明了这是有效的。 九聚体是此处描述的研究重点， 但根据预期的目标， 也可选择不同长度的肽。 根据本发明的方法， 可以将在自然界中不存在 或者非常稀有的九聚体(举例)排除在外， 相对于共有序列和天然病毒株而言， 这是一种进 步， 因为共有序列可包含在自然界中未发

39、现的某些九聚体 ( 举例 )， 而天然病毒株几乎总是 含有对于该病毒株而言是独一无二的某些九聚体 ( 举例 )。用于所述遗传算法的适合度的 定义为 ： 最 “适合” 的多价混合物是镶嵌病毒株的组合， 该组合能提供群体中所有九聚体的 最大覆盖率 ( 完全匹配的最高分数 )， 并且还受九聚体在所述群体中不缺失或者不稀有的 限制。 0035 本发明的镶嵌蛋白组能根据不同的输入数据组进行优化， 使得可采用目前的数据 从 T 细胞的角度评估亚型或者区域特异性疫苗的优点。举例来说， 经过比较的可选方案包 括 ： 0036 1) 基于 M 组、 B 进化枝和 C 进化枝的最优多价镶嵌体组。所存在的疑问是，

40、进化枝 内覆盖率与进化枝之间覆盖率或者全球性覆盖率相比能好多少。 0037 2) 不同数目的抗原 ： 1、 3、 4、 6。 0038 3) 目前用于疫苗程序的天然病毒株仅例示了 “典型” 病毒株 (Merck， VRC)。 0039 4) 经选择能在群体中获得九聚体最佳覆盖率的天然病毒株。 0040 5) 共有序列组 ： A+B+C。 0041 6) 经优化的混合物， 其包括多价抗原中的一个 “指定” 病毒株， 一个祖先序列 +3 个 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A7/27 页 9 镶嵌病毒株， 一条共有序列 +3 个镶嵌病毒株。 0042 7)完全匹

41、配的九聚体覆盖率与匹配度为8/9、 7/9和6/9或更少的九聚体覆盖率比 较。 0043 这是一个计算难题， 因为覆盖一个九聚体的最佳组不一定是覆盖重叠型九聚体的 最佳组。 0044 通过阅读本公开内容应当理解， 描述于此的方法能用于设计肽试剂以测试 HIV 免 疫应答， 还可用于其他易变病原体。例如， 本方法可适用于高度可变的丙型肝炎。 0045 采用本领域公知的技术， 可将本发明的蛋白 / 多肽 / 肽 (“免疫原” ) 与药用载体 和/或佐剂配制成组合物。 适宜的施药途径包括全身(例如肌肉内或皮下)、 口服、 阴道内、 直肠内和鼻内施药。 0046 本发明的免疫原能采用本领域技术人员公知

42、的方法进行化学合成并纯化。 该免疫 原也可通过公知的重组 DNA 技术合成。 0047 编码本发明免疫原的核酸可用作例如 DNA 疫苗的组分， 在该疫苗中该编码序列以 裸露 DNA 方式施用， 或者， 例如编码该免疫原的小基因可存在于病毒载体中。该编码序列例 如可在分枝杆菌、 重组的嵌合型腺病毒或重组的减毒型水泡性口炎病毒中表达。该编码序 列还可存在于例如复制型或者非复制型腺病毒载体、 腺相关病毒载体、 减毒型结核分枝杆 菌载体、 卡介苗(BCG)载体、 牛痘载体或修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体、 其他痘病毒载体、 重 组脊髓灰质炎病毒载体和其他肠病毒载体、 沙门氏菌载体、 志贺氏菌载体、 委

43、内瑞拉马脑炎 病毒 (VEE) 载体、 塞姆利基森林病毒载体或烟草花叶病毒载体。该编码序列也可作为具有 例如活性启动子如CMV启动子的DNA质粒来表达。 还可用其他活载体来表达本发明的序列。 通过将编码本发明免疫原的核酸导入患者自身细胞中， 可以在这些细胞中诱导该免疫原的 表达， 所述表达优选使用在人类细胞中优化表达的密码子和启动子。制造和使用 DNA 疫苗 的方法的例子公开于美国第 5,580,859 号、 第 5,589,466 号和第 5,703,055 号专利。密码 子优化的方法的例子描述于 Haas et al， Current Biology 6 ： 315-324(1996) 和

44、 Andre et al， J.Virol.72(2) ： 1497-1503(1998)。 0048 应当理解， 在本发明的组合物中可包含佐剂 ( 或者另行施用以增强免疫原效果 )。 合适的佐剂的例子包括 TRL-9 激动剂、 TRL-4 激动剂、 以及 TRL-7、 8 和 9 激动剂的组合 ( 以 及明矾 )。佐剂可采用油和水乳液的形式。也可使用角鲨烯佐剂。 0049 本发明的组合物在药用输送体系中含有免疫有效量的本发明免疫原， 或编码该免 疫原的核酸序列。该组合物可用于预防和 / 或治疗病毒感染 ( 例如 HIV 感染 )。如上所述， 可使用佐剂、 乳化剂、 药用载体或其他在疫苗组合物

45、中常提供的组分来配制本发明的组合 物。本领域技术人员可容易地设计最优化的制剂， 该制剂可包括用于立即释放的制剂和 / 或用于缓释的制剂， 以及用于诱导全身免疫和 / 或诱导局部粘膜免疫的制剂 ( 例如该制剂 可设计为鼻内、 阴道内或直肠内施用)。 如上所述， 本发明的组合物可通过任何便捷的途径， 包括皮下、 鼻内、 口服、 肌肉内或其他肠胃外或肠道途径施用。该免疫原可以单剂量或多剂 量施用。最优免疫方案可容易地由本领域技术人员确定并根据患者、 组合物以及所寻求的 效果不同而改变。 0050 本发明设想了直接使用本发明免疫原和/或编码它的核酸和/或如上所述进行表 达的免疫原。例如， 编码该免疫原

46、的小基因可用于初免和 / 或加强免疫。 说 明 书 CN 102177175 A CN 102177179 A8/27 页 10 0051 本发明包括公开于此的任何和所有的氨基酸序列， 以及编码该氨基酸序列的核酸 序列 ( 以及与该编码序列互补的核酸 )。 0052 具体公开于此的是针对以区域性流行病为目标的单一 B 亚型或 C 亚型以及全球 流行的所有 HIV-1 变体 所述 HIV-1 主 (M) 组 进行优化的疫苗抗原组。在随后的实 施例 1 中描述的研究中， 重点在于设计特别针对 T 细胞应答的多价疫苗。对于 HIV-1 特 异性疫苗应答而言， HIV-1 特异性 T 细胞似乎至关重要

47、 ： CTL 应答与人类疾病进程的减缓 相关 (Oxenius et al， J.Infect.Dis.189 ： 1199-1208(2004)， 并且 CTL 应答在非人灵 长类动物疫苗接种模型中的重要性也已非常明确。疫苗引发的细胞免疫应答有助于控 制致病性 SIV 或 SHIV， 并降低用致病性病毒免疫激发后发病的可能性 (Barouch et al， Science 290 ： 486-492(2000)。CD8+T 细胞的暂时缺失导致感染 SIV 的恒河猴体内病毒 血症的增加 (Schmitz et al， Science 283 ： 857-860(1999)。此外， 逃逸突变的进

48、化与 疾病进程相关， 表明 CTL 应答有助于抑制体内病毒的复制 (Barouch et al， J.Virol.77 ： 7367-7375(2003)， 因此能阻断潜在逃逸途径的由疫苗激发的记忆应答可能具有价值。虽 然高度可变的包膜 (Env) 是抗 HIV 中和抗体的首要标靶， 并且疫苗抗原也需要定制成引发 这些抗体应答 (Moore & Burton， Nat.Med.10 ： 769-771(2004)， 但是 T 细胞疫苗组分能靶 向更保守的蛋白以触发更容易交叉反应的应答。但是， 即使是最保守的 HIV-1 蛋白也具有 足够的多样性， 因此变异将是个问题。 人造中心序列疫苗法、 共

49、有序列和祖先序列(Gaschen et al， Science 296 ： 2354-2360(2002)， Gao et al， J.Virol.79 ： 1154-1163(2005)， Doria-Rose et al， J.Virol.79 ： 11214-11224(2005)它们基本上在病毒株之间 “折 中”显示出前景， 其刺激出与天然病毒株疫苗相比具有更强的交叉反应性的应答 (Gao et al， J.Virol.79 ： 1154-1163(2005)(Liao et al.and Weaver et al.， 已交稿 )。然而， 即使是中心病毒株也只能覆盖范围非常有限的 HIV 多样性谱， 而基于共有序列的肽试剂也 不能检测许多自体 CD8+T 细胞应答 (Altfeld et al， J.Virol.77 ： 7330-7340(2003)。 0053 单一氨基酸取代能介导 T 细胞逃逸， 并且由于 HIV-1 病毒株之间许多 T 细胞表位 有一个或多个氨基酸差异， 因此对任何一种疫苗抗原的应答的潜在有效性是有限的。特定 的突变是否减小 T 细胞交叉反应性是表位特异性的并且是 T 细胞特异性的， 尽管某些变化 能广泛地影响进化