一株松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC3及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710193772.5 (22)申请日 2017.03.28 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M 2016775 2016.12.21 (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市龙蟠路159号 (72)发明人 谈家金李亮亮陈凤毛朱明龙 (74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务 所(普通合伙) 32274 代理人 邱兴天 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01N 63/0

2、0(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一株松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一株松树内生细菌， 分类命名 为短小芽孢杆菌 （Bacilluspumilus） LYMC-3， 已 保藏与中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCCNO： M2016775， 保藏日期： 2016年12月21 日， 保藏地址为中国武汉武汉大学。 本发明的松 树内生短小芽孢杆菌LYMC-3， 为松树内生细菌， 其无菌发酵滤液具有很强的杀线作用， 无菌发酵 滤液的原液及稀释2倍、 4倍、 10倍液

3、处理松材线 虫24h后， 其死亡率达到100%， 且死亡的虫体全部 消解。 经无菌发酵滤液处理过的虫卵均未孵化， 且虫卵的卵壳受到了破坏， 可见该短小芽孢杆菌 LYMC-3在杀线方面讲具有很好的应用前景， 具有 很好生防作用。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 106754586 A 2017.05.31 CN 106754586 A 1.一株松树内生细菌， 分类命名为短小芽孢杆菌 （Bacillus pumilus） LYMC-3， 已保藏 与中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCC NO： M 2016775， 保藏日期： 2016年12月21 日， 保藏地

4、址为中国武汉武汉大学。 2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌LYMC-3在杀松材线虫中的应用。 3.权利要求1所述的短小芽孢杆菌LYMC-3在杀松材线虫卵中的应用。 4.一种制备权利要求1所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的无菌发酵滤液的方法， 其特征在 于： 将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液体 培养基50mL的三角瓶中， 于28和无光照条件下以200r/min转速摇培； 将摇培4d后的细菌 培养液用滤膜孔径为0.22 m的细菌过滤器将菌体过滤后， 所得的滤液为无菌发酵滤液。 5.权利要求4所述的制备短小芽孢杆菌LYMC-3的无菌发酵滤液的方法所获得的无菌

5、发 酵滤液。 6.权利要求5所述的无菌发酵滤液在杀松材线虫中的应用。 7.权利要求5所述的无菌发酵滤液在杀松材线虫卵中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106754586 A 2 一株松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一株松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3及 其应用。 背景技术 0002 松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)寄生在松属树种体内 取食营养而导致树木迅速死亡的一种特大毁灭性病害， 属国际重要检疫对象(杨宝君等， 2003)， 列为森林病虫害之首， 被称为 “无烟

6、的森林火灾” 。 该线虫主要分布在美国、 加拿大、 墨西哥、 日本、 韩国、 希腊、 中国和葡萄牙等多个国家。 我国自1982年在南京发现以来， 现已 扩散到江苏、 浙江、 安徽、 福建、 江西、 山东、 河南、 湖北、 湖南、 广东、 广西、 重庆、 四川、 贵州、 陕西、 香港和台湾等地， 对我国造成林业经济、 森林生态上的巨大损失和自然景观的严重破 坏， 并对广大适生区的松林构成严重威胁。 在我国， 松材线虫的主要传播媒介是松墨天牛 (Monochamus alternatus)。 目前生产上对该病的防治主要靠加强检疫和清理林间病死树， 辅以对松墨天牛的化学防治和生物防治， 而针对病原松

7、材线虫的防治， 尤其是松材线虫的 生物防治研究的较少。 0003 目前针对松材线虫的生防研究主要集中在杀线植物、 真菌和放线菌等几类因子 上， 而有关细菌用作松材线虫生防因子的报道较少， 植物内生细菌对松材线虫的生防研究 更是极少。 利用内生细菌防治植物病害一直是国内外的研究热点。 以前绝大多数植物病害 生防菌是从土壤或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的。 但由于这些土壤微生物易受外 界条件的影响， 并难于在与土壤、 植物根际或叶围习居微生物的竞争中长期占优势， 因而极 大地影响了其实用价值(李长松， 1992)。 而植物内生细菌作为生防因子有很多优点： 它们分 布于植物的不同组织中， 有充足

8、的营养物质， 同时受到植物组织的保护， 不受外部恶劣环境 如强烈日光、 紫外线风雨等的影响， 具有稳定的生态环境(易有金等， 2007)。 因此， 内生细菌 相对于其它细菌更易发挥生防作用。 利用内生细菌防治植物真菌和细菌病害的研究很多， 而在防治线虫病害方面研究的很少。 发明内容 0004 发明目的： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一株松树内生短小 芽孢杆菌， 满足使用需求。 本发明的另一目的是提供一株松树内生短小芽孢杆菌的应用。 0005 技术方案： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案为： 0006 一株松树内生细菌， 分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus p

9、umilus)LYMC-3， 已保 藏与中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCC NO： M 2016775， 保藏日期： 2016年12月 21日， 保藏地址为中国武汉武汉大学。 0007 所述的短小芽孢杆菌LYMC-3在杀松材线虫中的应用。 0008 所述的短小芽孢杆菌LYMC-3在杀松材线虫卵中的应用。 0009 一种制备所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的无菌发酵滤液的方法： 将保存于牛肉膏蛋 说明书 1/4 页 3 CN 106754586 A 3 白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶 中， 于28和无光照条件下以200r/mi

10、n转速摇培； 将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔径为 0.22 m的细菌过滤器将菌体过滤后， 所得的滤液为无菌发酵滤液。 0010 所述的制备短小芽孢杆菌LYMC-3的无菌发酵滤液的方法所获得的无菌发酵滤液。 0011 所述的无菌发酵滤液在杀松材线虫中的应用。 0012 所述的无菌发酵滤液在杀松材线虫卵中的应用。 0013 本发明人从南京中山陵、 上海辰山植物园、 洛阳隋唐植物园的黑松、 马尾松、 湿地 松和火炬松茎部共分离到植物内生细菌137株， 对137株细菌进行杀线活性的测定。 从中筛 选出一株无菌发酵滤液对松材线虫及其虫卵有强烈毒杀作用的细菌LYMC-3。 0014 LYMC-3的鉴定：

11、 菌株LYMC-3在NA固体培养基上培养48h， 菌落呈白色蜡状， 边缘不 整齐， 干燥， 有皱褶， 菌落大小中等。 细胞呈杆状， 革兰氏染色阳性， 大小为(0.80.9) m (1.53.0) m， 芽孢卵圆形， 中生， 周生鞭毛， 具运动性。 革兰氏染色阳性， 氧化酶反应阴性， 接触酶反应阳性， 明胶水解阳性， 淀粉水解阳性， 甲基红试验阴性， V-P反应阳性， 硝酸盐还 原反应阴性， 吲哚试验阴性。 在Biolog鉴定培养1624h后， 测得LYMC-3为Bacillus pumilus， SIM值为0.624。 16S rDNA序列分析， 测序所得菌株LYMC-3的序列长度为1400b

12、p (SEQ ID NO.1所示)。 将LYMC-3的16SrDNA序列与GenBank中的序列进行BLAST比对， 与LYMC- 3菌株相似性最高的是Bacillus pumilus， 同源性达到99。 将比对获得的同源序列和测定 序列运用ClustalX软件进行多重序列的同源性分析， 然后利用MEGA6.05软件构建系统进化 树。 由构建的系统进化树可以看出， LYMC-3与Bacillus pumilus同属一个遗传分枝。 最终确 定菌株LYMC-3为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)， 命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3。 0015 有益效

13、果： 与现有技术相比， 本发明的松树内生短小芽孢杆菌LYMC-3， 为松树内生 细菌， 其无菌发酵滤液具有很强的杀线作用， 无菌发酵滤液的原液及稀释2倍、 4倍、 10倍液 处理松材线虫24h后， 其死亡率达到100， 且死亡的虫体全部消解。 经无菌发酵滤液处理过 的虫卵均未孵化， 且虫卵的卵壳受到了破坏， 可见该短小芽孢杆菌LYMC-3在杀线方面讲具 有很好的应用前景， 具有很好生防作用。 附图说明 0016 图1是LYMC-3无菌发酵滤液对松材线虫的毒杀作用(虫体消解)结果图； 0017 图2是LYMC-3无菌发酵滤液对虫卵的影响(卵壳破坏)结果图。 具体实施方式 0018 下面结合具体实

14、施例对本发明做进一步的说明。 0019 实施例1短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液的制备 0020 将保存于牛肉膏蛋白胨(每1000mL蒸馏水含蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 氯化钠5g， pH 7.27.4)固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三 角瓶中， 于28和无光照条件下以200r/min转速摇培。 将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔 径为0.22 m的细菌过滤器将菌体过滤后， 所得的滤液为试验中的无菌发酵滤液。 0021 实施例2短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液杀线活性的测定 说明书 2/4 页 4 CN 106754586 A 4 0022

15、 供试线虫的培养和线虫悬浮液的制备： 供试松材线虫由南京林业大学江苏省有害 生物入侵预防与控制重点实验室提供， 分离于江苏省连云港地区发病的黑松上。 松材线虫 采用灰葡萄孢(Botrytis cinerca)培养， 将线虫接种在长满灰葡萄孢的PDA平板上， 放置于 25培养箱培养至灰葡萄孢菌丝消失， 线虫长满平板。 采用贝尔曼漏斗法分离收集线虫,然 后离心消毒浓缩配制成约20条/ L的线虫悬液。 0023 杀线活性测定： 将制备的短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液(实施例1制备)分别 稀释2倍、 4倍和10倍， 取1mL不同稀释倍数的无菌发酵滤液注入1.5mL离心管中， 再注入50 L 线虫

16、悬液约1000条线虫， 混合。 分别于处理12h和24h后吸取混合液50 L约50条线虫在体视 显微镜下观察线虫死亡情况以及虫体的消解情况。 每处理重复三次， 以不接菌的NA液体培 养基和清水为对照。 线虫死亡标准是虫体僵直， 用解剖针搅动或接触刺激时仍不活动。 0024 表1短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液对松材线虫的杀伤效果 0025 0026 结果(表1)表明： 松材线虫经短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液原液及稀释2倍、 4 倍、 10倍液处理24h后， 其死亡率达到100， 且死亡的虫体全部消解(图1)。 说明LYMC-3无菌 发酵滤液具有极强的杀线活性。 0027 实施例3短

17、小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液对松材线虫卵的影响 0028 采用贝尔曼漏斗法收集松材线虫， 挑取一定数量的雌、 雄成虫于小培养皿中， 加适 量清水， 放置于25恒温培养箱中培养。 待线虫产出大量卵时， 并用清水反复冲洗培养皿， 因为虫卵可以黏附在培养皿底面， 在冲洗冲洗线虫时仍可保留在培养皿底部。 在显微镜下 观察， 确保培养皿中无线虫存在后， 取2mL无菌发酵滤液(实施例1制备)原液注入到小培养 皿中， 放置于25恒温培养箱中保湿培养。 以清水处理为对照， 每个处理3个重复。 分别在处 理24h、 48h、 72h、 96h， 在显微镜下观察虫卵的孵化情况， 统计孵化率。 0029 表2

18、短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液对松材线虫卵孵化率的影响 0030 说明书 3/4 页 5 CN 106754586 A 5 0031 0032 结果(表2)表明： 经短小芽孢杆菌LYMC-3无菌发酵滤液处理过的虫卵均未孵化， 在 高倍显微镜下还观察到虫卵的卵壳受到了破坏(图2)。 而对照清水处理的虫卵在96h后的孵 化率为87。 说明无菌发酵滤液可以抑制虫卵的正常孵化过程。 说明书 4/4 页 6 CN 106754586 A 6 SEQUENCE LISTING 南京林业大学 一株松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3及其应用 100 1 PatentIn version 3.3 1 1

19、400 DNA Bacillus pumilus 1 tgctatacat gcaagtcgag cggacagaag ggagcttgct cccggatgtt agcggcggac 60 gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggagc 120 taataccgga tagttccttg aaccgcatgg ttcaaggatg aaagacggtt tcggctgtca 180 cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcga

20、c 240 gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300 cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360 cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcg 420 agagtaactg ctcgcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480 gcagccgcgg taa

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23、 ggtgcatggt 1020 tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080 cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140 ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200 ggacagaaca aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat ctgttctcag 1260 ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320 gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380 ttgcaacacc cgaagtcggt 1400 序列表 1/1 页 7 CN 106754586 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 106754586 A 8