拟南芥三烯甲素及其制备方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710178601.5 (22)申请日 2017.03.23 (71)申请人 中国科学院上海生命科学研究院 地址 200031 上海市徐汇区上海市岳阳路 319号 申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 (72)发明人 王勇王国栋刘海利邵洁 陈庆文 (74)专利代理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 韦东 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 15/00(2006.01) A6

2、1K 31/015(2006.01) A61K 31/336(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61P 1/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 拟南芥三烯甲素及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及拟南芥三烯甲素及其制备方法。 具体而言， 本发明提供一种重组表达载体， 所述 重组表达载体表达拟南芥的GFPP合成酶和二倍 半萜合成酶。 本发明还提供表达拟南芥GFPP合成 酶和二倍半萜合成酶并优选地还表达甲羟戊酸

3、途径所有关键功能蛋白的重组大肠杆菌。 本发明 的重组大肠杆菌可合成下式所示的拟南芥三烯 甲素。 权利要求书2页 说明书13页 序列表6页 附图1页 CN 108624610 A 2018.10.09 CN 108624610 A 1.一种重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体表达拟南芥的GFPP合成酶和二 倍半萜合成酶； 优选地， 所述重组表达载体以pET-28b为骨架载体， 插入了拟南芥GFPP合成酶的编码序 列和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列。 2.如权利要求1所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体含有拟南芥GFPP 合成酶的编码序列和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列；

4、 优选地， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列如SEQ ID NO:1所示； 所述拟南芥二倍半萜 合成酶的编码序列如SEQ ID NO:3所示。 3.如权利要求1或2所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列不含有GFPP合成酶N端信号肽的编码序列； 所述拟 南芥二倍半萜合成酶的编码序列不含有二倍半萜合成酶N端信号肽的编码序列； 优选地， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列如SEQ ID NO:2所示； 所述拟南芥二倍半萜 合成酶的编码序列如SEQ ID NO:4所示。 4.一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌表达拟南芥GFPP合成酶和二倍 半萜合成酶

5、； 优选地， 所述重组大肠杆菌还表达甲羟戊酸途径所有关键功能蛋白。 5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌含有拟南芥GFPP 合成酶的编码序列和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列； 优选地， 所述重组大肠杆菌含有 甲羟戊酸途径所有关键功能蛋白的编码序列， 以使该重组大肠杆菌能由乙酰辅酶A合成甲 羟戊酸， 并由甲羟戊酸合成异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸； 优选地， 所述重组大肠杆菌携带权利要求13中任一项所述的重组表达载体， 和表达 MVA途径所有关键功能蛋白的质粒。 6.一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌合成下式所示的化合物： 优选地， 所述重组大

6、肠杆菌如权利要甲求4或5所述。 7.下式I或II所示的化合物、 其药物组合物及其在制备抗肿瘤、 抗炎药、 抗血小板凝集 药、 抗病原微生物的药物以及治疗和/预防拒食的药物中的应用： 权利要求书 1/2 页 2 CN 108624610 A 2 式I中， C7、 C11和C15中任意一个或多个位置上的甲基可被替换成羧基或COOR基团， 其 中， R选自C1-C6烷基； 和/或， C10和C11间的双键、 C6和C7间的双键以及C3和C20间的双键可 任选地被氧化或还原， 从而形成在C3、 C6、 C7、 C10、 C11和C20中的任意一个或多个位置上被 取代， 和/或在C10和C11、 C6和

7、C7和/或C3和C20间形成环氧环的化合物； 式II中， C7、 C11和C15中任意一个或多个位置上的甲基可被替换成羧基或COOR基团， 其 中， R选自C1-C6烷基； 和/或， C3和C20间的双键可任选地被氧化或还原， 从而形成在C3和C20 中的任意一个或全部两个位置上被取代的化合物， 或在C3和C20间形成环氧环的化合物。 8.一种制备下式所示的拟南芥三烯甲素的方法： 其特征在于， 所述方法包括发酵权利要求46中任一项所述重组大肠杆菌的步骤； 优选地， 所述方法还包括： 分离： 将所得发酵液离心， 获得上清液和菌体； 分别萃取上清液和破壁后的菌体， 合并 萃取液， 减压浓缩得浸膏；

8、 和 纯化： 将所述浸膏进行硅胶柱层析， 以正己烷洗脱， 后经反相柱层析， 以甲醇洗脱， 从而 获得所述拟南芥三烯甲素。 9.一种制备下式所示的拟南芥三烯甲素的方法： 其特征在于， 所述方法包括： 构建大肠杆菌工程菌： 将携带拟南芥二半萜途径的两个关键功能基因GFPPS和TPS18的 质粒及携带甲羟戊酸途径所有关键功能基因的质粒共转于大肠杆菌中， 获得大肠杆菌工程 菌； 发酵： 发酵所述大肠杆菌工程菌， 获得发酵液； 分离： 离心发酵液， 获得上清液和菌体； 分别萃取上清液和破壁后的菌体， 合并萃取液， 减压浓缩得浸膏； 和 纯化： 将所述浸膏进行硅胶柱层析， 以正己烷洗脱， 后经反相柱层析，

9、 以甲醇洗脱， 从而 获得所述拟南芥三烯甲素。 10.如权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 在TB培养基中在1020培养发酵所述重组大肠杆菌； 使用乙酸乙酯进行萃取； 和 反相柱层析的填料为ODS-A-HG。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108624610 A 3 拟南芥三烯甲素及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及拟南芥三烯甲素及其制备方法。 背景技术 0002 萜类化合物是以异戊二烯为前体物质经缩合、 环化、 氧化及结构修饰而形成的一 类广泛存在于动植物体内的天然产物。 尽管萜类化合物的结构和功能多种多样， 但它们都 是由最基本的五碳单位异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体

10、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP) 合成。 作为萜类化合物生物合成的中心前体， 在植物中由甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓 醇-4-磷酸(MEP)途径合成。 在异戊烯基转移酶催化作用下， 形成具有五碳倍数的萜类骨架 碳链的焦磷酸酯， 然后经萜类合酶(TPS)环化作用、 修饰酶的结构修饰， 形成数目众多的萜 类化合物。 实际上， 萜类化合物的多样性主要在于萜类合酶独特的催化机制， 在该酶的作用 下， 线性的聚异戊二烯可以一步(或几步)合成含多环和多个手性中心的萜类化合物。 0003 二倍半萜类化合物是由五个异戊二烯单元衍生而来的， 主要分布于海洋生物、 陆 生真菌、 地衣、 植物等中， 并具有抗炎

11、、 拒食、 抗血小板凝集、 抗病原微生物等多方面生物活 性。 迄今， 已经有100多个不同结构的二半萜化合物从植物中分离鉴定， 但人们对二半萜化 合物在植物中的分布、 可能的功效应用， 特别是生物合成途径组成(酶和对应编码基因)还 知之甚少。 发明内容 0004 本文首次利用代谢工程菌株体系， 将来源于植物拟南芥(A.thaliana)的二倍半萜 途径的两个关键功能基因GFPPS和TPS18重组在大肠杆菌中， 从中发现了其功能性代谢产物 二倍半萜类化合物拟南芥三烯甲素(thalianatriene)。 0005 因此， 本发明第一方面提供一种重组表达载体， 所述重组表达载体表达拟南芥的 GFP

12、P合成酶和二倍半萜合成酶。 0006 在一个或多个实施方案中， 所述重组表达载体含有拟南芥GFPP合成酶的编码序列 和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列。 0007 在一个或多个实施方案中， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列如At3g14550所示。 0008 在一个或多个实施方案中， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列如SEQ ID NO:2所 示。 0009 在一个或多个实施方案中， 所述拟南芥GFPP合成酶的编码序列不含有GFPP合成酶 N端信号肽的编码序列。 0010 在一个或多个实施方案中， 所述拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列如At3g14520 所示。 0011 在一个或多个实施方案

13、中， 所述拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列不含有二倍半 萜合成酶N端信号肽的编码序列。 0012 在一个或多个实施方案中， 所述拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列如SEQ ID NO: 说明书 1/13 页 4 CN 108624610 A 4 4所示。 0013 在一个或多个实施方案中， 所述重组表达载体含有SEQ ID NO:2和/或4所示的核 苷酸序列。 0014 在一个或多个实施方案中， 所述重组表达载体以pET-28b为骨架载体， 插入了拟南 芥GFPP合成酶的编码序列和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列。 0015 本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌， 所述重组大肠杆菌表达拟南芥GFPP合成

14、 酶和二倍半萜合成酶。 0016 在一个或多个实施方案中， 所述重组大肠杆菌含有拟南芥GFPP合成酶的编码序列 和拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列。 0017 在一个或多个实施方案中， 所述重组大肠杆菌携带本文第一方面所述的重组表达 载体。 0018 在一个或多个实施方案中， 所述重组大肠杆菌还含有拟南芥MVA途径所有关键功 能基因， 以使其能由乙酰辅酶A(Acyl-CoA)合成甲羟戊酸， 并由甲羟戊酸合成IPP和DMAPP。 0019 在一个或多个实施方案中， 所述重组大肠杆菌携带表达MVA途径所有关键功能基 因的质粒。 0020 在一个或多个实施方案中， 所述重组大肠杆菌合成下式所示的化合物

15、： 0021 0022 本发明第三方面提供下式所示的化合甲物： 0023 0024 本发明第四方面提供一种制备下式所示的拟南芥三烯甲素的方法： 0025 0026 所述方法包括发酵本发明第二方面所述重组大肠杆菌的步骤。 0027 在一个或多个实施方案中， 在TB培养基中低温(如1020)培养发酵所述重组大 肠杆菌。 0028 在一个或多个实施方案中， 获得发酵液后， 离心发酵液， 获得上清液和菌体； 分别 说明书 2/13 页 5 CN 108624610 A 5 萃取上清液和破壁后的菌体， 合并萃取液， 减压浓缩得浸膏。 0029 在一个或多个实施方案中， 将浸膏进行硅胶柱层析， 以正己烷洗

16、脱， 后经反相柱层 析， 以甲醇洗脱， 获得拟南芥三烯甲素。 0030 在一个或多个实施方案中， 使用乙酸乙酯进行萃取。 0031 在一个或多个实施方案中， 反相柱层析的填料为ODS-A-HG。 附图说明 0032 图1： pJS-GFPPS2-TPS18质粒图谱。 具体实施方式 0033 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而形成本发明其它技术方案。 0034 本发明首次利用代谢工程菌株体系， 将拟南芥中二倍半萜途径的两个关键基因 GFPPS和TPS18功能重组到大肠杆菌中， 进一步分离和纯化获得新颖骨架二半

17、萜化合物 拟南芥三烯甲素(thalianatriene)。 本文中， GFPPS是生成二半萜化合物前体物质GFPP (C25； Geranylfarnesyl diphosphate)的GFPP合酶(GFPPS， GFPP synthase)。 TPS18是拟南 芥二倍半萜合成酶。 0035 本文中， 拟南芥编码GFPP合成酶的AtGFPPS2基因序列可如At3g14550所示， 或如 SEQ ID NO:1所示； 拟南芥编码二倍半萜合成酶的AtTPS18基因序列可如At3g14520所示， 或 如SEQ ID NO:3所示。 应理解的是， GFPP合成酶和二倍半萜合成酶的酶活不变、 优选是酶

18、活 提高的变异体及其编码序列也可用于实施本发明。 0036 通常， 为了构建可溶性蛋白， 可切掉GFPP合成酶和二倍半萜合成酶的信号肽序列。 已知GFPP合成酶的信号肽序列为其N端第139个氨基酸残基， 二倍半萜合成酶的信号肽序 列为其N端第151个氨基酸残基。 因此， 本发明拟南芥GFPP合成酶的编码序列通常不包括 GFPP合成酶信号肽序列的编码序列， 例如， 所述编码序列如SEQ ID NO:1第1181083所示； 拟南芥二倍半萜合成酶的编码序列通常也不包括二倍半萜合成酶信号肽序列的编码序列， 例如， 所述编码序列如SEQ ID NO:3第1541818所示。 除此之外， 在除去信号肽编

19、码序列之 后， 还可在拟南芥GFPP合成酶编码序列以及拟南芥二倍半萜合成酶编码序列的5 端添加起 始密码子， 如ATG等。 在某些实施方案中， 拟南芥GFPP合成酶编码序列如SEQ ID NO:2所示； 拟南芥二倍半萜合成酶编码序列如SEQ ID NO:4所示。 0037 可采用本领域周知的PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得拟南芥GFPP合成 酶编码序列和拟南芥二倍半萜合成酶编码序列。 对于PCR扩增法， 可根据本文所公开的核苷 酸序列来设计引物， 并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常常需要进行两次或

20、多次PCR扩增， 然后再 将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 0038 可采用本领域常规的技术手段构建同时表达拟南芥GFPP合成酶和二倍半萜合成 酶的表达载体。 这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、 体内重组技术等。 0039 适用于本文的表达载体可以是本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细 胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒或其它载体。 只要能在宿主(尤其是大肠 说明书 3/13 页 6 CN 108624610 A 6 杆菌)体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通常含有调 控序列， 包括但不限于复制起点、 启动

21、子、 标记基因、 翻译控制元件、 翻译起始用的核糖体结 合位点和转录终止子等。 0040 代表性的启动子有： 大肠杆菌的lac或trp启动子； 噬菌体PL启动子； 真核启动子 包括CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、 早期和晚期SV40启动子、 反转录病毒的LTRs 和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。 0041 表达载体中， 各种核酸和调控序列可被连接在一起， 以产生可能包括一个或多个 容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。 在制备本发明的表达载体时， 本文所述的两种酶的编码序列位于载体中以使得该编码序列 可操作

22、地连接用于表达适当调控序列。 0042 表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致本文所述的酶的编码序 列表达的任何载体(如质粒或病毒)。 载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿 主细胞的相容性。 该载体可以是线性或闭合的环形质粒。 0043 载体可以是自主复制的载体， 即作为染色体外实体存在， 其复制不依赖于染色体 复制的载体， 例如质粒、 染色体外元件、 微型染色体或人工染色体。 载体可包含用于保证自 我复制的任何方式。 或者， 载体可以是当被导入宿主细胞时， 整合到基因组中并且与其已经 被整合进入的染色体一起复制的载体。 此外， 可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的

23、总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒， 或转座子。 0044 表达载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、 转染、 转导等细胞的可选择标 记。 可选择的标记是基因， 其产物提供对抗生素或病毒的抗性、 对重金属的抗性、 原养型至 营养缺陷型等。 0045 优选地， 表达载体包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独 立于基因组自主个复制的元件。 0046 一个以上拷贝的本发明的编码序列可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。 多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通 过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得， 其中包含扩增拷贝的选择标

24、记基因并 且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。 0047 优选地， 表达载体包含人工合成的一段序列， 含有多个限制内切酶识别位点， 能为 外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 0048 优选地， 本文的表达载体适于在大肠杆菌中表达目的蛋白。 表达载体中除含有编 码拟南芥GFPP合成酶和二倍半萜合成酶的核苷酸序列外， 还可含有其它适于在大肠杆菌中 表达这两种酶的元件， 包括但不限于前文所述的包括但不限于复制起点、 启动子、 标记基 因、 翻译控制元件、 翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。 0049 在某些实施方案中， 本文使用抗性基因修改的p

25、ET28b(Apr)载体作为骨架载体构 建本文的表达载体。 在某些实施方案中， 本文表达载体的结构如图1所示。 0050 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细胞等。 0051 获得本本文的表达载体后， 可采用本领域熟知的方法将其转化宿主细胞。 例如， 当 宿主为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用MgCl2。 如果需要， 转化也可用电 说明书 4/13 页 7 CN 108624610 A 7 穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的DNA转染方

26、法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机 械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 0052 获得的转化子可以用常规方法培养， 允许其表达所述酶。 根据所用的宿主细胞， 培 养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。 当宿 主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动 子， 将细胞再培养一段时间。 0053 在本发明的实施方案中， 在构建重组宿主细胞， 尤其是重组大肠杆菌时， 通常将表 达拟南芥GFPP合成酶和二倍半萜合成酶的载体与表达MVA途径所有关键功能蛋白的载体共 转入宿主细胞中。 具体而言， 在某些实施方案中， 将携带拟

27、南芥二半萜途径的两个关键功能 基因GFPPS和TPS18的质粒及携带MVA途径所有关键功能基因的质粒共转入大肠杆菌中。 本 文中， 所述MVA途径所有关键功能基因至少负责由Acyl-CoA合成甲羟戊酸， 并由甲羟戊酸合 成IPP和DMAPP。 这类携带MVA途径所有关键功能基因的质粒可采用本领域已知的质粒， 例如 pXL13和pXL17(Wang,J.-F.； Li,S.-Y.； Xiong,Z.-Q.； Wang,Y.Cell Res.2016,26,258- 261)。 将所述表达载体共转到大肠杆菌宿主细胞中后， 涂布到添加有相应抗生素的LB琼脂 平板上， 过夜培养， 从而可筛选得到所需的

28、重组大肠杆菌。 因此， 本文提供一种重组大肠杆 菌， 所述大肠杆菌表达拟南芥GFPP合成酶和二倍半萜合成酶。 进一步地， 所述大肠杆菌还表 达MVA途径所有关键功能蛋白， 这些蛋白至少负责由Acyl-CoA合成甲羟戊酸， 以及由甲羟戊 酸合成IPP和DMAPP。 例如， 所述重组大肠杆菌含有拟南芥GFPP合成酶的编码序列和拟南芥 二倍半萜合成酶的编码序列， 进一步地还含有MVA途径所有关键功能蛋白的编码序列。 在某 些实施方案中， 所述重组大肠杆菌携带本文所述的重组表达载体， 并进一步携带表达MVA途 径所有关键功能基因的质粒。 0054 在某些实施方案中， 本文提供一种重组大肠杆菌， 所述重

29、组大肠杆菌能合成下式 所示的化合物(拟南芥三烯甲素)： 0055 0056 本文也提供下式所示的二倍半萜类化合物： 0057 0058 式I中， C7、 C11和C15中任意一个或多个位置上的甲基可被替换成羧基或COOR基 团， 其中， R选自C1-C6烷基； 和/或， C10和C11间的双键、 C6和C7间的双键以及C3和C20间的双 说明书 5/13 页 8 CN 108624610 A 8 键可任选地被氧化或还原， 从而形成在C3、 C6、 C7、 C10、 C11和C20中的任意一个或多个位置 上被取代， 和/或在C10和C11、 C6和C7和/或C3和C20间形成环氧环的化合物； 0

30、059 式II中， C7、 C11和C15中任意一个或多个位置上的甲基可被替换成羧基或COOR基 团， 其中， R选自C1-C6烷基； 和/或， C3和C20间的双键可任选地被氧化或还原， 从而形成在C3 和C20中的任意一个或全部两个位置上被取代的化合物， 或在C3和C20间形成环氧环的化合 物。 0060 本文中， 取代基可以是例如C1-C6烷基， 羟基， 羧基， 卤素(如F、 Cl、 Br或I)， C1-C6酰 基， 氨基， C2-C6烯基中的一个或多个。 0061 本领域已知， 二倍半萜类化合物具有抗肿瘤、 抗炎、 拒食、 抗血小板凝集、 抗病原微 生物等多方面生物活性。 因此， 预期

31、本发明的二倍半萜类化合物也具有抗肿瘤、 抗炎、 拒食、 抗血小板凝集、 抗病原微生物等方面的生物活性。 0062 因此， 在某些方面， 本文也提供一种药物组合物， 所述药物组合物含有 0063 0064 和药学上可接受的载体。 0065 药学上可接受的载体通常是安全、 无毒的， 且广义上可包括制药产业中用于制备 药物组合物的任何已知物质， 如填充剂、 稀释剂、 凝结剂、 黏合剂、 润滑剂、 助流剂、 稳定剂、 着色剂、 润湿剂、 崩解剂等。 在选择适用于投递合成肽的赋形剂时， 主要需考虑此药物组合 物的给药方式， 本领域技术人员熟知此项技术。 0066 药物组合物中可含有治疗或预防有效量的所示

32、化合物。“有效量” 指某成分的用量 足以产生所期望的反应。 具体的有效量取决于多种因素， 包括但不限于欲治疗的特定病症、 患者的身体条件(如患者体重、 年龄或性别)、 治疗持续时间、 共同施与的疗法(如果有的话) 以及所用的具体配方。“有效量” 也指在该用量下， 所述化合物的毒性或负面效果不及于其 所带来的正面疗效。 0067 可根据已知的药学程序来制备上述药物组合物， 譬如 雷明顿制药科学 (Remington s Pharmaceutical Sciences)(第17版， Alfonoso R.Gennaro编， 麦克出版公 司(Mack Publishing Company)， 伊斯顿

33、， 宾夕法尼亚(1985)一书中有详细的记载。 0068 在某些方面， 本发明还提供二倍半萜类化合物在抗肿瘤、 抗炎、 抗血小板凝集、 抗 病原微生物以及治疗和/预防拒食方面的应用， 或在制备治疗抗肿瘤药、 抗炎药、 抗血小板 凝集药、 抗病原微生物的药物以及治疗和/预防拒食的药物中的应用。 0069 本文制备拟南芥三烯甲素的方法可包括发酵本文所述重组大肠杆菌的步骤。 在某 些实施方案中， 本文制备拟南芥三烯甲素的方法还包括构建大肠杆菌工程菌的步骤。 在某 些实施方案中， 所述构建大肠杆菌工程菌的步骤包括： 将携带拟南芥二半萜途径的两个关 键功能基因GFPPS和TPS18的质粒及携带甲羟戊酸途

34、径所有关键功能基因的质粒共转于大 肠杆菌中， 获得大肠杆菌工程菌。 应理解的是， 可将GFPPS基因、 TPS18基因以及甲羟戊酸途 说明书 6/13 页 9 CN 108624610 A 9 径所有关键功能基因共同构建于一个表达载体中。 0070 可采用常规的发酵大肠杆菌的方法进行发酵。 例如， 在某些实施方案中， 在TB培养 基中低温(如1020)培养发酵所述重组大肠杆菌。 TB培养基可以是市售的培养基， 或根 据已知的TB培养基的配方自行配制。 通常， 获得发酵液后， 离心发酵液， 所得菌体用水悬浮， 破壁后用萃取； 所得上清液同样进行萃取， 合并萃取液， 减压浓缩得浸膏； 将浸膏进行硅

35、胶 柱层析， 以正己烷洗脱， 后经反相柱层析， 以甲醇洗脱， 即可获得拟南芥三烯甲素。 可使用乙 酸乙酯进行萃取。 反相柱层析的填料可为ODS-A-HG。 0071 实施例 0072 下文将以具体实施例的方式阐述本发明。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法， 通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆： 实验室指南 (美国纽约州： 冷泉港实验室 出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)， 1989)所述的条件， 或按照制造厂商所 建议的条件进行。 0073 所用溶剂和试剂均为分析纯， 购自国药集团化学试剂有限公司； 寡核苷酸引物购 自生功生物工程

36、(上海)股份有限公司； 序列分析委托上海美吉生物医药有限公司； PCR使用 Eppendorf Mastercycler personal PCR仪； 旋光测定由美国鲁道夫旋光仪Autopol I测 定； 碳谱和氢谱分别由Bruker DRX 500和Agilent DD2 600测定； 高分辨质谱由Thermo Fisher Scientific LTQ FT Ultra质谱仪测定； 薄层层析所用硅胶板为预制硅胶板 HSGF254(烟台淄福化学试剂有限公司)， 硅胶H(青岛海洋化工有限公司)， 反相硅胶(ODS-A- HG,日本东京YMC有限公司生产)。 0074 实施例1： 拟南芥三烯甲素

37、的制备 0075 重组质粒的构建： pXL13、 pXL17为实验室前期构建的萜类MVA途径相关的质粒 (Wang,J.-F.； Li,S.-Y.； Xiong,Z.-Q.； Wang,Y.Cell Res.2016,26,258-261)。 pXL17作为上 游途径质粒， 由atoB、 mvaA、 mvaS基因组成， Amp抗性， 负责Acyl-CoA到甲羟戊酸的合成。 pXL13作为下游途径质粒， 由mvak2、 mvak1、 mvaD、 idi基因组成， Kan抗性， 负责甲羟戊酸到 IPP和DMAPP的合成。 0076 以拟南芥(A.thaliana)的cDNA为模板， 通过引物AtG

38、FPPS2-F/R扩增其编码GFPP合 成酶的AtGFPPS2基因(At3g14550； 参考文献： Wang,C.-Y.； Chen,Q.-W.； Fan,D.-J.； Li,J.- X.； Wang,G.-D.； Zhang,P.Mol.Plant 2016,9,195-204)。 为构建可溶表达蛋白， 将AtGFPPS2 的N端信号肽 ， 即前39个氨基酸残基切掉 ， 并在5端添加ATG ， 从而得到新序列 AtGFPPS2trun。 拟南芥中编码二倍半萜合成酶的AtTPS18基因(At3g14520； 参考文献： 1.Wang,C.-Y.； Chen,Q.-W.； Fan,D.-J.；

39、 Li,J.-X.； 2.Wang,G.-D.； Zhang,P.Mol.Plant 2016,9,195-204.Aubourg,S.； Lecharny,A.； Bohlmann,J.Mol.Genet.Genomics 2002,267, 730-745)以相同的方法获得全长及截短基因(前51个氨基酸残基截掉)AtTPS18trun。 AtGFPPS2trun基因经双酶切克隆到质粒pET-28b(Apr)(在市售载体的基础上将抗性基因由 卡那霉素改成Apr)的BamH I和Not I位点处， 得到质粒pJS-GFPPS2trun。 同样， AtTPS18trun 基因克隆到质粒pET-D

40、uet(购自EMD Biosciences， Novagen)的BamH I和Not I位点处， 得到 质粒pJS-TPS18。 接下来， 以pJS-TPS18为模板， GFPP-TPS-infusionF/R为引物进行扩增， 获 得目的片段； pJS-GFPPS2trun用BamH I和Not I酶切， 回收后与上述两种目的片段用In- Fusion HD Cloning Kit(Vazyme Biotech)连接， 得到质粒pJS-GFPPS2-TPS18。 详细引物序 说明书 7/13 页 10 CN 108624610 A 10 列如下表1所示。 0077 表1： 本实验所采用的引物序

41、列(SEQ ID NO:514) 0078 0079 工程菌的发酵： 将pXL13、 pXL17、 pJS-GFPPS2-TPS18三质粒共转到大肠杆菌宿主细 胞BL21-DE3中， 涂布到添加有相应抗生素的LB琼脂平板上， 过夜培养。 挑取重组菌株的单克 隆于2mL液体LB培养基中， 37， 250rpm， 过夜培养16h。 用1.5mL离心管收集种子液加入等体 积的20甘油， 混匀后-80冻存， 作为摇瓶发酵的种子液。 按1接种量将一级种子接种到 2个含250mL液体TB的500mL摇瓶中， 37， 250rpm， 培养至OD600在0.4-0.6之间， 作为二级种 子液， 待接种发酵。

42、按10接种量将二级种子液接种到12个含400mL TB培养基的2L摇瓶中， 同时加入IPTG进行初始诱导， 置于16， 200rpm的摇床上发酵培养4d后， 获得4.8升发酵液。 0080 萃取： 将大肠杆菌发酵液高速离心分离、 获得细菌胞内和胞外两部分， 胞内部分用 水混悬后高压破碎， 用乙酸乙酯萃取； 上清液同样用乙酸乙酯萃取， 合并萃取液， 所得萃取 液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏。 0081 分离： 将所述乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析(硅胶H)分离， 以正己烷洗脱， 用薄层 层析(TLC)监测分成四个组分。 其中第二个组分再进行反相硅胶柱层析分离， 以甲醇洗脱， 得到拟南芥三烯甲素。 0082

43、 分离纯化得到的本发明的拟南芥三烯甲素为无色油状物， 比旋光 2D6+20.4(c 0.60,CHCl3)， 分子式由HR-DART-MS确定为C25H40。 1H及13C数据如下表2所示。 0083 表2： 拟南芥三烯甲素的1H和13C NMR(ppp， CDCl3， 室温) 0084 说明书 8/13 页 11 CN 108624610 A 11 0085 (结构式中的阿拉伯数字是化1学结构中碳原子的标位) 0086 说明书 9/13 页 12 CN 108624610 A 12 0087 说明书 10/13 页 13 CN 108624610 A 13 0088 0089 a Bruke

44、r-DRX-500spectrometer仪测定(氢谱测定为500MHz， 碳谱测定为 125MHz) ,1H NMR位移值以氘代溶剂中残存的CHCl3( 7.26ppm)为内标， 13C NMR位移值以 CDCl3( 77.0ppm)为内标； 偶合常数(J)的单位是Hz； b宽钝峰， 由HSQC谱中的相关信号峰证 实； c 或 朝向暂时如表所示d由于大环结构的缓慢旋转以及氢信号的严重重叠， NOESY相关 信号峰暂时确定如表中所示。 0090 实施例2： 6,7-二环氧拟南芥三烯甲素的制备 0091 称取拟南芥三烯甲素9mg， 溶解于10mL二氯甲烷中， 冰浴条件下加入10mg对间氯过 氧苯

45、甲酸， 搅拌10分钟后， 加入饱和的亚硫酸钠， 反应液用乙酸乙酯萃取， 获得拟南芥三烯 甲素环氧化产物粗提物， 该粗提物经200-300目硅胶柱层析正己烷/乙酸乙酯(100： 0， 95： 5， 90： 10)梯度洗脱， 经TLC检测分为四个部分。 其中， 第三部分进一步经硅胶柱层析正己烷/乙 酸乙酯(95： 5)洗脱， 获得其二环氧化产物6,7-二环氧拟南芥三烯甲素。 0092 分离纯化得到的本发明的6 ,7-二环氧拟南芥三烯甲素为白色固体， 比旋光 分子式由HR-DART-MS确定为C25H40O2。 1H及13C数据如下表3 所示。 0093 表3： 6,7-二环氧拟南芥三烯甲素的1H和

46、13C NMR(ppp， CDCl3， -20) 0094 0095 (结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位) 0096 说明书 11/13 页 14 CN 108624610 A 14 0097 说明书 12/13 页 15 CN 108624610 A 15 0098 0099 a Bruker-DRX-500核磁共振仪测定(射频500MHz做氢谱， 125MHz做碳谱), 1H NMR位 移值以氘代溶剂中残存的CHCl3( 7.26ppm)为内标， 13C NMR位移值以CDCl3( 77.0ppm)为内 标； 偶合常数(J)的单位是Hz。 0100 实施例3： 6,7-二环氧拟

47、南芥三烯甲素的单晶测定 0101 0102 6,7-二环氧拟南芥三烯甲素在正己烷-乙醚(8： 2)中重结晶得无色柱状晶体。 该晶 体的分子式为C25H40O2(M372.57g/mol)。 晶体属于单斜晶系， P2(1)空间群， 晶胞参数： 90 .00 , 98 .6640 (10) ,90.00 ,Z2, (CuK )0.513mm-1,F(000)412.0,Dcalc 1.101g/cm3。 0103 晶体(0.20.150.05)置于Bruker Apex II CCD衍射仪中， 经石墨单色仪单色 化的CuK 射线用扫描方式收集衍射数据。 于T205K,在6.714 2 129.98

48、2 范围内收集13,519个独立衍射点， 其中可观测衍射点3453个(I2(I)， Flack常数为0.09(9)。 0104 应用ShelXT程序解出结构， SHELXL对结构进行修正(修正因子为0.0302)， 得出6, 7-二环氧拟南芥三烯甲素的绝对构型。 0105 本晶体数据(不包括结构因素)已存入剑桥晶体数据中心， 编号： CCDC1531107。 说明书 13/13 页 16 CN 108624610 A 16 序列表 中国科学院上海生命科学研究院 中国科学院遗传与发育生物学研究所 拟南芥三烯甲素及其制备方法 172170 14 PatentIn version 3.3 1 108

49、3 DNA 拟南芥 （A. thaliana） 1 atggctacta ctgttcatct cagctcattc tccctcttca tccaatccag aggaagaaga 60 gacaactcca tatcttccgt caagagtctc aaaaaacgca caggtttgtc tccctcttct 120 gccctcacct cacaaggtgg cagagacatg attccaccag agggaaaatg caatgatcac 180 aactctgctt ttgatttcaa gttgtatatg atccgcaaag ccgaatctgt aaatgcggct 240 ctcgacgttt ctgtaccgct ccgagaaccc ctcactgtcc aggaagccgt gcggtactca 300 ttgctagcgg gcggaaaacg tgtgaggcct ctgctctgca ttgccgtct