转基因糖用甜菜植物.pdf

1、10申请公布号CN102057045A43申请公布日20110511CN102057045ACN102057045A21申请号200980121061022申请日20090525PCT/EP2008/05639020080523EPC12N15/8220060171申请人先正达参股股份有限公司地址瑞士巴塞尔72发明人约翰尼斯JL吉伦托马斯克拉夫特皮埃尔平74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称转基因糖用甜菜植物57摘要本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁，而且可以用于区分一年生与

2、二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010120686PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0562622009052587PCT申请的公布数据WO2009/141446EN2009112651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书57页序列表36页附图11页CN102057052A1/4页21一种核酸序列，其A与如下的核酸序列具有至少70的序列同一性；或B包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸；或C在严格条件下与如下的核酸序列杂交所述核酸序列选自如SEQIDNO1、4、

3、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组。2依照权利要求1的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。3依照权利要求2的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQIDNO8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一个或多个核酸取代、缺失、或添加，如表71图10中描绘的和表72图11中描绘的中所显示的，其中表71图10中描绘的和表72图11中描绘的中显示的多态性分别代表SEQIDNO8中所描述的序列的18种一年生和2种二年生等位基因。4多肽，其是由依照权利要求1至3中任一项的核酸序列编码的。5依照权利要求

4、4的多肽，其具有选自下组的氨基酸序列如SEQIDNO11或12中所描述的氨基酸序列。6嵌合构建体，其包含表达盒，所述表达盒包含在调节元件控制下，优选地在植物中有功能的调节元件控制下的依照权利要求1至3中任一项的核酸序列。7依照权利要求6的嵌合构建体，其进一步包含选择标志基因，其容许在选择方法中区分经转化的和未转化的植物材料。8依照权利要求6或7的嵌合构建体，其中为BVPRR7基因表达的转基因下调提供所述嵌合构建体。9依照权利要求8的嵌合构建体，其用于BVPRR7基因表达的转基因下调，其中所述嵌合构建体包含编码DSRNA的核酸分子序列，所述DSRNA能够靶向通过转录编码B基因蛋白，优选地BVPR

5、R7蛋白的DNA序列而生成的MRNA以进行降解。10依照权利要求9的嵌合构建体，其中编码所述DSRNA的核酸分子具有至少21个核苷酸的长度，而且与所述BVPRR7基因的编码序列的至少一部分，优选地与依照权利要求1至3中任一项的核酸序列基本上相同。11依照权利要求9或10的嵌合构建体，其中编码所述DSRNA的核酸分子具有在组成型启动子，优选地来自拟南芥的UBI3启动子的控制下的如SEQIDNO1中所描述的核苷酸序列。12依照权利要求9至11中任一项的嵌合构建体，其进一步包含来自马铃薯STLS1基因的第二内含子的序列。13植物转化载体和/或植物表达载体，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建

6、体。14依照权利要求13的植物表达载体，其是包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体的RNAI表达载体。15依照权利要求14的RNAI表达载体，其中所述RNAI表达载体包含图11中所显示的嵌合构建体。权利要求书CN102057045ACN102057052A2/4页316植物细胞，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13至15中任一项的载体。17依照权利要求16的植物细胞，其是糖用甜菜植物的植物细胞。18具有延迟抽苔的表型的转基因植物，优选糖用甜菜植物或其细胞、组织或种子，各包含依照权利要求16或17的植物细胞或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求

7、1至3中任一项的核酸序列，其中所述转基因植物特别是糖用甜菜植物表达所述DSRNA，从而延迟特别是抑制抽苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型，优选为非抽苔表型。19转基因植物，特别是糖用甜菜植物，其是自依照权利要求18的细胞、组织或种子生成的。20一种生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子种植具有受调控的抽苔的表型的植物特别是糖用甜菜植物，所述方法包括下列步骤A提供具有受调控的抽苔的表型的植物系特别是糖用甜菜系，特别是依照权利要求18或19的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系；B提供具有不同基因型的第二植物系，特别是糖用甜菜系作为第二亲本系；其中步骤A或步骤B的所述亲本系之一是雄性不育CMS系，且

8、其中另一亲本系是雄性能育，并C容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本系的花，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的杂种植物，特别是糖用甜菜杂种植物的种子。21依照权利要求20的生成杂种种子特别是糖用甜菜杂种种子的方法，其中所述雄性不育CMS糖用甜菜亲本系是近交糖用甜菜系，其包含依照权利要求1至3中任一项的核酸或其片段。22具有延迟抽苔的表型的植物特别是糖用甜菜植物的杂种种子。23依照权利要求22的杂种种子，其中所述种子是通过权利要求20或21的方法生成的。24具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别是杂种糖用甜菜植物，其是通过种植权利要求22或23的杂

9、种种子生成的。25植物部分，其选自下组种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或生物学样品，它们衍生自依照权利要求18或19的转基因糖用甜菜植物或其种子或依照权利要求22或23的杂种植物或其种子。26依照权利要求1至3中任一项的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别是糖用甜菜植物细胞的用途。27转化植物细胞特别是糖用甜菜植物细胞的方法，包括使用依照权利要求1至3中任一项的核酸序列或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13至15中任一项的载体。28依照权利要求18或19的转基因植物、依照权利要求24的杂种植物、或依照权利要求25的植物部分在选自下组的

10、方法中的用途糖生产的方法、需氧发酵的方法和厌氧发酵权利要求书CN102057045ACN102057052A3/4页4的方法，特别是在糖生产的方法中的用途。29用于生产糖的方法，其中加工依照权利要求18、19、24或25中任一项的糖用甜菜植物、或其细胞或组织以生产糖。30自依照权利要求18、19、24或25中任一项的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生成的糖。31多核苷酸标志物，其中所述标志物是基于核酸序列开发的，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因B基因相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或区分展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不

11、同单元型HAPLOTYPES。32依照权利要求31的多核苷酸标志物，其中所述核酸序列可获自依照权利要求1至3中任一项的核酸序列。33依照权利要求31或32的多核苷酸标志物，其进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。34依照权利要求33的多核苷酸标志物，其能够检测如SEQIDNO8所列的所述基因组序列的不同等位基因中存在的和如表71图10中描绘的和表72图11中描绘的中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别是区分一年生和二年生糖用甜菜系。3

12、5依照权利要求34的多核苷酸标志物，其能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括如SEQIDNO8所列的序列的位置224、351、615、897、1082、1841、1915、2334、11592、12316、12490、或12544处的和如表71图10中描绘的和表72图11中描绘的中所显示的SNP。36多核苷酸标志物组，其包含权利要求31至35中任一项的多个多核苷酸标志物。37引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组DNA中显示与抽苔基因B基因完美共分离的基因组区域内的核苷酸序列退火。38依照权利要求37的引物对，其与依照权利要求1至3中任一项的核酸序列退火，并扩增依

13、照权利要求31至35中任一项的多核苷酸或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一个或多个多态性，特别是一个或多个诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型的多态性。39依照权利要求38的引物对，其选自下组A引物对，其与BVPPR7的第三内含子中如SEQIDNO6中所描述的核苷酸序列退火，并自包含多态性特别是包含位置87处的C/TSNP和/或位置160处的C/TSNP和/或位置406处的A/GSNP的多态性的所述区域扩增信息片段；B引物对，其与如SEQIDNO8所列的核苷酸序列退火，并自包含多态性的所述序列扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如表

14、71图10中描绘的和表72图11中描绘的中所显示的。40依照权利要求39的引物对，其包含A如SEQIDNO49中所描述的正向引物PRR7T6F和如SEQIDNO50中所描述的反向引物PRR7T6R，用于扩增包含SNP2334的片段；或权利要求书CN102057045ACN102057052A4/4页5B如SEQIDNO13中所描述的正向引物PRR7T1F和如SEQIDNO14中所描述的反向引物PRR7T1R，用于扩增包含SNP160的片段；或C如SEQIDNO55中所描述的正向引物1R22T1F和如SEQIDNO56中所描述的反向引物1R22T1R。41依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸

15、标志物、依照权利要求36的多核苷酸标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物对在等位区分测定法中的用途，所述等位区分测定法用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在。42用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法，其容许区分一年生和二年生植物，其中使用依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸标志物、依照权利要求36的多核苷酸标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物对。43依照权利要求42的等位区分测定法，其包含下列步骤A自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，B使用依照权利要求37至40中任一项的引物对自所述样品或基因组DNA扩增

16、片段，并C分别比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位序列。44依照权利要求42或43的等位区分测定法，其中在步骤C中用包含对一年生等位基因特异性的序列的经第一荧光标记的探针分子探查步骤B中获得的扩增片段，且其中所述第一探针的染料荧光的升高指示一年生等位基因的存在。45依照权利要求44的等位区分测定法，其中另外用包含对二年生等位基因特异性的序列的经第二荧光标记的探针分子探查步骤B中获得的扩增片段，且其中所述第一探针的染料荧光的升高仅指示一年生等位基因的存在。46一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其使用依照权利要求42至45中任一项的基于标志物的等位区分测定法来进行。

17、权利要求书CN102057045ACN102057052A1/57页6转基因糖用甜菜植物0001一般而言，本发明涉及植物分子生物学、植物转化、和植物育种领域。更具体而言，本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸标志物，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁或驻留RESIDING于抽苔基因或B基因内，而且可以用于区分一年生与二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型HAPLOTYPES。0002栽培的糖用甜菜BETAVULGARISSSPVULGARISL是一种二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝

18、条延长抽苔和花形成。比较而言，一年生甜菜BVULGARISSSPMARITIME属的许多野生甜菜显示一年生生长习性，这是由于B基因座处存在抽苔基因B，其位于染色体II的中央区。抽苔基因B基因负责决定糖用甜菜中的一年生习性。认为甜菜物种中的一年生是单基因的且显性的性状。与携带B等位基因的二年生植物相反，携带显性B等位基因的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成生殖期，所述二年生植物强制性需要春化进行抽苔，随后发生开花。基因座B的显性等位基因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔，无需对于携带隐性等位基因的二年生栽培种而言通常至关重要的冷低温，COLD要求ABE等，1997。0003抽苔

19、茎延长STEMELONGATION是营养性向生殖性生长转换中明显可见的第一步。0004传统上，二年生栽培的糖用甜菜在春季种植并在秋季收获。然而，预期通过在秋季播种并在冬季里栽培来延长生长期本质上提高产率，而且会容许延长糖用甜菜加工活动，解决糖工业的一项需求。然而，在中部欧洲在冬季里栽培目前的糖用甜菜即作为冬季作物目前是不可能，这是因为春化通过暴露于冬季期间的寒冷温度诱导的会导致抽苔和产率损失。如此，高度想要开发非抽苔冬季甜菜，其中修饰春化响应以赋予冷诱导后对抽苔的抗性或抽苔的显著延迟。由于B基因在糖用甜菜的春化响应中发挥关键作用，它代表用于通过调控春化响应来工程化改造抽苔抗性的有希望的候选。0

20、005此外，在栽培的糖用甜菜中，抽苔是不想要的现象，因为它导致产率显著降低而且引起收获和提取糖期间的问题。糖用甜菜的商业性种子生产常常在生长有一年生杂生WEED甜菜的地区进行，它们能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受的。为了鉴定一年生植物的污染，在收获种子后立即在没有野生型一年生甜菜生长的地区种植各批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过抽苔者的存在来鉴定污染。非常希望用基于标志物的筛选测定法来替代此测试，因为能更早地得到结果，这会导致种子加工中成本节约。0006基于标志物的方法还能有利地用于糖用甜菜育种，例如用于加快育种过程，或用于引入来自野生海甜菜的新

21、变异。由于B等位基因的不完全渗透INCOMPLETEPENETRATION及其环境依赖性，还需要紧密连锁的分子标志物来筛选它在育种系中的存在。对于所有这些情况，重要的是要有与B基因紧密连锁的能够精确鉴定一年生植物或二年生植物的标志物。0007出于上述原因，需要转基因手段来调控糖用甜菜的春化响应，而且还需要标志物说明书CN102057045ACN102057052A2/57页7辅助手段来在种子生产中和糖用甜菜育种中区分B基因的一年生和二年生等位基因。0008本发明现在提供了解决上述需要的此类转基因手段以及标志物辅助手段。0009发明概述0010本发明涉及核酸序列，其与如下的核酸序列具有至少70的

22、序列同一性，所述核酸序列选自如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组，涉及核酸序列，其包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸，所述核酸序列选自如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组，涉及所述核酸序列；涉及所述一个TOSAIDONE，或者涉及核酸序列，其在严格条件下与如下的核酸序列杂交，所述核酸序列选自如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组。0011在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列是分离的核酸。关于同源性，本发明应当同样地涵盖所有

23、个别数值它们落入以至少70开始的范围中，如上文所提及的，即71、72、73、74、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。优选地，本发明的核酸序列的长度包含选自下组的核酸序列的至少15、20、25、30、35、40、45、或至少50个连续的核苷酸如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。要理解的是，术语“至少X个核苷酸”涵盖具有以X开始的任何数值及以上的核酸分子。例如，术语“至少15个核苷酸”意图涵盖具有15、16、17、18、19、20、和更多个核苷酸的核酸分子

24、。在一个进一步优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列在严格条件下，更优选地在高度严格条件下与选自下组的核酸序列杂交如SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。0012在此方面的一个别的实施方案中，核酸分子包含选自下组的核苷酸序列及其互补物SEQIDNO1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54。在另一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列包含如SEQIDNO8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一处或多处核酸替代、缺失、或添加，如表71和表72中所显示的，其中表71和表72中显示的多态性分别代表SEQIDNO8中所描述的序列的1

25、8种一年生和2种二年生等位基因。表71和表72也显示为图10和图11。0013依照另一方面，本发明进一步提供了由上文所描述的本发明的核酸序列编码的多肽。在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的多肽具有选自下组的氨基酸序列如SEQIDNO11或12中所描述的氨基酸序列。0014本发明进一步涉及B基因特别地BVPRR7基因在用于生成显现出非抽苔表型的植物的转基因方法中的用途。具体地，本发明涉及包含表达盒的嵌合构建体，所述表达盒包含在调节元件控制下，优选地在植物中有功能的调节元件控制下的如上文所描述的本发明的核酸序列。0015在本发明的一个实施方案中，如上文所描述的嵌合构建体可以进一步含有选择标

26、志基因，其容许在选择方法SELECTIONPROCEDURE中区分经转化的和未转化的植物材料。0016在一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含负选择标志，特别地编码对植物毒性化合物诸如抗生素或除草剂的抗性的选择标志。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含正向选择标志，特别地编码给经转化的植物提供超过非转化植物的选择优势，特说明书CN102057045ACN102057052A3/57页8别地营养优势的酶的选择标志诸如例如磷酸甘露糖异构酶基因或木糖异构酶基因。0017在一个优选的实施方案中，提供了本发明的嵌合构建体以转基因下调BVPRR7基因表达，特别地经由反义或RNAI办法来进行。在此上下

27、文中，术语“下调”或“抑制”想要指与相同条件下非转化的植物中的基因表达相比BVPPR7基因的表达水平的任何降低。这包括基因“沉默”，使得可以检测不到基因表达。在另一个优选的实施方案中，用于转基因下调BVPRR7基因表达的本发明的嵌合构建体包含编码DSRNA的核酸分子，所述DSRNA能够靶向通过转录编码B基因蛋白，优选地BVPRR7蛋白的DNA序列生成的MRNA以进行降解。在另一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码所述DSRNA的核酸分子，其中所述核酸分子具有至少21个核苷酸的长度，而且与所述BVPRR7基因的编码序列的至少一部分基本上相同。BVPRR7基因的所述编码序列优

28、选是上文所描述的本发明的核酸序列。更优选地，BVPRR7基因的所述编码序列是具有本发明中如列为SEQIDNO1、4、5、6、9、10、53、或54的序列的核酸分子。“基本上相同的”指能够在严格条件下彼此杂交的两种核酸分子。一般地，在DSRNA的整个长度里不要求DSRNA与BVPRR7基因的编码序列或其部分之间的同一性或同源性。足够的是如果至少21个核苷酸的区段具有同一性，但是优选地，选择编码在超过21个核苷酸的区段里与靶RNA分子具有同源性的DSRNA的核酸序列。优选地，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码DSRNA且具有超过21个核苷酸，更优选超过50、100、250、500、600、75

29、0、1000或更多个核苷酸的长度的核酸分子。0018在一个优选的实施方案中，编码本发明嵌合构建体中包含的DSRNA的核酸分子具有在组成型启动子，优选地来自拟南芥的UBI3启动子的控制下的如SEQIDNO1中所描述的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构建体进一步包含来自马铃薯STLS1基因的第二内含子的序列ECKES等，1986；VANCANNEYT等，1990。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合构建体包含靶向BVPRR7的反向重复，其由如SEQIDNO1中所描述的核苷酸序列组成，以由来自马铃薯的STLS1基因第二内含子分开的反义和有义两种取向克隆在UBI3启动子NORRIS等，19

30、93与NOS终止子之间。0019在本发明的一个实施方案中，提供了转化载体和/或表达载体，特别地植物转化载体和/或表达载体，其包含如上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个别的实施方案中，植物表达载体是RNAI表达载体，其包含上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个更优选的实施方案中，RNAI表达载体包含图11中所显示的本发明的嵌合构建体。0020在本发明的一个别的方面，提供了一种植物细胞，其包含依照本发明的和如上文所描述的嵌合构建体或载体分子例如转化载体或表达载体。在一个优选的实施方案中，所述包含本发明的嵌合构建体或载体分子的植物细胞是糖用甜菜植物的植物细胞。0021进一步提供了具有延迟抽苔的表型

31、的转基因植物特别地糖用甜菜植物或其细胞、组织或种子，各包含本发明的植物细胞和/或依照本发明的嵌合构建体和/或如上文所描述的本发明的的核酸序列，其中所述转基因植物表达所述DSRNA，从而延迟特别地抑制抽苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型优选地非抽苔表型。“抽苔的延迟”应当理解为调控糖用甜菜植物的天然抽苔反应。在抽苔期间，植物春化即暴露于冷温度后作为第一步并且在从营养性转变成生殖性生长过程中茎伸长，最终导致花形成。抽苔反应的延迟想要指与正常的植物相比较晚开始的茎伸长；那些植物展现出延迟抽苔的表型。抽苔反应可以延迟几天即5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天和多至数周即2、3、4周或数

32、月即说明书CN102057045ACN102057052A4/57页91、2、3、5、或6个月。在一个优选的实施方案中，完全抑制抽苔响应；此类植物在春化后未开始抽苔，而且展现出非抽苔表型。在一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了转基因植物特别地糖用甜菜植物，其是自本发明的和上文所描述的细胞、组织或种子生成的。0022在另一方面，本发明提供了一种用于生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子种植具有受调控的抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物。优选地，所述方法A提供具有受调控的抽苔的表型的植物系特别地糖用甜菜系特别地本发明的和如上文所描述的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系，B提供具有不同基因型的第二

33、植物系，特别是糖用甜菜系作为第二亲本系；其中步骤A或步骤B的所述亲本系之一是雄性不育CMS系，且其中另一亲本系是雄性能育，并C容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本系的花，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别地糖用甜菜杂种植物的种子。在一个优选的实施方案中，两种亲本系都是糖用甜菜植物系，其中至少一种糖用甜菜亲本系是本发明的转基因糖用甜菜系。至少一种具有受调控的抽苔的表型的糖用甜菜亲本系也可以优选是没有任何转基因的植物，然后其通过遗传操作的其它方法获得，如下文所描述的。在此方面的一个实施方案中，步骤A中提供的糖用甜菜亲本系是雄性不育

34、CMS近交糖用甜菜系，其包含一种或多种本发明的核酸序列或其片段，而步骤B中提供的第二糖亲本系是雄性能育近交糖用甜菜系。在另一个优选的实施方案中，步骤A中提供的糖用甜菜亲本系是雄性能育糖用甜菜植物，其包含一种或多种本发明的核酸序列或其片段，而步骤B中提供的第二糖亲本系是雄性不育CMS近交糖用甜菜系。0023本发明的别的方面涉及展现出延迟抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物的杂种种子。在本发明的又一方面，所述杂种种子是通过本发明的和如上文所描述的方法生成的。在一个进一步优选的实施方案中，具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别地杂种糖用甜菜植物是通过种植上文所描述的本发明的杂种种子生成的。本发明的进一步优选

35、的实施方案涉及选自下组的植物部分种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或生物学样品，它们衍生自本发明的转基因糖用甜菜植物TAPROOTS或其种子或者衍生自本发明的杂种植物或其种子，如上文所描述的。0024本发明的另一方面涉及本发明的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的用途。用本发明的核酸序列或其片段转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的目的是调控植物的抽苔习性，如上文所描述的。此方面的另一个实施方案涉及转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的方法，其中该方法包括使用本发明的核酸序列或本发明的嵌合构建体或本发明的和如上文所描述的载体。0025在另一方

36、面，本发明提供了本发明的转基因植物、本发明的杂种植物、或本发明的和如上文所描述的植物部分在选自下组的方法中的用途糖生产的方法、需氧发酵的方法和厌氧发酵的方法。优选地，在生产糖的方法中使用本发明的转基因植物、本发明的杂种植物、或本发明的和如上文所描述的植物部分。另一方面涉及一种用于生产糖的方法，其中加工本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织以生产糖。本发明进一步提供了自本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生产的糖。0026在别的方面，本发明涉及基于核酸序列开发的多核苷酸标志物，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因B基因相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中

37、所说明书CN102057045ACN102057052A5/57页10述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物具有可获自本发明的和如上文所描述的一种或多种核酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸标志物进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。优选地，所述多核苷酸标志物能够检测本文中列为SEQIDNO8的所述基因组序列的不同等位基因中存在的和表71图10中进一步

38、描绘的和表72图10中进一步描绘的中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别地区分一年生和二年生糖用甜菜系。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括列为SEQIDNO8的序列的位置224、351、615、897、1082、1841、1915、2334、11592、12316、12490、或12544处的和如表71图10中进一步描绘的和表72图11中进一步描绘的中所显示的SNP。本发明的别的方面涉及一组多核苷酸标志物，其包含本发明的和上文所描述的众多多核苷酸标志物。在此上下文中，术语“众多”指一组超过一个的多核

39、苷酸标志物，其优选地由两种、三种或更多种标志物组成。0027本发明的另一方面涉及引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组DNA中显示与抽苔基因B基因完美共分离的基因组区域内的核苷酸序列退火。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对与本发明的和如上文所描述的核酸序列退火，并扩增本发明的多核苷酸，优选多核苷酸标志物，或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一个或多个多态性，特别地一处或多处诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型的多态性。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对选自下组A与BVPPR7的第三内含子内如SEQIDNO6中所描述的核苷酸序列退火的引物对，其

40、自包含多态性特别地包含位置87处的C/TSNP和/或位置160处的C/TSNP和/或位置406处的A/GSNP的多态性的所述区域扩增信息片段；或B引物对，其与列为SEQIDNO8的核酸序列退火，并自包含多态性的所述序列扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如表71图10中进一步描绘的和表72图11中进一步描绘的中所显示的。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的引物对包含A如SEQIDNO49中所描述的正向引物PRR7T6F和如SEQIDNO50中所描述的反向引物PRR7T6R，用于扩增包含SNP2334的片段；或B如SEQIDNO13中所描述的正向引物P

41、RR7T1F和如SEQIDNO14中所描述的反向引物PRR7T1R，用于扩增包含SNP160的片段；或C用于扩增片段的如SEQIDNO55中所描述的正向引物1R22T1F和如SEQIDNO56中所描述的反向引物1R22T1R和如SEQIDNO57中所描述的探针分子1R22T1VIC，作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子，和如SEQIDNO58中所描述的探针分子1R22T1FAM，作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子。0028在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种探针分子和/或涉及一种或多种引物，特别地一种或多种引物对，但是特别地一种或多种由正向引物和反向引物组成的引物对

42、，所述引物能够与可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因B基因有关的表型完美共分离的基因组DNA区域的核酸序列退火，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展说明书CN102057045ACN102057052A6/57页11现出二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。0029在一个实施方案中，本发明涉及一组探针多核苷酸，其包含与包含多态性位点的依照本发明的和如上文中所描述的信息多核苷酸片段内的亚区互补的至少两种不同探针分子，并扩增在交叠的区域中仅相差一个或两个碱基错配的部分交叠片段，其中第一探针，特别地用第一荧光染料，更特别用第一荧光染料和猝灭剂标记的探针代表一种等位基因，而

43、第二探针，特别地用第二荧光染料其与第一染料不相同，更特别地用第二荧光染料和猝灭剂标记的探针代表另一等位基因。0030可以在用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生ANNUALITY有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法中使用本发明的上述多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标志物或本发明的引物对。0031在本发明的另一方面，提供了用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法，其容许区分一年生和二年生植物。在一个优选的实施方案中，在此测定法中使用本发明的多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标志物、或本发明的引物对。0032在一个进一步优选的实施方案中，本发明的等位区分测定法包

44、括下列步骤A自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，B使用本发明的引物对自所述样品或基因组DNA扩增片段，并C比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位序列。在此测定法中，比较步骤C的扩增片段的序列与已知与二年生表型有关的等位基因的序列。若序列与二年生等位基因的序列不同，则这指明一年生等位基因即一年生植物的存在。在另一个优选的实施方案中，用包含对一年生等位基因特异性的序列的经第一荧光标记的探针分子探查本发明等位区分测定法的步骤C中获得的扩增片段。若第一探针的染料荧光在反应过程中升高，则这指明一年生等位基因的存在。0033在一个优选的实施方案中，本发明的测定法采用A用于

45、扩增包含SNP2334的片段的如SEQIDNO49中所描述的正向引物PRR7T6F和如SEQIDNO50中所描述的反向引物PRR7T6R和如SEQIDNO51中所描述的探针分子PRR7T6VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQIDNO52中所描述的探针分子PRR7T6FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或B用于扩增包含SNP160的片段的如SEQIDNO13中所描述的正向引物PRR7T1F和如SEQIDNO14中所描述的反向引物PRR7T1R和如SEQIDNO15中所描述的探针分子PRR7T1VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和

46、如SEQIDNO16中所描述的探针分子PRR7T1FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或C用于扩增片段的如SEQIDNO55中所描述的正向引物1R22T1F和如SEQIDNO56中所描述的反向引物1R22T1R和如SEQIDNO57中所描述的探针分子1R22T1VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQIDNO58中所描述的探针分子1R22T1FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子。0034在一个实施方案中，本发明涉及一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其使用依照本发明的和如上文所描述的基于标志物的等位区分测定法来进行。0035附图

47、简述0036附图说明书CN102057045ACN102057052A7/57页120037图1不同物种间的REC域和糖用甜菜ESTCV301305的推定REC域的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。BB，支气管炎博德特氏菌BORDETELLABRONCHISEPTICA；BS，枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS；BV，甜菜BETAVULGARIS；EC，大肠埃希氏菌/大肠杆菌ESCHERICHIACOLI；KP，肺炎克雷伯氏菌KLEBSIELLAPNEUMONIAE；PA，铜绿假单胞菌PSEUDOM

48、ONASAERUGINOSA；RC，荚膜红细菌RHODOBACTERCAPSULATUS；SC，天蓝色链霉菌STREPTOMYCESCOELICOLOR；SF，弗氏志贺氏菌SHIGELLAFLEXNERI；ST，鼠伤寒沙门氏菌SALMONELLATYPHIMURIUM。0038图2拟南芥PRR7蛋白质与来自糖用甜菜ESTCV301305的预测部分蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；相似的氨基酸以灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。0039图3拟南芥PRR7基因与糖用甜菜ESTCV301305之间的基因组和MRNA序列的序列比对。拟南芥与甜菜之间保守的核苷酸以灰色标示。内含子以长划

49、串代表。0040图4糖用甜菜染色体II的遗传学图。染色体右边给出了标志物名称，左边标示了累积遗传距离。0041图5BVPRR7基因的基因结构的示意图，显示了推定的外显子和内含子。由ESTCV301305覆盖的区域以黑色箭头显示了。0042图6拟南芥PRR基因家族成员和BVPRR7蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。0043图7BVPRR7与来自其它开花植物的相关蛋白质之间的系统发生关系，其通过使用NEIGHBORJOINING方法SAITOU和NEI，1987基于对来自数种植物物种的PRR基因家族中的多种成员包括来自糖用甜菜、拟南芥ARABIDOPSISTHALIANATOC1，NP_200946；PRR3，NP_568919；PRR5，NP_568446；PRR7，NP_568107；和PRR9，NP_566085、稻ORYZASATIVAPRR37，Q0D3B6、大麦HORDEUMVULGAREPPDH1，AAY17586和普通小麦TRITICUMAESTIVUMPPDD1，ABL09477的PRR7同系物的系统发生分析得到。采用自1000个复制品推导出的自展共有树来代表所分析的分类单位的进化史FELSENSTEIN，1985。折