与作为基因的转录产物的RNA相互补的寡核苷酸的应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101054604 B (45)授权公告日 2010.12.15 CN 101054604 B *CN101054604B* (21)申请号 200710096696.2 (22)申请日 2001.11.26 357398/2000 2000.11.24 JP 01822240.4 2001.11.26 C12Q 1/68(2006.01) A61K 31/404(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 卫材 R&D 管理有限公司 地址 日本东京都 (72)发明人 大和隆志 横井晃 黑光淳郎 河合隆利 加藤弘之 长洲毅志 (74)专

2、利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 周慧敏 梁谋 WO 9507276 A1,1995.03.16, Takashi Owa， et al.A Focused Compound Library of Novel N-(7-Indolyl) benzenesulfonamides for the Discovery of Potent Cell Cycle Inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters .2000, 第 10 卷 ( 第 10 期 ), Takashi Owa， et al.Discovery

3、 of Novel Antitumor Sulfonamides Targeting G1 Phase of the Cell.J. Med. Chem. .1999, 第 42 卷 ( 第 19 期 ), (54) 发明名称 与作为基因的转录产物的 RNA 相互补的寡核 苷酸的应用 (57) 摘要 从给予了抗癌药剂 (E7070 及类似的化合物 ) 的癌症病人取出肿瘤细胞， 然后测定列举于表 3 和表4中基因的表达量。 按另一种方式是， 用抗癌 药剂处理从癌症病人取出的肿瘤细胞， 然后测定 列举于表 3 和表 4 中基因的表达量。在列举于表 3中基因的表达量增加， 或者列举于表4中基因的 表

4、达量减少的情况下， 可判定此相应的肿瘤细胞 对相应的抗癌药剂是敏感的。 因此， 可检测肿瘤细 胞对于抗癌药剂的敏感性。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 温庭江 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 3 页 说明书 26 页 附图 3 页 CN 101054604 B1/3 页 2 1. 与作为列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种 RNA 相互 补的寡核苷酸在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用， 其包括 ： 1) 测定肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一

5、种或多种基因的表达水平， 该肿瘤细 胞是从经如下通式表示的抗癌剂治疗的癌症病人采集的 ： 其中 RA是氰基或亚磺酰氨基， nA是 0 或 1-3， RB是甲基， 乙基， 正丙基或异丙基， nB是 0 或 1 或 2， RC是氰基或氯原子， 和 nC是 0 或 1 或 2， 以及 2) 与用该抗癌剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较， 当列举 于表 3 中的一种或多种基因的表达水平提高， 或者当列举于表 4 中的一种或多种基因的表 达水平降低时， 能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。 2. 与作为列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种 RNA 相互 补

6、的寡核苷酸在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用， 其包括 ： 1) 使抗癌剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞， 所述抗癌剂由如下通式表示 ： 其中 RA是氰基或亚磺酰氨基， nA是 0 或 1-3， RB是甲基， 乙基， 正丙基或异丙基， nB是 0 或 1 或 2， RC是氰基或氯原子， 和 nC是 0 或 1 或 2， 2) 测定肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因的表达水平， 以及 3) 与未被处理的肿瘤细胞的基因表达水平相比较， 当列举于表 3 中的一种或多种基因 的表达水平提高， 或者当列举于表 4 中的一种或多种基因的表达水平降低时， 能确定该肿

7、权 利 要 求 书 CN 101054604 B2/3 页 3 瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其中使用 DNA 微阵列， 通过定量作为列于表 3 和 表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA来测定所述的一种或多种基因的表 达水平。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其中借助于定量 PCR 法， 通过定量作为列于表 3 和表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA来测定所述的一种或多种基因的 表达水平。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其中， 所述的抗癌剂是 N-(3- 氯 -7- 吲哚基 )-1， 4- 苯

8、二磺酰胺。 6. 针对列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因所编码蛋白的抗体在制备用于检测肿 瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂中的应用， 其包括 ： 1) 测定肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因的表达水平， 该肿瘤细 胞是从经以如下通式表示的抗癌剂治疗的癌症病人采集的 ： 其中 RA是氰基或亚磺酰氨基， nA是 0 或 1-3， RB是甲基， 乙基， 正丙基或异丙基， nB是 0 或 1 或 2， RC是氰基或氯原子， 和 nC是 0 或 1 或 2， 以及 2) 与用该抗癌剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较， 当列举 于表 3 中的一种或多种基因的表达

9、水平提高， 或者当列举于表 4 中的一种或多种基因的表 达水平降低时， 能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。 7. 针对列举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因所编码蛋白的抗体在制备用于检测肿 瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用， 其包括 ： 1) 使抗癌剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞， 所述抗癌剂由如下通式表示 ： 权 利 要 求 书 CN 101054604 B3/3 页 4 其中 RA是氰基或亚磺酰氨基， nA是 0 或 1-3， RB是甲基， 乙基， 正丙基或异丙基， nB是 0 或 1 或 2， RC是氰基或氯原子， 和 nC是 0 或 1 或 2， 2) 测定肿瘤细胞中选自列

10、举于表 3 和表 4 中的一种或多种基因的表达水平， 以及 3) 与未被处理的肿瘤细胞的基因表达水平相比较， 当列举于表 3 中的一种或多种基因 的表达水平提高， 或者当列举于表 4 中的一种或多种基因的表达水平降低时， 能确定该肿 瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的应用， 其中借助于免疫化学方法， 通过定量列于表 3 和 表 4 中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所述的一种或多种基因的表 达水平。 9. 根据权利要求 8 所述的应用， 其中借助于酶联免疫吸附测定法， 通过定量列于表 3 和表 4 中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所

11、述的一种或多种基因的 表达水平 . 10. 根据权利要求8所述的应用， 其中借助于蛋白质印迹试验， 通过定量列于表3和表 4 中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所述的一种或多种基因的表达水 平。 11. 根据权利要求6或7所述的应用， 其中， 所述的抗癌剂是N-(3-氯-7-吲哚基)-1， 4- 苯二磺酰胺。 权 利 要 求 书 CN 101054604 B1/26 页 5 与作为基因的转录产物的 RNA 相互补的寡核苷酸的应用 0001 本申请是申请日为 2001 年 11 月 26 日， 申请号为 01822240.4， 发明名称为 “试验 肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法”

12、 的发明专利申请的分案申请。 技术领域 ： 0002 本发明涉及与作为基因的转录产物的 RNA 相互补的寡核苷酸的应用。 背景技术 ： 0003 在抗癌药剂的传统临床研究中， 首先是在 I 期临床研究中确定该药剂的毒性概况 和最大推荐剂量， 然后在 II 期临床研究中应用肿瘤缩小率作为效力标准， 根据反应率对该 药剂作为药物进行评价。 与此同时， 随着近几年来癌生物学的研究进展， 具有抑制细胞内信 号转导系统和血管形成等新颖作用机理的药物正处于被积极地探索和开发的过程中。 对于 这些新颖的抗癌药剂， 有可能不必要给予接近毒性剂量的最大推荐剂量。 并且预计， 通过应 用与肿瘤生长抑制有关的QOL

13、(生命质量)改善或生命延长而不是用肿瘤缩小作为指标， 可 以更恰当地判断药效。 在这种情况下， 为了更合理更明确地证实其药效， 理想的是利用与肿 瘤生长抑制机制密切相关的生物标志的改变作为一种替代性标志。 0004 总的来说， 在抗癌治疗的过程中， 当给予一种抗癌药剂时， 生命机体的反应性主要 取决于作为药剂靶标的肿瘤细胞对该药剂的敏感性。肿瘤细胞对药物的这种敏感性， 对于 各种类型的肿瘤细胞通常都有明显的改变 . 这种敏感性的差异可归因于药物靶分子或与 这些分子相关的因子的数量或者质量差异， 以及药物抗性的获得等因素 . 考虑到这种基本 情况， 如果当作为靶标的肿瘤细胞表现出对某种药物的敏感

14、性而特异性引起的肿瘤细胞改 变， 可以通过使用由活组织检查等方法得到的肿瘤组织来测定， 将是非常有用的， 因为通过 应用这种改变作为替代性标志， 使较早地确定药效、 建立治疗方法或者选择新的治疗方法 等成为可能。而且， 如果在治疗前从按常规方式通过活组织检查等方法得到的肿瘤组织分 离出肿瘤细胞， 然后用药物处理， 并根据上述替代性标志的改变确定这种肿瘤细胞是否对 该药物敏感， 这样就有可能初步预测使用该药物的治疗是否有效， 这在临床实践中是十分 有用的 . 重要的是这种替代性标志的改变对于抗肿瘤作用应该是特异性的， 并且对这种改 变足以进行高灵敏度的检测 . 更具体地说， 定量测定对药物抗肿瘤

15、作用具有特异性的基因 表达改变， 分析与基因表达改变同时发生的蛋白质量的改变， 以及分析与这些改变相关的 功能性改变等都可以被用作替代性标志 . 0005 E7070(N-(3- 氯 -7- 吲哚基 )-1， 4- 苯二磺酰胺 ) 是一种以细胞周期 G1 期为靶标 的， 具有抗肿瘤作用的化合物， 正在被临床开发研究中 (Takashi Owa， Hiroshi Yoshino， Tatsuo Okauchi， KentaroYoshimatsu， Yoichi Ozawa， Naoko Hata Sugi， Takeshi Nagasu， Nozomu Koyanagi and Kyosuke

16、 Kitoh， 医学化学杂志 1999， 42， 3789-3799). 0006 这种化合物对不同肿瘤细胞生长抑制作用的强度频谱与任何现存的抗癌药剂都 不同， 预期这种化合物具有作为抗癌药剂的作用， 并具有一种新颖的作用机制 . 为了加速 对这种药物的临床开发研究并尽快地建立一种临床治疗方法， 以及根据所确定的治疗方 说 明 书 CN 101054604 B2/26 页 6 法， 通过有效地促进治疗来帮助改善病人的 QOL， 期望发现和应用一种可以被特定地用于该 药物给药的替代性标志 . 0007 在最近几年， 已经建立了使用不同的 DNA 微阵列 (microarrays) 同时测定大量基

17、 因表达水平的方法并广泛地被应用 (schena M， shalonD， Davis RW， Brown PO， 科学 1995， 270， 467-70 ； Lockhart， D.J.， DongH.， Byren M.C.， Follettie M.T.， Gallo M.V.， Chee M.S.， Mittmann M.， Wang C.， Kobayashi， M.， Horton H.， Brown B.L.， 自然生物技术， 1996， 14， 1675-1680). 0008 在癌症研究领域， 应用此类DNA微阵列的研究也正在积极地进行.例如， 在通过使 用 DNA 微阵列的

18、表达分析对扩散性大 B- 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 进行的研究中， 根据基因表 达表观的差异， DLBCL 已被分类成二种不同的类型， 并且表明， 这种分类可指导对预后的推 测 (Alizadeh AA， Eisen MB， Davis RE， Ma C， Lossos IS， RosenwaldA， Boldrick JC， Sabet H， Tran T， Yu X， Powell Ji， Yang l， MartiGE， Moore T， Hudson J Jr， Lu L， Lewis DB， Tibshirani R， SherlockG， Chan WC， Greiner TC，

19、 Weisenburger DD， Armitage JO， WarnkeR， Staudt LM， 等， 自然， 2000， 403， 503-11). 此外， 在一篇报导中通过分析来自美国国家癌症 研究所的60种类型癌细胞系的一种镶嵌板(panel)的基因表达表观， 对这些细胞系作了重 新分类， 并且检测了它们的特征 (Ross DT， Scherf U， Eisen MB， Perou CM， ReesC， Spellman P， Iyer V， Jeffrey SS， Van de Rijn M， Waltham M， Pergamenschikov A， Lee JC， Lashka

20、ri D， Shalon D， Myers TG， Weinstein JN， Botstein D， Brown PO， 自然遗传， 2000， 24， 227-35)， 另一篇报导论述了这 60 种类型癌细胞系镶嵌板的基因表达表观的相互关系， 以及每个细 胞系对不同抗癌药剂的敏感性 (Scherf U， Ross Dt， Waltham M， Smith LH， Lee JK， Tanabe L， Kohn KW， Reinhold WC， Myers TG， Andrews DT， Scudiero DA， Eisen MB， Sausville EA， PommierY， Botste

21、in D， Brown PO， Weinstein JN， 自然遗传， 2000， 24， 236-44)， 还有其它报 导 . 0009 并且还有几篇报导， 通过类似地使用一种 DNA 微阵列 ( 部分是使用滤膜的大型阵 列 ) 检测了使抗癌药剂对肿瘤细胞起作用时出现的基因表达改变 (Rhee CH， Ruan S， Chen S， Chenchik A， Levin VA， YungAW， Fuller GN， Zhang W， 肿瘤学报导， 1999， 6， 393-401 ； Zimmermann J， Erdmann D， Lalande， Grossenbacher R， Noor

22、aniM， Furst P， 癌基因， 2000， 19， 2913-20 ； Kudoh K， Ramanna M， Ravatn R， Elkahloun AG， Bittner ML， Meltzer PS， Trent JM， Dalton WS， Chin KV， 癌研究， 2000， 4161-6). 这些报导表明， 在比较二个或更多细胞群 的特征时， 以及在以分子水平综合研究药物治疗等因素引起的细胞生物学改变时， 分析基 因表达变异是非常有用的 . 发明内容 ： 0010 本发明的目的是， 在使 E7070 及其相关化合物对肿瘤细胞起作用的情况下， 为这 些化合物的抗肿瘤作用提供

23、替代性标志 . 0011 本发明人借助于 DNA 微阵列法， 分析了在使 E7070 及其相关化合物作用于对这些 抗癌药剂敏感的肿瘤细胞时引起的基因表达改变， 并发现了由这些抗瘤药剂共同引起的基 因表达改变 . 0012 进而他们还发现， 在这些基因中， 存在显示出三种癌共有的表达改变的基因， 并发 说 明 书 CN 101054604 B3/26 页 7 现这些基因的表达改变， 可以为 E7070 及其相关化合物的抗肿瘤作用用作替代性标志， 至 此完成了本发明 . 0013 本发明提供了如下内容 . 0014 1. 一种试验肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法， 它包括 ： 0015 1) 测定

24、肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一种或几种基因的表达水平， 该肿 瘤细胞是从以如下通式 (I) 表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的 ： 0016 0017 其中 A 代表单环或双环芳香族环， 它可被取代， B 代表 6 元不饱和烃环， 或者是含 有 1 个氮原子作为杂原子的 6 元不饱和杂环， 此二种环都可被取代， 0018 C 代表含有 1 个或 2 个氮原子的 5 元杂环， 它可被取代， 0019 W 代表一个单键或 -CH CH-， 0020 X 代表 -N(R1)- 或氧原子， 0021 Y 代表碳原子或氮原子， 0022 Z 代表 -N(R2)- 或氮原子， 以及 0023

25、 R1和 R2可以相同或者不同， 各代表一个氢原子或低级烷基， 以及 0024 2) 与用该抗癌药剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较， 当列举于表 3 中的一种或几种基因的表达水平提高时， 或者当列举于表 4 中的一种或几种 基因的表达水平降低时， 可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的 . 0025 2. 一种试验肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法， 它包括 ： 0026 1) 使抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞， 该抗癌药剂可用如下通式 (I) 表示 ： 0027 0028 其中 A 代表单环或双环芳香族环， 它可被取代， B 代表 6 元不饱和烃环， 或者是含 有

26、1 个氮原子作为杂原子的 6 元不饱和杂环， 此二种环都可被取代， 0029 C 代表含有 1 个或 2 个氮原子的 5 元杂环， 它可被取代， 0030 W 代表一个单键或 -CH CH-， 0031 X 代表 -N(R1)- 或氧原子， 0032 Y 代表碳原子或氮原子， 0033 Z 代表 -N(R2)- 或氮原子， 以及 说 明 书 CN 101054604 B4/26 页 8 0034 R1和 R2可以相同或者不同， 各代表一个氢原子或低级烷基， 0035 2) 测定肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一种或几种基因的表达水平， 以及 0036 3) 与未被处理的肿瘤细胞的基因

27、表达水平相比较， 当列举于表 3 中的一种或几种 基因的表达水平提高时， 或者当列举于表 4 中的一种或几种基因的表达水平降低时， 可确 定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的 . 0037 3.根据1或2的方法， 其中是使用DNA微阵列， 通过定量一种或几种RNA来测定一 种或几种基因的表达水平， 此 RNA 是该一种或几种基因的转录产物 . 0038 4.根据1或2的方法， 其中是借助于定量PCR法， 通过定量一种或几种RNA来测定 一种或几种基因的表达水平， 此 RNA 是该一种或几种基因的转录产物 . 0039 5.一种用于定量RNA的试剂， 该RNA在4中规定的方法中使用， 所述试剂包含与

28、此 RNA 互补的寡核苷酸作为成分 . 0040 6.根据1或2的方法， 其中是借助于免疫化学方法， 通过定量一种或几种蛋白质来 测定一种或几种基因的表达水平， 此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物 . 0041 7. 根据 6 的方法， 其中是借助于酶联免疫吸附测定法， 通过定量一种或几种蛋白 质来测定一种或几种基因的表达水平， 此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物 . 0042 8. 根据 6 的方法， 其中是借助于蛋白质印迹试验， 通过定量一种或几种蛋白质来 测定一种或几种基因的表达水平， 此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物 . 0043 9. 一种用于在 6 中所规定方法的免疫检测试

29、剂， 它包含一种针对所述蛋白质的抗 体作为成分 . 0044 10. 根据 1 或 2 的方法， 其中 A 代表可被取代的苯或吡啶， B 代表可被取代的苯， C 代表可被取代的吡咯， W 代表一个单键， 以及 X 和 Z 都代表 -NH-。 0045 附图简述 ： 0046 图 1 显示使用 E7070 得到的， 细胞株 HCT116-C9， HCT116-C9-C1， LX-1 和 LX-1-E2 的细胞生长抑制曲线 . 0047 图 2 显示借助于定量 PCR 法对 E7070 敏感株 HCT116-C9 的基因表达变异的分析结 果 . 0048 图 3 显示借助于定量 PCR 法对 E7

30、070 敏感株 LX-1 的基因表达变异的分析结果 . 0049 图 4 显示借助于定量 PCR 法对 E7070 抗性株 HCT116-C9-C1 的基因表达变异的分 析结果 . 0050 图 5 显示借助于定量 PCR 法对 E7070 抗性株 LX-1-E2 的基因表达变异的分析结 果 . 0051 实施本发明的最佳方式 ： 0052 随后将详细论述本发明的实施方案 . 0053 本发明的试验方法其特征在于， 当肿瘤细胞以体内或体外试验被暴露于抗癌药剂 时， 将所引起的肿瘤细胞中基因的表达水平改变用作该肿瘤细胞对该抗癌药剂敏感性的指 标 . 0054 因此， 本发明第一个实施方案的试验方

31、法包括如下步骤， 1) 测定选自列举于表 3 和表 4 中肿瘤细胞的一种或几种基因的表达水平， 该肿瘤细胞是从以通式 (I) 表示的抗癌 药剂治疗的癌症病人采集的， 以及 2) 与用该抗癌药剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞 说 明 书 CN 101054604 B5/26 页 9 的基因表达水平相比较， 当列举于表 3 中的一种或几种基因的表达水平提高时， 或者当列 举于表 4 中的一种或几种基因的表达水平降低时， 可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感 的 . 0055 更进一步地， 本发明第二实施方案的试验方法包括如下步骤， 1) 使以通式 (I) 表 示的抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细

32、胞， 2) 测定肿瘤细胞中选自列举于表 3 和表 4 中的一种或几种基因的表达水平， 以及 3) 与未被治疗的肿瘤细胞的基因表达水平相比 较， 当列举于表3中的一种或几种基因的表达水平提高时， 或者当列举于表4中的一种或几 种基因的表达水平降低时， 可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的 . 0056 用于本发明的抗癌药剂是一种以通式 (I) 表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物 . 0057 通式 (I) 中， 以 A 表示的 “可被取代的单环或双环的芳香族环” 是芳香烃环或者 是含有至少一个氮、 氧和硫原子的芳香杂环， 其每种环上可有 1-3 个取代基 . 包含在环 A 中的这类芳香族环的实例包

33、括 ： 吡咯、 吡唑、 咪唑、 噻吩、 呋喃、 噻唑、 噁唑、 苯、 吡啶、 嘧啶、 吡嗪、 哒嗪、 萘、 喹啉、 异喹啉、 2， 3- 二氮杂萘、 1， 5- 二氮杂萘、 喹喔啉、 喹唑啉、 肉啉、 吲哚、 异吲哚、 中氮茚、 吲唑、 苯并呋喃、 苯并噻吩、 苯并噁唑、 苯并咪唑、 苯并吡唑、 苯并噻唑等 等。它们可有 1-3 个取代基 . 当存在二个以上取代基时， 它们可以相同或不同 . 取代基的 实例包括 ： 可被低级烷基或低级环烷基取代的氨基 ； 低级烷基 ； 低级烷氧基 ； 羟基 ； 硝基 ； 巯基 ； 氰基 ； 低级硫代烷基 ； 卤素 ； 以化学式 -a-b 表示的基团 其中 a

34、代表单键， -(CH2) k-， -O-(CH2)k-， -S-(CH2)k- 或 -N(R 3)-(CH 2)k-(k 是 1-5 的整数， R 3 代表一个氢原子或低级 烷基 )， b 代表 -CH2-d( 其中 d 代表可被低级烷基取代的氨基， 卤素， 羟基， 低级硫代烷基， 氰基或低级烷氧基 ) ； 以化学式 -a-e-f 表示的基团 其中 a 具有同上规定的含义， e 代 表 -S(O)- 或 -S(O)2-， f 代表可被低级烷基或低级烷氧基取代的氨基， 低级烷基， 三氟甲 基， -(CH2)m-b 或 -N(R4)-(CH2)m-b( 其中 b 具有同上规定的含义， R4代表一个

35、氢原子或低 级烷基， m 是 1-5 的整数 ) ； 以化学式 -a-g-h 表示的基团 其中 a 具有同上规定的含 义， g 代表 -C(O)- 或 -C(S)-， h 代表可被低级烷基取代的氨基， 羟基， 低级烷基， 低级烷氧 基， -(CH2)。-b 或 -N(R5)-(CH2)。-b( 其中 b 具有同上规定的含义， R5代表一个氢原子或低 级烷基， n 是 1-5 的整数 ) ； 以化学式 -a-N(R6)-g-i 表示的基团 其中 a 和 g 具有同上规 定的含义， R6代表一个氢原子或低级烷基， i 代表一个氢原子， 低级烷氧基或 f(f 具有同上 规定的含义 ) ； 以化学式

36、-a-N(R7)-e-f 表示的基团 ( 其中 a， e 和 f 具有同上规定的含义， R7代表一个氢原子或低级烷基 ) ； 以及以化学式 -(CH2)p-j-(CH2)q-b 表示的基团 ( 其中 j 代 表一个氧原子或硫原子， b 具有同上规定的含义， p 和 q 可以相同或不同， 各代表 1-5 的整 数 ) 等等 . 0058 当取代基是一个以二个烷基取代的氨基时， 此二个烷基可能结合形成 5- 或 6- 元 环.并且， 为A是带有羟基或巯基的含氮杂环时， 这些基团通过共振可能以氧代基团或硫代 基团的形式存在 . 0059 以 B 表示的 “可被取代的 6- 元不饱和烃环或含有 1 个

37、氮原子作杂原子的 6- 元不 饱和杂环” ， 指的是可被部分氢化的苯或吡啶 . 在这种环上可有 1 个或 2 个取代基， 当存在 二个取代基时， 它们可以相同或不同 . 0060 以 C 表示的 “可被取代的含有 1 个或 2 个氮原子的 5- 元杂环” ， 指的是可被部分氢 化的吡咯， 吡唑或咪唑 . 在这种环上可有 1 个或 2 个取代基， 当存在二个取代基时， 它们可 说 明 书 CN 101054604 B6/26 页 10 以相同或不同 . 0061 环 B 和 C 可能具有的取代基包括例如 ： 卤素 ； 氰基 ； 低级烷基 ； 低级烷氧基 ； 羟基 ； 氧基 ； 以化学式 -C(O

38、)-r 表示的基团 ( 其中 r 代表氢原子， 可被低级烷基取代的氨基， 低级 烷基， 低级烷氧基或羟基 ) ； 被低级烷基取代的氨基 ； 以及三氟甲基等 . 0062 在通式(I)， 以R1和R2限定的低级烷基以及环A、 B和C可具有的取代基， 指的是具 有 1-6 个碳原子的线性或支链烷基， 其例子包括 ： 甲基， 乙基， 正丙基， 异丙基， 正丁基， 异丁 基， 仲丁基， 叔丁基， 正戊基， 异戊基， 新戊基， 叔戊基， 1- 甲基丁基， 2- 甲基丁基， 1， 2- 二甲 基丙基， 正己基， 异己基， 1- 甲基戊基， 2- 甲基戊基， 3- 甲基戊基， 1， 1- 二甲基丁基， 1，

39、 2- 二 甲基丁基， 2， 2- 二甲基丁基， 1， 3- 二甲基丁基， 2， 3- 二甲基丁基， 3， 3- 二甲基丁基， 1- 乙 基丁基， 2- 乙基丁基， 1， 1， 2- 三甲基丙基， 1， 2， 2- 三甲基丙基， 1- 乙基 -1- 甲基丙基， 以及 1- 乙基 -2- 甲基丙基等 . 其中优选的是甲基， 乙基， 正丙基， 异丙基， 正丁基和异丁基， 而最 优选的是甲基， 乙基， 正丙基和异丙基 . 0063 在 A 环可能具有的取代基限定中所叙述的低级环烷基， 指的是具有 3-8 个碳原子 的环烷基， 其实例包括环丙基， 环戊基和环己基等 . 0064 在 A， B 和 C

40、环可能具有的取代基限定中所叙述的低级烷氧基， 指的是从上述低级 烷基衍生的烷氧基， 例如甲氧基， 乙氧基， 正丙氧基， 异丙氧基， 正丁氧基， 异丁氧基和叔丁 氧基.其中甲氧基和乙氧基是最优选的.低级硫代烷基指的是从上述低级烷基衍生的硫代 烷基 . 此外， 卤素的实例包括氟、 氯和溴等 . 0065 以通式(I)表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物可同酸或碱形成盐.用于本发明 的抗癌药剂也包括以通式 (I) 表示的化合物的盐 . 与酸所形成盐的实例包括与无机酸的 盐例如盐酸盐， 氢溴酸盐和硫酸盐， 与有机酸例如乙酸， 乳酸， 琥珀酸， 富马酸， 马来酸， 柠檬 酸， 苯甲酸， 甲磺酸和对甲苯磺酸的

41、盐， 与碱所形成盐的实例包括与无机碱的盐例如钠盐， 钾盐和钙盐， 以及与有机碱例如三乙胺， 精氨酸和赖氨酸的盐。 0066 不用说， 该化合物包括这些化合物的水合物和光学异构体， 如果它们存在 . 用于 本发明的抗癌药剂显示出高度抗肿瘤活性， 并且该抗癌药剂还包括在体内经过代谢作用如 氧化， 还原， 水解和共轭结合而表现出抗肿瘤活性的化合物 . 此外， 用于本发明的抗癌药剂 还包括在体内经过代谢作用如氧化、 还原和水解而形成以通式 (I) 所表示化合物的那些化 合物 . 0067 测定其敏感性的肿瘤细胞并不特别局限， 只要它们对以通式 (I) 表示的抗癌药剂 是敏感的 . 其实例包括从如下肿瘤

42、获得的肿瘤细胞 ： 结肠癌， 肺癌， 乳腺癌， 白血病， 胰腺 癌， 肾癌， 黑素瘤， 恶性淋巴瘤， 头部和颈部癌， 以及胃癌等 . 0068 从癌症病人采集的肿瘤细胞， 包括包含在从该癌症病人分离出的癌组织中的肿瘤 细胞 . 0069 在第一实施方案的试验方法中， 从癌症病人采集的肿瘤细胞， 可以是从用通式 (I) 表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的肿瘤细胞， 在此是用可以测定该肿瘤细胞敏感性的 剂量进行治疗 . 通常使用从以 100-1500mg 剂量治疗 1-14 天的癌症病人采集的肿瘤细胞 . 0070 在第二实施方案的试验方法中， 只要可以测定肿瘤细胞的敏感性， 用于使通 式 (I)

43、 表示的抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞的条件不受限制， 通常在含有 0.01-10M 浓度该抗癌药剂的培养基中实施培养 6-72 小时 . 说 明 书 CN 101054604 B7/26 页 11 0071 通过定量作为基因转录产物的 RNA 或者定量作为基因产物的蛋白质， 可以测定基 因表达水平 . 通常， 通过从肿瘤细胞中提取 RNA 或蛋白质并定量测定提取物中的 RNA 或蛋 白质， 可以对此 RNA 或蛋白质作定量分析 . 随后， 如下实例 ： 1.RNA 或蛋白质的提取， 2.RNA 的定量， 3. 蛋白质的定量， 将按此顺序加以详细说明 . 0072 1.RNA 或蛋白质

44、的提取 0073 1) 从以通式 (I) 表示的抗癌药剂治疗的病人癌组织中提取 RNA 或蛋白质 . 0074 通过活组织检查或类似方法从以通式 (I) 表示的抗癌药剂治疗的病人采集癌组 织， 然后通过下述方法从癌组织中提取 RNA 或蛋白质 . 0075 可按照通常的RNA提取法提取RNA.例如， 可通过使用TRIZOL试剂(东方生命技术 公司 ) 或类似试剂， 按照所附的操作手册进行提取 . 具体地说， 以每 50-100mg 癌组织 /1ml TRIZOL 试剂， 用 Teflon 匀浆器将癌组织作成匀浆 . 离心此混合液 (4， 12000 xg， 10 分 钟)， 将所得到的上清液在

45、室温下放置5分钟， 然后对每1ml所使用的TRIZOL试剂加入氯仿 0.2ml. 通过震摇强烈地搅拌所形成的溶液 15 秒， 在室温下放置 2-3 分钟， 然后离心 (4， 12000 xg， 15 分钟 ). 离心之后将含水层转移至另一试管， 并对每 1ml 所使用的 TRIZOL 试剂 加入异丙醇 0.5ml. 将此混合液在室温下放置 10 分钟后离心 (4， 12000 xg， 10 分钟 ). 用 75乙醇洗涤所得到的沉淀物， 空气干燥后可作为总 RNA 用于随后的操作 . 0076 可按照在如下著作中所叙述的方法从癌组织中提取蛋白质 ： Bollag.D.M.， Rozycki， M

46、.D， Edelstein S.J， 蛋白质方法， 1996， Wiley-Liss， 公司 New York， U.S.A ； Walker， J.M， 蛋白质手册， 1996， Humana 出版社， New Jersey， USA， ； 以及其它 . 0077 2) 从存在通式 (I) 所表示的抗癌药剂时培养的癌细胞中提取 RNA 或蛋白质 . 0078 按常规方法通过活组织检查或类似途径从病人获得的癌组织中分离出癌细胞 ( 肿癌细胞 ). 例如， 按照 Hamburger 等的方法 (HamburgerA， Salmon S.E， Kim M.B， Trent J.m， Soehnle

47、n B.J， Alberts D.S 和 Schmidt H.T. 癌研究 38， 3438-3443， 1978)， 先无菌绞 碎获得的组织， 然后通过使用不锈钢网， 注射针， 尼龙网等制备细胞悬液 . 将获得的细胞在 适当的培养基 ( 例如含有 10-15胎牛血清 (FCS) 的 RPMI-1640， MEM， McCoy 培养基等 ) 中 培养 . 在 5 CO2的条件下， 在有通式 (I) 所表示的抗癌药剂存在时， 将获得的癌细胞 37 培养适当的时间， 优选的是 3， 6， 12 或 24 小时， 更优选的是 12 小时， 然后通过下述方法提取 RNA 或蛋白质。并且还可以通过采用软

48、琼脂培养法， 只从借助活组织检查或类似途径获得 的组织中特异性地分离出癌细胞供使用(Hamburger A， 和Salmon S.E.科学197， 461-463， 1977 ； Hamburger A， 和 Salmon S.E. 临床研究杂志 60， 846-854， 1977 ； VonHoff D.D. 和 Johnson.G.E， 美国癌症研究协会报告 20， 51， 1979)。 0079 可以按照通常的 RNA 提取法， 像从癌组织中提取 RNA 一样从癌细胞中提取 RNA. 例 如， 当使用 TRIZOL 试剂 ( 东方生命技术公司 ) 时， 可按照所附的操作手册进行提取。具体

49、 地说， 每 5-10106个癌细胞加入 1ml TRIZOL 试剂， 然后可以像从癌组织中提取 RNA 一样 进行同样的操作 . 0080 也可以按照文献中所述的方法， 像从癌组织中提取一样实施从癌细胞中提取蛋白 质 . 0081 2.RNA 的定量 0082 借助于 RNA 印迹分析， DNA 微阵列分析， RT-PCR 和定量 PCR 等技术可对 RNA 作定量 说 明 书 CN 101054604 B8/26 页 12 分析 . 优选的是使用 DNA 微阵列或定量 PCR. 下面将对这些技术进行说明， 但是本发明并不 局限于这些技术 . 0083 按如下所述通过使用 DNA 微阵列进行定量 . 首先， 通过使用所获得的 RNA 作模板， 并使用 SuperScript 选择系 ( 东方生命技术公司 ) 和 T7-d(T)24引物合成双链 cDNA. 随后， 通过使用此 cDNA 作模板合成生物素化的 cRNA. 0084 更具体地说， 首先通过使用 T7-d(T)24引物从所获得的 RNA 合成单链 DNA. 然后对 其加入 dNTP， DNA 连接酶， DNA 聚合酶 I 和 RNA 酶 H， 使它们起反应， 并且对其再加入 T4DNA 聚合酶I以便完成双链cDNA的合成.先纯化所获得的cDNA， 然后通过使用RNA转录标记试 剂