一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611258311.3 (22)申请日 2016.12.30 (71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二条1 号 (72)发明人 韩业君邱卫华 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋侯桂丽 (51)Int.Cl. C12P 7/24(2006.01) C07C 45/78(2006.01) C07C 47/58(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种酶解木

2、质素液化及其产物制备香兰素 的方法 (57)摘要 本发明提供了一种酶解木质素液化及其产 物制备香兰素的方法， 包括以下工艺步骤： 1)酶 解木质素的制备： 经酶及生物降解后的木质纤维 素原料酶解残渣以适当溶剂在温和条件下提取 制备得到酶解木质素； 2)酶解木质素的微生物降 解液化； 将酶解木质素作为发酵基质之一， 进行 酶解木质素的微生物降解液化， 降解产物经固液 分离得到液体产物， 该液体产物中富含多种芳香 醛； 3)步骤2)中的芳香醛混合物经过酸化、 萃取、 浓缩、 精馏、 结晶等步骤制备香兰素。 本发明所提 供的技术将有助于实现木质素温和、 快速、 绿色 降解， 同时由木质素液化产物直接

3、制备香兰素， 可以避免使用苯等有毒有害有机溶剂， 显著提高 了来源于木质素香兰素产品的安全性和应用范 围。 权利要求书1页 说明书5页 CN 108265086 A 2018.07.10 CN 108265086 A 1.本发明所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 包括如下步骤： 1)酶解木质素的制备： 经酶及生物降解后的木质纤维素原料酶解残渣以适当溶剂在温 和条件下提取制备得到酶解木质素； 2)酶解木质素的微生物降解液化； 将酶解木质素作为发酵基质之一， 在适当的条件下 进行酶解木质素的微生物降解液化， 降解产物经固液分离得到液体产物， 该液体产物中富 含多种芳香醛； 3)酶解

4、木质素降解产物制备香兰素： 步骤2)中的芳香醛混合物经过酸化、 萃取、 浓缩等 步骤制备香兰素。 2.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于步骤1)所述的木质纤维素原料酶解残渣提取制备酶解木质素的方法为： 酶解残渣以1.5- 5倍(w/w)的0.2-2.0(w/w)稀碱液调节pH至12以上， 调节温度100150， 保持212h 使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后固液分离得到含酶解木质素的溶液， 此溶液调节pH 至2-3.5， 室温静置使木质素充分沉降析出； 液固分离、 洗涤、 干燥后得到酶解木质素。 3.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物

5、制备香兰素的方法， 其特征在 于步骤1)所述的酶解木质素来源于甘蔗渣、 玉米秸秆、 麦秆、 稻秆、 木屑、 竹子。 4.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于步骤2)所述的酶解木质素在微生物发酵培养基中的添加量为0.5-2.5。 5.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于步骤2)所述的降解酶解木质素的微生物包括嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophile DSM 1799)、 灵芝菌(Ganoderma lucidum 5.0026)、 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysos

6、porium Burdsall ATCC 24725)。 6.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于嗜热毁丝菌降解酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木质素 为培养基， 灭菌， 冷却， 接种嗜热毁丝菌， 在50培养箱中以200rpm振荡培养5d。 7.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于灵芝菌降解酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木质素为培 养基， 灭菌， 冷却， 接种嗜热毁丝菌， 在25培养箱中以200rpm振荡培养14d。 8.根据权利要求1所述的一种酶解

7、木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于黄孢原毛平革菌降解酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木 质素为培养基， 灭菌， 冷却， 接种黄孢原毛平革菌， 在28-30培养箱中以200rpm振荡培养 5d。 9.根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于步骤3)所述的芳香醛混合物制备香兰素的方法为： 将步骤2)得到的芳香醛混合物以有机 溶剂萃取3-5次， 合并萃取液， 在40-60减压浓缩至干燥； 在干燥的混合物中加入10-50 (w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入10(w/w)的氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心收集溶液， 在

8、40-60进行减压浓缩至干燥， 然后以0.01-0.1MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收集 馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 10.根据权利要求6所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在 于所述的芳香醛混合物萃取有机溶剂包括三氯甲烷、 乙酸乙酯、 乙醚等。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108265086 A 2 一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法 【技术领域】 0001 本发明属于木质纤维素生物质的高附加值资源化利用领域， 特别涉及一种酶解木 质素液化及其产物制备香兰素的方法。 【背景技术】 0002 随着人类社会的发展，

9、资源危机和环境污染问题已成为人类社会面临的两大挑 战。 生物质作为自然界最丰富的可再生资源， 其开发和利用的重要性正逐渐被人们所认识， 并被作为化学工业的基础原料受到了全世界的关注。 木质素是生物质中含量仅次于纤维素 的第二大天然高分子化合物， 也是自然界中唯一能提供可再生芳基的化合物的非石油资 源。 它主要存在于造纸工业废水和农业废弃物中。 过去的几十年中， 人们已经发现木质素是 一种非常有潜力和前景的可再生资源。 木质素种类繁多， 性质各异。 不同木质素其利用途径 也不相同。 在众多木质素中， 酶解木质素是在相对温和的状态下从木质纤维素原料生物转 化残渣中获得的， 它们没有经过碱或亚硫酸盐

10、的蒸煮， 较好地保留了木质素的化学活性,比 碱木质素、 木素磺酸盐等含有更多的木质素成分。 因此， 相对于其他方法制备的木质素， 酶 解木质素具有更加广泛的应用前景和具有良好的经济价值。 0003 随着研究的深入， 木质素水解、 氢解或者酶解的产物中， 含有具有羟基、 甲氧基、 醛 基、 羧基和烷基等官能团的芳香族化合物， 如愈创木酚、 香草醛等。 如近来报道的通过催化 加氢脱氧的转化路径， 选择性的将C-O键断裂， 以实现木质素降解单体单一芳香类化合物的 富集。 木质素通过热解或者催化液化可以得到愈创木酚、 丁香酚等酚类化合物， 得到的酚类 化合物自身不仅是一种重要的精细化学品， 而且可以进

11、一步加氢制备环己醇或环己酮等精 细化工中间体。 随着研究的深入， 木质素降解产物的高值化利用已有部分工业生产， 但很多 反应的过程还处于摸索阶段， 至今木质素的工业利用率还比较低， 这无疑是一种极大的浪 费。 因此， 寻找木质素高效降解途径和方法， 实现木质素的资源化工业应用仍然是各国学者 研究的焦点。 0004 香兰素(Vanillin,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)主要存在于天然植物香荚兰中,是世 界上最重要的香料之一， 它独特的无法用人工方法复合而成的香气,使其被广泛应用于化 工、 轻工、 纺织印染、 食品、 服装、 家电、 烟草等行业。 目前， 香兰素全球每年的需求量超过16 000t。

12、 市场上供应的香兰素有两种， 即合成香兰素和天然香兰素。 从天然植物中提取香兰素 不仅数量少而且成本高， 难以满足市场需求。 目前人们使用的香兰素主要有化学合成法获 得， 以林业废料、 造纸废液、 酒糟浓缩物等为原料的木质素法是合成香兰素最有前景的方法 之一。 据统计,现今市场上约90的香兰素产品是利用化学合成法生产的， 其原料主要是木 质素和愈创木酚。 以木质素为原料生产香兰素主要是以木质素磺酸盐为原料,在碱性条件 下水解再经氧化得到香兰素。 其传统的香兰素产品制备过程中需要大量有毒有害的有机溶 剂， 例如苯及甲苯等， 这使所得香兰素产品应用范围受打击大的限制。 因此， 本专利旨在提 供一种

13、绿色环保的酶解木质素生物液化并从液化产物中提取制备香兰素的方法。 说明书 1/5 页 3 CN 108265086 A 3 【发明内容】 0005 【发明目的】 0006 本发明旨在提供一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法。 这一发明将有 助于实现木质素的温和、 快速、 绿色降解， 同时由木质素液化产物直接制备香兰素， 可以避 免使用苯等有毒有害有机溶剂， 显著提高了来源于木质素香兰素产品的安全性和应用范 围。 0007 【本发明的技术方案】 0008 本发明所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 包括如下步骤： 0009 1)酶解木质素的制备： 经酶及生物降解后的木质纤维素

14、原料酶解残渣以适当溶剂 在温和条件下提取制备得到酶解木质素； 0010 2)酶解木质素的微生物降解液化； 将酶解木质素作为发酵基质之一， 在适当的条 件下进行酶解木质素的微生物降解液化， 降解产物经固液分离得到液体产物， 该液体产物 中富含多种芳香醛； 0011 3)酶解木质素降解产物中香兰素的制备： 步骤2)中的芳香醛混合物经过酸化、 萃 取、 浓缩等步骤制备香兰素。 0012 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于步骤1)所述 的木质纤维素原料酶解残渣提取制备酶解木质素的方法为： 酶解残渣以1.5-5倍(w/w)的 0.2-2.0(w/w)稀碱液调节pH至12以上，

15、 调节温度100150， 保持212h使酶解残渣 中的木质素充分溶出； 然后固液分离得到含酶解木质素的溶液， 此溶液调节pH至2-3.5， 室 温静置使木质素充分沉降析出； 液固分离、 洗涤、 干燥后得到酶解木质素。 0013 本发明所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于步骤 1)所述的酶解木质素来源于甘蔗渣、 玉米秸秆、 麦秆、 稻秆、 木屑、 竹子。 0014 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于步骤2)所述 的酶解木质素在微生物发酵培养基中的添加量为0.5-2.5。 0015 根据权利要求1所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法

16、， 其特征 在于步骤2)所述的降解酶解木质素的微生物包括， 嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophile DSM 1799)、 灵芝菌(Ganoderma lucidum 5.0026)、 黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium Burdsall ATCC 24725)。 0016 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于嗜热毁丝菌 降解酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木质素为培养基， 灭 菌， 冷却， 接种嗜热毁丝菌， 在50培养箱中以200rpm振荡培养5d。 0017 所述的一种酶解

17、木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于灵芝菌降解 酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木质素为培养基， 灭菌， 冷 却， 接种嗜热毁丝菌， 在25培养箱中以200rpm振荡培养14d。 0018 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于黄孢原毛平 革菌降解酶解木质素的方法为： 以土豆汁培养基中加入0.5-2.5的酶解木质素为培养基， 灭菌， 冷却， 接种黄孢原毛平革菌， 在28-30培养箱中以200rpm振荡培养7d。 0019 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于步骤3)所述 说明书 2/5 页 4 CN 1

18、08265086 A 4 的芳香醛混合物制备香兰素的方法为： 将步骤2)得到的芳香醛混合物以有机溶剂萃取3-5 次， 合并萃取液， 在40-60减压浓缩至干燥； 在干燥的混合物中加入10-50(w/w)的无水 乙醇， 搅拌溶解后加入10(w/w)的氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心收集溶液， 在40-60进 行减压浓缩至干燥， 然后以0.01-0.1MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收集馏分， 并用乙 醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 0020 所述的一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 其特征在于所述的芳香 醛混合物萃取有机溶剂包括三氯甲烷、 乙酸乙酯、 乙醚等。 0

19、021 【本发明的优点】 0022 本发明旨在提供一种酶解木质素液化及其产物制备香兰素的方法， 具有如下优 点： 0023 1)采用本发明的技术方案， 以高效降解木质素的微生物实现酶解木质素的绿色温 和液化， 避免了大量化学试剂的使用， 并且降低了传统木质素液化所需要的高温高压等剧 烈条件； 0024 2)采用本发明的技术方案， 由木质素液化产物直接制备香兰素， 可以避免使用苯 等有毒有害有机溶剂， 显著提高了来源于木质素香兰素产品的安全性和应用范围。 0025 总之， 本发明所提供的技术方案将有助于解决从木质素制备香兰素的传统工艺中 存在的能耗高、 毒性大、 环境二次污染等问题。 0026

20、【具体实施方法】 0027 实施例1 0028 将甘蔗渣酶解残渣以1.5倍(w/w)1(w/w)NaOH溶液调节pH至12， 在100， 保温6h 使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后抽滤分离得到含酶解木质素的溶液， 将溶液调节pH 至2.5， 室温静置使木质素充分沉降析出； 然后抽滤收集固体、 洗涤、 干燥后得到酶解木质 素； 0029 以土豆汁培养基中加入1的蔗渣酶解木质素为培养基， 121灭菌20min， 冷却 后， 接种嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophile DSM 1799)， 在50培养箱中以200rpm 振荡培养5d， 收集液体降解产物即得多种芳香醛物质

21、的混合物； 0030 此芳香醛混合物以三氯甲烷萃取5次， 合并萃取液， 在50减压浓缩至干燥； 在干 燥的混合物中加入30(w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心 收集溶液， 在50进行减压浓缩至干燥， 然后以0.05MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收 集馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 按此方法所制备的香兰素相对 于木质素的得率为8.28， 纯度为93.6。 0031 实施例2 0032 将玉米秸秆酶解残渣以1倍质量(w/w)的1(w/w)NaOH溶液调节pH至12， 在120， 保温2h使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后抽滤

22、分离得到含酶解木质素的溶液， 将溶液 调节pH至3， 室温静置使木质素充分沉降析出； 然后抽滤收集固体、 洗涤、 干燥后得到玉米秸 秆酶解木质素； 0033 以土豆汁培养基中加入1.5的玉米秸秆酶解木质素为培养基， 121灭菌20min， 冷却后， 接种嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophile DSM 1799)， 在50培养箱中以 200rpm振荡培养5d， 收集液体降解产物即得多种芳香醛物质的混合物； 说明书 3/5 页 5 CN 108265086 A 5 0034 此芳香醛混合物以乙酸乙酯萃取3次， 合并萃取液， 在55减压浓缩至干燥； 在干 燥的混合物中加入1

23、0(w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心 收集溶液， 在55进行减压浓缩至干燥， 然后以0.01MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收 集馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 按此方法所制备的香兰素相对 于木质素的得率为5.92， 纯度为91.8。 0035 实施例3 0036 将竹子酶解残渣以5倍质量(w/w)的1(w/w)NaOH溶液调节pH至12， 在150， 保温 12h使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后抽滤分离得到含酶解木质素的溶液， 将溶液调节 pH至3， 室温静置使木质素充分沉降析出； 然后抽滤收集固体、 洗涤、 干燥后

24、得到木屑酶解木 质素； 0037 以土豆汁培养基中加入2的竹子酶解木质素为培养基， 121灭菌20min， 冷却 后， 接种黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Burdsall ATCC24725)， 在28-30 培养箱中以200rpm振荡培养7d， 收集液体降解产物即得多种芳香醛物质的混合物； 0038 此芳香醛混合物以三氯甲烷萃取5次， 合并萃取液， 在60减压浓缩至干燥； 在干 燥的混合物中加入50(w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心 收集溶液， 在60进行减压浓缩至干燥， 然后以0.01MPa氮气保护进行精馏， 在1

25、50-170收 集馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 按此方法所制备的香兰素相对 于木质素的得率为6.03， 纯度为92.6。 0039 实施例4 0040 将木屑酶解后的残渣以5倍质量(w/w)的1(w/w)NaOH溶液调节pH至13， 在150， 保温12h使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后抽滤分离得到含酶解木质素的溶液， 将溶液 调节pH至3， 室温静置使木质素充分沉降析出； 然后抽滤收集固体、 洗涤、 干燥后得到竹子酶 解木质素； 0041 以土豆汁培养基中加入2.5的木屑酶解木质素为培养基， 121灭菌20min， 冷却 后， 接种嗜热毁丝菌(Mycelio

26、phthora thermophile DSM 1799)， 在50培养箱中以200rpm 振荡培养5d， 收集液体降解产物即得多种芳香醛物质的混合物； 0042 此芳香醛混合物以三氯甲烷萃取5次， 合并萃取液， 在60减压浓缩至干燥； 在干 燥的混合物中加入30(w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心 收集溶液， 在60进行减压浓缩至干燥， 然后以0.05MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收 集馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 按此方法所制备的香兰素相对 于木质素的得率为8.24， 纯度为93.1。 0043 实施例5 0044

27、将麦草酶解残渣以3倍质量(w/w)的1(w/w)NaOH溶液调节pH至12， 在120， 保温 8h使酶解残渣中的木质素充分溶出； 然后抽滤分离得到含酶解木质素的溶液， 将溶液调节 pH至2.5， 室温静置使木质素充分沉降析出； 然后抽滤收集固体、 洗涤、 干燥后得到竹子酶解 木质素； 0045 以土豆汁培养基中加入0.5的竹子酶解木质素为培养基， 121灭菌20min， 冷却 后， 接种灵芝菌(Ganoderma lucidum 5.0026)， 在25培养箱中以200rpm振荡培养14d， 收 集液体降解产物即得多种芳香醛物质的混合物； 说明书 4/5 页 6 CN 108265086 A 6 0046 此芳香醛混合物以三氯甲烷萃取5次， 合并萃取液， 在50减压浓缩至干燥； 在干 燥的混合物中加入50(w/w)的无水乙醇， 搅拌溶解后加入氨水直至产生淡黄色沉淀； 离心 收集溶液， 在50进行减压浓缩至干燥， 然后以0.05MPa氮气保护进行精馏， 在150-170收 集馏分， 并用乙醇在60-80进行重结晶， 得到香兰素晶体。 按此方法所制备的香兰素相对 于木质素的得率为8.31， 纯度为91.4。 说明书 5/5 页 7 CN 108265086 A 7