基于ERICPCR指纹图谱的法医学个体识别方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710622265.9 (22)申请日 2017.07.27 (71)申请人 华东政法大学 地址 200042 上海市长宁区万航渡路1575 号 (72)发明人 刘耘汀孙大明 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限 公司 31204 代理人 郁旦蓉 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别 方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于ERIC-PCR

2、指纹图谱 的法医学个体识别方法， 包括如下步骤： 步骤S1， 采样获得现场细菌样品及涉案人员细菌样品； 步 骤S2， 对现场细菌样品及涉案人员细菌样品分别 进行细菌增殖培养， 并对增殖培养后的菌液进行 宏基因组提取， 分别得到现场细菌宏基因组以及 涉案人员细菌宏基因组； 步骤S3， 采用相同的引 物分别对现场细菌宏基因组及涉案人员细菌宏 基因组进行ERIC-PCR， 分别得到现场细菌宏基因 组所对应的现场细菌ERIC-PCR指纹图谱以及涉 案人员细菌宏基因组所对应的涉案人员细菌 ERIC-PCR指纹图谱； 步骤S4， 对现场细菌ERIC- PCR指纹图谱及涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱

3、进行比对， 鉴别现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及涉 案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱是否一致， 从而进 行个体识别。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 107287327 A 2017.10.24 CN 107287327 A 1.一种基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 用于对案件现场及涉案人员分 别进行取样及鉴别从而对涉案人员进行个体识别， 其特征在于， 包括如下步骤： 步骤S1， 在所述案件现场进行细菌采样获得现场细菌样品， 并对所述涉案人员的食指 部位进行细菌采样获得涉案人员细菌样品； 步骤S2， 对所述现场细菌样品及所述涉案人员细菌样品分别进行细菌增殖培养

4、， 并对 增殖培养后的菌液进行宏基因组提取， 分别得到所述现场细菌样品所对应的现场细菌宏基 因组以及所述涉案人员细菌样品所对应的涉案人员细菌宏基因组； 步骤S3， 采用相同的引物分别对所述现场细菌宏基因组及所述涉案人员细菌宏基因组 进行ERIC-PCR， 分别得到所述现场细菌宏基因组所对应的现场细菌ERIC-PCR指纹图谱以及 所述涉案人员细菌宏基因组所对应的涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱； 步骤S4， 对所述现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及所述涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱进 行比对， 鉴别所述现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及所述涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱是否 一致

5、， 从而进行所述个体识别。 2.根据权利要求1所述的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 其特征在于： 其中， 在步骤S3中， 所采用的所述引物为引物ERIC-F以及引物ERIC-R， 所述引物ERIC-F的序列为ATGTAAG CTCCTGGGGATTCAC， 所述引物ERIC-R的序列AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。 3.根据权利要求1所述的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 其特征在于： 其中， 在步骤S2中， 所述宏基因组提取包括如下步骤： 步骤S2-1， 取所述菌液3ml， 5000rpm离心10min， 弃上清， PBS缓冲液洗菌体沉淀3

6、次， 1mLPBS重悬后加入50mg/ml溶菌酶37孵育1h得到菌液孵育液I； 步骤S2-2， 向所述菌液孵育液I中依次加入100ul 10SDS溶液， 20mg/ml蛋白酶k， 55 孵育1h得到菌液孵育液II； 步骤S2-3， 向所述菌液孵育液II中加入1500ul 5mol/L NaCl溶液， 并用与该NaCl溶液 体积相等的酚:氯仿:异戊醇溶液抽提得到抽提液； 步骤S2-4， 向所述抽提液中加入2倍体积的无水乙醇使DNA沉淀， 离心获得沉淀的DNA并 用双蒸水溶解， 得到宏基因组DNA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107287327 A 2 基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学

7、个体识别方法 技术领域 0001 本发明属于司法鉴定领域， 涉及一种法医学个体识别方法， 具体涉及一种基于 ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法。 背景技术 0002 对犯罪分子现场留下的蛛丝马迹进行识别和追踪是刑事案件侦破的最常用手段 之一。 随着犯罪分子反侦察意识的增强， 传统的识别和鉴定方法如手印、 足迹等痕迹鉴定已 无法完全满足现代刑事侦查的要求。 0003 毛发、 血液、 软组织碎片等生物物证的DNA分析技术是近年来使用广泛、 成熟可靠 的物证鉴定技术， 被广泛运用于犯罪现场、 犯罪嫌疑人、 血缘关系确认等诸多侦查领域， 但 该技术对生物检材的质和量均有一定要求， 如果生物检

8、材质量较差， 则无法得出可靠的鉴 定结果。 0004 细菌作为最原始、 种类数量最庞大的客体， 是人体与生俱来的附属生物。 研究发 现， 细菌寄生人体具有一定的 “特异性” ， 即每个人可能具有独有的寄生细菌， 人和人之间的 菌群种类差别高达80-90。 0005 DNA指纹技术是指利用不同生物体中DNA序列的差异性， 建立起来的一种用于个体 识别、 遗传追溯的DNA条带图谱。 该技术自从20世纪70年代被提出后， 迅速运用于物种起源 进化、 肿瘤发生、 疾病诊断、 亲子鉴定、 法医鉴定等诸多领域。 ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Cons

9、ensus)是最早在肠道细菌中发现长度大约为124-127bp的高 度保守的DNA重复序列。 近年大量研究表明， 几乎所有细菌基因组均包括ERIC重复序列， 并 且该序列在不同细菌基因组的重复频次、 间隔等具有特异性。 在使用该序列的PCR引物进行 扩增后， 肠道中不同的细菌会出现特异性DNA条带图谱即ERIC-PCR指纹图谱， 这种指纹图谱 具有分辨率高、 敏感性高、 重复性高、 操作简便快速等诸多特点。 0006 上述细菌DNA图谱技术在多个领域均有应用， 但目前还未有将其运用于司法鉴定 的报道。 发明内容 0007 本发明的发明人发现， 人体接触过的环境中的细菌ERIC-PCR指纹图谱与

10、人体一些 部位采集得到的细菌ERIC-PCR指纹图谱具有高度特异性， 尤其是人体手指部位采集得到的 细菌ERIC-PCR指纹图谱具有尤其高的特异性。 0008 基于上述发现， 为了提供一种采用全新的生物检材来进行个体识别的方法， 本发 明提出了如下技术方案： 0009 本发明提供了一种基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 用于对案件现 场及涉案人员分别进行取样及鉴别从而对涉案人员进行个体识别， 其特征在于， 包括如下 步骤： 0010 步骤S1， 在案件现场进行细菌采样获得现场细菌样品， 并对涉案人员的食指部位 说明书 1/7 页 3 CN 107287327 A 3 进行细菌采

11、样获得涉案人员细菌样品； 0011 步骤S2， 对现场细菌样品及涉案人员细菌样品分别进行细菌增殖培养， 并对增殖 培养后的菌液进行宏基因组提取， 分别得到现场细菌样品所对应的现场细菌宏基因组以及 涉案人员细菌样品所对应的涉案人员细菌宏基因组； 0012 步骤S3， 采用相同的引物分别对现场细菌宏基因组及涉案人员细菌宏基因组进行 ERIC-PCR， 分别得到现场细菌宏基因组所对应的现场细菌ERIC-PCR指纹图谱以及涉案人员 细菌宏基因组所对应的涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱； 0013 步骤S4， 对现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱进行比 对， 鉴别

12、现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱是否一致， 从而进 行个体识别。 0014 本发明提供的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 还可以具有这样的 技术特征： 0015 其中， 在步骤S3中， 所采用的引物为引物ERIC-F以及引物ERIC-R， 0016 引物ERIC-F的序列为ATGTAAG CTCCTGGGGATTCAC， 0017 引物ERIC-R的序列AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。 0018 本发明提供的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 还可以具有这样的 技术特征： 0019 其中， 在步骤S2中， 宏

13、基因组提取包括如下步骤： 0020 步骤S2-1， 取菌液3ml， 5000rpm离心10min， 弃上清， PBS缓冲液洗菌体沉淀3次， 1mLPBS重悬后加入50mg/ml溶菌酶37孵育1h得到菌液孵育液I； 0021 步骤S2-2， 向菌液孵育液I中依次加入100ul 10SDS溶液， 20mg/ml蛋白酶k， 55 孵育1h得到菌液孵育液II； 0022 步骤S2-3， 向菌液孵育液II中加入1500ul 5mol/L NaCl溶液， 并用与该NaCl溶液 体积相等的酚:氯仿:异戊醇溶液抽提得到抽提液； 0023 步骤S2-4， 向抽提液中加入2倍体积的无水乙醇使DNA沉淀， 离心获得

14、沉淀的DNA并 用双蒸水溶解， 得到宏基因组DNA。 0024 发明作用与效果 0025 根据本发明提供的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法， 可以分别获得 涉案人员食指部位以及涉案现场所采集的细菌样品对应的ERIC-PCR指纹图谱， 对这些 ERIC-PCR指纹图谱进行比对即可初步实现涉案人员的个体识别及追踪， 为一些无法取得其 他检材的现场提供了的新的个体识别手段。 附图说明 0026 图1为本发明实施例一的宏基因组DNA检验结果的电泳图； 0027 图2为本发明实施例一的食指部位和手机屏幕细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR 结果电泳图； 0028 图3为本发明实施例一

15、的食指部位和个人桌面细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR 结果电泳图； 0029 图4为本发明实施例二的食指部位和环境细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR结果 说明书 2/7 页 4 CN 107287327 A 4 电泳图。 具体实施方式 0030 以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。 在下述实施例中所采用的试剂、 酶、 试剂盒及其他实验材料如无特殊说明均从一般商业途径获得， 未注明的实验条件均参照常 规实验条件或遵照供应商的建议条件。 0031 实施例一： 食指部位与接触物品的细菌样品的关联性考察 0032 本实施例的目的在于从志愿者食指部位及志愿者的接触物品(包括其使用的手机

16、 屏幕和个人桌面)上分别采样， 并考察这些部位所采集的样品的关联性。 0033 在本实施例中， 志愿者一共有10名， 男女各5名。 0034 本实施例的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法包括如下步骤： 0035 步骤S1， 在案件现场进行细菌采样获得现场细菌样品， 并对涉案人员的食指部位 进行细菌采样获得涉案人员细菌样品。 0036 在本实施例中， 志愿者作为模拟的涉案人员， 志愿者对应的手机屏幕及个人桌面 作为案件现场的一部分， 分别进行采样， 采样的方式为： 用灭菌PBS溶液湿润灭菌棉球， 根据 志愿者使用手机和鼠标习惯分别擦拭志愿者右手食指、 本人手机触摸屏以及个人桌面，

17、将 擦拭后的棉球放入标注好的LB(Luria-Bertani)培养基中37摇床过夜培养。 其中， LB培养 基配方如下:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L， 酵母提取物(Yeast extract)5g/L， 氯化钠(NaCl) 10g/L琼脂粉15g/L， 高灭菌后倒置固体平板培养基。 0037 上述采样得到的各个样品中， 食指部位的细菌样品即为涉案人员细菌样品， 手机 屏幕样品和个人桌面样品即为现场细菌样品。 0038 下述过程中， 男性志愿者用M代表， 其食指部位样品编号分别为Mf1-Mf5， 对应的手 机屏幕样品编号分别为Mp1-Mp5， 对应的个人桌面样品编分别号为Me1-Me5

18、。 女性志愿者用F 代表， 食指部位、 手机屏幕、 个人桌面的样品分别编号为Ff1-Ff5、 Fp1-Fp5、 Fe1-Fe5。 0039 步骤S2， 对现场细菌样品及涉案人员细菌样品分别进行细菌增殖培养， 并对增殖 培养后的菌液进行宏基因组提取， 分别得到现场细菌样品所对应的现场细菌宏基因组以及 涉案人员细菌样品所对应的涉案人员细菌宏基因组。 其中， 宏基因组的提取具体包括如下 子步骤： 0040 步骤S2-1， 取增殖培养后的菌液3ml， 5000rpm离心10min， 弃上清， PBS缓冲液洗菌 体沉淀3次， 1mLPBS重悬后加入50mg/ml溶菌酶37孵育1h得到菌液孵育液I； 00

19、41 步骤S2-2， 向菌液孵育液I中依次加入100ul 10SDS溶液， 20mg/ml蛋白酶k， 55 孵育1h得到菌液孵育液II； 0042 步骤S2-3， 向菌液孵育液II中加入1500ul 5mol/L NaCl溶液， 并用与该NaCl溶液 体积相等的酚:氯仿:异戊醇溶液抽提得到抽提液； 0043 步骤S2-4， 向抽提液中加入2倍体积的无水乙醇使DNA沉淀， 离心获得沉淀的DNA并 用双蒸水溶解， 得到宏基因组DNA。 0044 在本实施例中， 为了检验上述方法得到的宏基因组DNA的质量， 在提取宏基因组 DNA后还分别对其进行了检验。 检验采用琼脂糖凝胶电泳、 NANODROP

20、2000C分光光度计测定 OD260/280比值两种方法来进行。 说明书 3/7 页 5 CN 107287327 A 5 0045 图1为本发明实施例一的宏基因组DNA检验结果的电泳图。 0046 如图1所示， 所有采集到的志愿者宏基因组DNA均有较完整的全基因组条带。 另外， 经分光光度计分析， 所有DNA的OD260/280比值均在1.8-2.0之间， 说明DNA质量较好， 可用于 下一步ERIC-PCR实验。 0047 步骤S3， 采用相同的引物分别对现场细菌宏基因组及涉案人员细菌宏基因组进行 ERIC-PCR， 分别得到现场细菌宏基因组所对应的现场细菌ERIC-PCR指纹图谱以及涉案

21、人员 细菌宏基因组所对应的涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱。 0048 上 述 E R I C - P C R 过 程 中 所 采 用 的 引 物 包 括 ： 引 物 E R I C - F ， 序 列 为 ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC； 以及引物ERIC-R， 其序列AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。 0049 ERIC-PCR的反应参数如下： 95,2min； 94， 3s， 92,30s,50， 1min,65， 8min,30次循环； 658min。 0050 PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳后， 由凝胶成像系统采集图像。 0051 步骤S4， 对现场细菌

22、ERIC-PCR指纹图谱及涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱进行比 对， 鉴别现场细菌ERIC-PCR指纹图谱及涉案人员细菌ERIC-PCR指纹图谱是否一致， 从而进 行个体识别。 0052 图2为本发明实施例一的食指部位和手机屏幕细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR 结果电泳图。 图3为本发明实施例一的食指部位和个人桌面细菌样品宏基因组DNA的ERIC- PCR结果电泳图。 0053 图2中， 各泳道的对应关系为： M:DNA maker， 单数泳道为食指部位细菌样品， 偶数 泳道为手机屏幕细菌样品。 泳道1-2、 3-4、 5-6、 7-8、 9-10分别为五位男性志愿者的食指部位

23、和手机屏幕细菌样品。 11-12、 13-14、 15-16、 17-18、 19-20分别为五位女性志愿者的食指部 位和手机屏幕细菌样品。 另外， 图2中被同一个方框圈起的两个泳道的条带完全相同。 0054 如图2所示， 十名志愿者中有1名男性、 2名女性的食指部位和手机屏幕上的细菌 ERIC-PCR指纹图谱不一致。 0055 其中， 1名男性(7-8泳道)食指部位和手机屏幕上的DNA图谱只有一条有近似大小 的DNA条带， 而其余几个条带大小差别较大， 由此可知， 此名志愿者食指部位和手机屏幕上 的菌群可能只有部分一致。 而1名女性(11-12泳道)食指部位和手机屏幕上的菌群ERIC-PCR

24、 指纹图谱则完全不同， 甚至没有一个同样大小的条带。 也就是说， 此名志愿者食指细菌菌群 完全不一致。 0056 另外， 对上述两名不一致的志愿者食指部位和手机屏幕重复进行了三次样品采集 及ERIC-PCR， 其重复实验的结果与上述结果也完全相同。 0057 图3为本发明实施例一的食指部位和个人桌面细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR 结果电泳图。 0058 图3中， 各泳道的对应关系为： M:DNA maker， 单数泳道为食指部位细菌样品， 偶数 泳道为个人桌面细菌样品。 泳道1-2、 3-4、 5-6、 7-8、 9-10分别为五位男性志愿者的食指部位 和个人桌面细菌样品。 11-1

25、2、 13-14、 15-16、 17-18、 19-20分别为五位女性志愿者的食指部 位和个人桌面细菌样品。 另外， 图3中被同一个方框圈起的两个泳道的条带完全相同。 0059 如图3， 在十名志愿者中， 只有2名男性(1-2和9-10泳道)和一名女性(17-18泳道) 的食指部位和个人桌面上的ERIC-PCR DNA图谱完全相符， 而其它七名志愿者不完全相符。 说明书 4/7 页 6 CN 107287327 A 6 但图谱条带比对分析发现， 3-4、 5-6、 11-12、 13-14、 15-16、 19-20泳道中至少有一个条带大 小近似， 甚至大多数条带大小完全一致。 0060 实

26、施例一的作用与效果 0061 如上所述， 采用本实施例提供的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法获 得ERIC-PCR指纹图谱后， 由于接触物品(手机屏幕及个人桌面)与食指部位的细菌样品均存 在一定的对应关系， 并且其中手机屏幕的对应关系更为密切(10人中有7人是完全一致的)， 因此根据本实施例提供的方法对案件现场的接触物品进行取样即可初步实现涉案人员的 个体识别， 为一些无法取得其他检材的现场提供了的新的个体识别手段。 0062 另外， 从上述实施例可以看出， 人体的食指部位细菌样品与手机屏幕的细菌样品 也有无法完全对应的情况， 说明个人卫生习惯、 环境和其它微生物都可能对结果产

27、生影响， 因此在实际应用中， 准确、 细致、 多次取样极为关键。 0063 实施例二： 食指部位与周围环境的细菌样品的关联性考察 0064 本实施例的目的在于从志愿者食指部位及志愿者所停留过的环境中分别采样， 并 考察所采集的样品的关联性。 0065 在本实施例中， 对于与实施例一相同的步骤和方法， 省略相同的说明。 0066 在本实施例中， 志愿者一共有19名， 分别编号为F1-F19。 0067 其中， 对手指部位的采样方式与实施例一相同。 0068 对志愿者停留过的环境进行采用的过程为： 该19名志愿者首先在同一个会议室中 进行了会议， 在会议结束14小时后对该会议室进行了采样， 采集到

28、的样品包括会议桌面、 椅 子扶手处所采集的细菌样品19份， 公用电脑鼠标、 键盘、 门把手、 黑板擦采集的细菌样品4 份， 共计23份细菌样品作为环境细菌样品， 分别编号为1-23。 0069 上述采样得到的各个样品中， 19份食指部位的细菌样品即为涉案人员细菌样品， 23份环境细菌样品即为现场细菌样品。 0070 采用与实施例一相同的步骤及方法对上述各个样品进行细菌增殖培养、 宏基因组 提取、 ERIC-PCR， 获得对应的各ERIC-PCR指纹图谱。 0071 在本实施例中， 为了确认条带一致的宏基因组DNA的序列是否也一致， 在获得上述 ERIC-PCR指纹图谱后还进行了DNA测序， 结

29、果后述。 0072 图4为本发明实施例二的食指部位和环境细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR结果 电泳图。 0073 图4中， 图4(A)为19份食指部位的细菌样品， 图4(B)为23份环境细菌样品。 图4(A) 中， 不同泳道的箭头下方数字为与该泳道一致的图4(B)的泳道编号。 0074 如图4所示， 19个人中， 有13人个人的食指部位ERIC-PCR指纹图谱的DNA片段条带 数、 条带大小， 和其本人曾经使用过的办公桌桌面采集细菌的ERIC-PCR指纹图谱完全吻合。 0075 另外， 根据DNA的测序结果， ERIC-PCR指纹图谱完全吻合的宏基因组DNA之间， 其扩 增条带的序列也

30、是完全吻合的。 其ERIC-PCR指纹图谱的一致关系、 扩增条带序列的一致关 系见下表1： 0076 表1： 食指部位和环境细菌样品宏基因组DNA的ERIC-PCR图谱及其扩增条带序列的 一致关系 说明书 5/7 页 7 CN 107287327 A 7 0077 0078 0079 实施例二的作用与效果 0080 如上所述， 采用本实施例提供的基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法获 得的ERIC-PCR指纹图谱中， 志愿者的食指部位及志愿者停留环境的细菌样品存在一定的对 应关系， 并且ERIC-PCR指纹图谱相一致的细菌样品中， 扩增条带的序列也完全一致， 说明只 要二者的ERI

31、C-PCR指纹图谱一致， 则其扩增条带也完全一致， 能够证明两个细菌样品中的 菌群相同。 0081 进一步， ERIC-PCR指纹图谱相一致的细菌样品中， 扩增条带的序列也完全一致， 说 明只需要进行ERIC-PCR即可找出相同的细菌样品， 因此与需要进行测序的传统DNA方法相 比， 本实施例的方法更加快速简便。 0082 如表1所示， 19名志愿者中， 只有6人(F1、 F3、 F5、 F12、 F13、 F16)的指纹图谱， 在23份 说明书 6/7 页 8 CN 107287327 A 8 环境细菌样品的ERIC-PCR指纹图谱中未找到对应图谱。 0083 也就是说， 使用本实施例提供的

32、基于ERIC-PCR指纹图谱的法医学个体识别方法实 现个体追踪的几率可高达68.6， 且在参加会议人员结束会议后14个小时仍然可以进行有 效追踪。 0084 由此可知， 犯罪嫌疑人离开现场14小时后， 其手部(或身体其它暴露部分)残留在 现场的菌群仍然存活， 对这些细菌进行采样， 并利用本实施例提供的方法， 就可以获得犯罪 嫌疑人 “在场” 的有力证据， 即实现个体识别及追踪。 说明书 7/7 页 9 CN 107287327 A 9 图1 说明书附图 1/4 页 10 CN 107287327 A 10 图2 说明书附图 2/4 页 11 CN 107287327 A 11 图3 说明书附图 3/4 页 12 CN 107287327 A 12 图4 说明书附图 4/4 页 13 CN 107287327 A 13