豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记和SCAR标记快速分子检测方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102690825 B (45)授权公告日 2013.07.03 CN 102690825 B *CN102690825B* (21)申请号 201210200468.6 (22)申请日 2012.06.14 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 彭德良 亓晓莉 彭焕 黄文坤 丁中 贺文婷 (74)专利代理机构 北京兆君联合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11333 代理人 胡敬红 CN 1763193 A

2、,2006.04.26, 全文 . CN 1900282 A,2007.01.24, 全文 . Subbotin S A， et al.Identification of Heterodera avenae group species by morphometrics and rDNA-RFLPs. Nematology .1999, 第 1 卷 ( 第 2 期 ),58-65. (54) 发明名称 豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记和 SCAR 标记 快速分子检测方法 (57) 摘要 本发明为豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记和 SCAR 标记快速分子检测方法， 属生物技术领域。 豌豆孢囊线

3、虫特异性 RAPD 标记的 DNA 片段， 其具 有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。 根据该豌豆 孢囊线虫特异性 RAPD 扩增片段， 设计特异性引物 HgoF1和HgoR1， 将其转化为更加稳定的SCAR标记 片段， 在 SCAR 标记快速分子检测豌豆孢囊线虫的 方法中， 可扩增出544bp的特异性片段。 本发明提 高了分子检测灵敏度并且快速准确， 在豌豆孢囊 线虫检测以及豌豆孢囊线虫病的早期诊断方面， 具有很高的应用价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张彬 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局

4、(12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102690825 B CN 102690825 B *CN102690825B* 1/1 页 2 1. 豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记的 DNA 片段， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记的 DNA 片段的保守序列设计 的特异性引物， 所述的特异性引物为 HgoF1 和 HgoR1， 其序列为 ： HgoF1 ： 5 -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3 ， HgoR1 ： 5 -TGTTTGTACTCA

5、CTCCTTCGCTC-3 。 3.豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法， 其特征在于PCR反应体系中含有特异性 引物 HgoF1 和 HgoR1， 其序列为 ： HgoF1 ： 5 -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3 ， HgoR1 ： 5 -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3 。 4. 根 据 权 利 要 求 3 所 述 的 检 测 方 法， 所 述 反 应 体 系 总 体 积 为 25l， 其 中 2.5l10PCR含Mg2+的Buffer ； 2.0l dNTP ； 1.0l浓度为0.1g/l的引物HgoF1 ； 1.0l 浓度为 0.1g/l 的

6、引物 HgoR1 ； 0.25l 浓度为 5U/l 的 Taq DNA 聚合酶 ； 1.0l 模板 DNA ； ddH2O 补足 25l。 5. 根据权利要求 4 所述的检测方法， 所述 PCR 的扩增程序为 ： 94预变性 5min， 然后 94 30S， 56 30S， 72 1min 循环 35 次， 72延伸 10min， 保存在 4条件下。 权 利 要 求 书 CN 102690825 B 2 1/9 页 3 豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记和 SCAR 标记快速分子检测 方法 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 涉及豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 标记全序列、 特异性 SC

7、AR 标记引物序列及豌豆孢囊线虫 SCAR 标记快速分子检测方法。 背景技术 0002 豌豆孢囊线虫 （H.goettingiana Liebscher,1892） ， 是欧洲一些国家中侵染豌豆 的主要病害。目前已在欧洲、 非洲、 前苏联和地中海地区有分布， 美国也有报道， 但是相关 分布范围较小。豌豆孢囊线虫在我国的分布和传播正在调查中， 目前在青海， 湖北， 四川等 地均有为害大豆的发现。豌豆孢囊线虫的寄主主要为豆科的豌豆 (PisumsativumL.)， 蚕 豆 (Viciafaba)， 野豌豆 (Viciaspp.)， 大豆 (Glycines max)， 小扁豆 (Lens scu

8、lenta) 等 （Winslow R D.Provisional lists of host plants of some root eelworm(Heterodera spp.).Annals of Applied Biology 1954,41:591-605） ， 此外还可寄生野草寄主， 寄主范 围相对较窄。通常进行 3-6 年轮作就可降低豌豆孢囊线虫种群水平不对寄主构成危害， 但 必须严格控制野草寄主 （Di Vito M,Greco N.The pea cyst nematode.In:Lamberti,F.13 ： 阴性对照。 （代码见表 1 和表 2） 图2 ： 用随机引物O

9、PA06扩增豌豆孢囊线虫、 禾谷孢囊线虫、 菲利普孢囊线虫、 大豆孢囊线虫、 旱稻孢囊线虫、 大麦孢囊线虫、 香蕉穿孔线虫、 马铃薯腐烂茎线虫等的RAPD的特异性DNA片 段结果， 0023 M 为标准 DNA 分子标记 （DNA marker DL 2,000） ； 1-9:Hgo01,Hgo02,Hgo03,Hgo04, Hgo05,Hgo08,Hgo09,Hgo10,Hgo12;10-20:Hf01,Hf06,Ha01,Ha06,Hg01,Hg03,He01,He04,H l01,Rs01,Dd01;21 ： 阴性对照。 （代码见表 1） 0024 图 3 ： 用豌豆孢囊线虫特异性 SC

10、AR 标记引物 （HgoF1 和 HgoR1） 扩增 6 种孢囊线虫 和 2 种非孢囊线虫的结果， 0025 M 为标准 DNA 分子标记 （DNA marker DL 2,000） ； 1-12:Hgo01,Hgo02,Hgo03,Hgo04 ,Hgo05,Hgo06,Hgo07,Hgo08,Hgo09,Hgo10,Hgo11,Hgo12;13-23:Hf01,Hf06,Ha01,Ha06,Hg 01,Hg03,He01,He04,Hl01,Rs01,Dd01;24 ： 阴性对照。 （代码见表 1） 具体实施方式 0026 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 0027 本发明的实验选

11、用的材料 ： 0028 供试线虫包括 19 个禾谷孢囊线虫群体， 11 个菲利普孢囊线虫群体， 3 个大豆孢囊 线虫群体， 12 个豌豆孢囊线虫群体， 5 个旱稻孢囊线虫群体， 1 个大麦孢囊线虫群体， 1 个马 铃薯腐烂茎线虫群体， 1 个松材线虫群体， 1 个香蕉穿孔线虫群体， 共计 54 个线虫群体。如 表 1 所示。所述供试线虫样品可以对公众发放。 0029 表 1 供试线虫样品代码及群体来源 0030 说 明 书 CN 102690825 B 6 5/9 页 7 0031 说 明 书 CN 102690825 B 7 6/9 页 8 0032 说 明 书 CN 102690825 B

12、 8 7/9 页 9 0033 表 2 供试 RAPD 引物 0034 0035 主要试剂 ： rTaq 酶 PCR 扩增试剂盒和 pMD18-T Simple Vector 购自 TaKaRa 公司 ； DNAmarker、 DH5 感受态细胞、 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化公司。引物由上海生 工生物技术有限公司合成。序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。其他常规试 剂均为北化生产的分析纯。 0036 实施例 1: 豌豆孢囊线虫特异性 RAPD 引物的筛选 0037 1.1 豌豆孢囊线虫基因组 DNA 的提取 0038 分别挑取供试孢囊线虫群体 1 个饱满的孢囊， 放入 10ml

13、灭菌双蒸水的 PCR 管中， 在液氮中冷冻。对于马铃薯腐烂茎线虫等线虫群体则是挑取单头线虫放入 10ml 灭菌的双 蒸水中， 同样在液氮中冷冻。取出后置于冰上， 用 75酒精消毒的玻璃棒在 PCR 管中转动 至冰融化， 将孢囊捅破， 释放卵， 或将线虫弄断。加入 8ml 的 10 的 PCR buffer， 2ml 蛋白 酶 K 溶液 (600mg/ml)， 在 -80条件下冷冻 2h 后， 将 PCR 管取出， 置 65下温育 1.5h， 然后 95 10min， 最后 1000rpm 下离心 1min， 取上清 DNA 悬浮液于 -20保存备用。 0039 1.2 豌豆孢囊线虫特异性 RA

14、PD 标记 （SCAR 标记） 的筛选 0040 参考彭德良 （2003） 研究小麦禾谷孢囊线虫群体的遗传变异分析结果， 在能产生多 态性的 RAPD 引物中， 以 Hgo01 豌豆孢囊线虫群体的 DNA 为模板， 遴选 12 个 Operon 系列的 说 明 书 CN 102690825 B 9 8/9 页 10 含 10 个碱基的随机引物 OPA02,OPA06,OPA09,OPA13,OPA18,OPB15,OPC06,OPD13,OPG06,OPG08,OPG10 ,OPK16（如表 2） 进行扩增。扩增结果显示， 随机引物 OPA06获得的特异性片段稳定， 因此选 用 OPA06对

15、12 个豌豆孢囊线虫群体和其他线虫群体的 DNA 进行扩增， 寻找出豌豆孢囊线虫 群体的特异性 RAPD 标记片段位 734bp 和 604bp。 0041 以供试孢囊线虫的DNA为模板， 以表2中的RAPD随机引物进行PCR扩增。 RAPD-PCR 反应体系为 25l， 配比如下 ： 10PCR Buffer 2.5l， 10mmol/L dNTP 2.0l， RAPD 随机 引物3.0l， rTaq DNA多聚酶0.25l （5U/l） ， 模板DNA 0.5l， 灭菌重蒸水补足25l。 在 EppendorfPCR 扩增仪上进行扩增。 0042 PCR 扩增条件为 94 5min ； 9

16、4 30s， 35 30s,72 1min,10 个循环 ； 94 30s ； 35 1min;72 1min,30 个循环 ;72延伸 10min ； 4保存。PCR 扩增后， 取 5l 扩增产物 加 1l 加样缓冲液在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 0.5TAE 作为电泳缓冲液， 120V 电压 下电泳 40min， EB 染色后， 凝胶分析系统进行照相分析， 可以看出随机引物 OPA06经过多次 RAPD 扩增多态性较稳定。 （图 1） 。 0043 实施例 2: 豌豆孢囊线虫 RAPD 标记序列的测定和 SCAR 标记引物的设计 0044 以供试豌豆孢囊线虫和其他线虫的 DNA

17、为模板， 以 RAPD 引物 OPA06进行 PCR 扩增。 RAPD-PCR 反应体系为 25l， 配比如下 ： 10PCR Buffer 2.5l， 10mmol/L dNTP 2.0l， RAPD 引物 OPA063.0l， rTaq DNA 多聚酶 0.25l（5U/l） ， 模板 DNA0.5l， 灭菌重蒸水 补足 25l。在 EppendorfPCR 扩增仪上进行扩增。 0045 PCR 扩增条件同实施例 1， 从图 2 中可以看出用随机引物 OPA06扩增豌豆孢囊线 虫群体获得约 750bp 和 600bp 的特异性 DNA 片段 （图 2） 。将随机引物 OPA06扩增豌豆孢囊

18、 线虫获得的 750bp 和 600bp 左右的 RAPD 特异性 DNA 片段从琼脂糖凝胶上切割， 使用 DNA 回收试剂盒对 RAPD 特异性 DNA 片段进行回收和纯化后， 纯化后的 RAPD-PCR 产物连接到 pMD18-TSimple Vector载体上， PCR产物与载体连接后， 转化到DH5E.coli感受态中进行 克隆， 通过蓝白斑筛选将表现为阳性克隆的重组质粒委托华大基因公司进行序列测定。用 DNAMAN 软件对序列进行分析比较。 0046 根据豌豆孢囊线虫 RAPD 特异性的 DNA 片段序列测序结果， 结果表明 RAPD 标记片 段大小为734bp和604bp。 通过P

19、rimer 5.0软件进行分析， 734bp的片段不能转化成为SCAR 标记， 取604bp的片段 （见SEQ ID NO1） 其中保守序列构建了一对豌豆孢囊线虫特异性SCAR 标记引物， 该引物对各含 23 碱基。将豌豆孢囊线虫特异性 SCAR 标记上游引物和下游引物 分别命名为 HgoF1 和 HgoR1， 其序列特征如下 ： 0047 HgoF1 ： 5 -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3 0048 HgoR1 ： 5 -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3 0049 实施例 3 ： 豌豆孢囊线虫特异性 SCAR 标记的快速分子检测 0050 特异性 SC

20、AR 标记快速分子检测的反应体系体积为 25l， 其中含有 2.5l 10PCR Buffer（含 Mg+） ； 2.0l dNTP ； 1.0l 引物 HgoF1（0.1g/l） ； 1.0l 引物 HgoR1（0.1g/l） ； 0.25lTaq DNA 聚合酶 （5U/l） ； 1.0l 模板 DNA（豌豆孢囊线虫 及其它孢囊线虫群体提取的基因组 DNA） ； ddH2O 补足 25l。 0051 所应用的豌豆孢囊线虫特异性 SCAR 标记引物序列如下 ： 0052 HgoF 1 ： 5 -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3 说 明 书 CN 102690825 B 10

21、 9/9 页 11 0053 HgoR1 ： 5 -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3 0054 PCR扩增程序为 ： 94预变性5min， 然后9430S， 5630S， 721min循环35次， 72延伸 10min， 保存在 4条件下。取 5l PCR 反应产物与 1l 上样缓冲液混匀在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 0.5TAE 作为电泳缓冲液， 120V 电压下电泳 40 分钟， EB 染色后， 凝胶分析系统进行照相分析。 0055 利用豌豆孢囊线虫特异性 SCAR 标记特异性引物， 在 56的退火温度和 35-40 个 循环的条件下扩增， 豌豆孢囊线虫群体都获

22、得 544bp 特异性 SCAR 标记片段 （图 3 中 1-12 泳 道） ， 而其他孢囊线虫 （图3中13-21泳道） ， 香蕉穿孔线虫 （图3中22泳道） ， 马铃薯腐烂茎线 虫 （图 3 中 23 泳道） 等都没有获得 544bp SCAR 标记片段。说明本发明所构建的 SCAR 标记 引物对豌豆孢囊线虫具有特异性， 这是目前国际首例豌豆孢囊线虫特异性 SCAR 标记引物。 说 明 书 CN 102690825 B 11 1/1 页 12 0001 序 列 表 CN 102690825 B 12 1/1 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102690825 B 13