人源化抗TGF-抗体.pdf

1、(10)授权公告号 CN 1961003 B (45)授权公告日 2013.03.27 CN 1961003 B *CN1961003B* (21)申请号 200580017613.5 (22)申请日 2005.03.31 60/558,290 2004.03.31 US C07K 16/22(2006.01) A61K 39/395(2006.01) (73)专利权人 健泰科生物技术公司 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 卡米利亚W亚当斯 纳波莱昂内费拉拉 埃伦菲尔瓦罗夫 毛维光 伦纳德G普雷斯塔 马克斯L特加达 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 巫肖南

2、封新琴 US 20030064069 A1,2003.04.03, 第 8 页 0098,0104 段 . US 2003125251 A1,2003.07.03, 全文 . US 5821337 A,1998.10.13, 全文 . (54) 发明名称 人源化抗 TGF- 抗体 (57) 摘要 本发明提供了人源化抗 TGF- 抗体及其制 备和使用方法， 包括用于治疗 TGF- 病症， 例如 癌症的方法。还提供了为各种用途设计的含有所 述人源化抗体的产品。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2006.11.30 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2005/01099

3、4 2005.03.31 (87)PCT申请的公布数据 WO2005/097832 EN 2005.10.20 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙婷婷 权利要求书 5 页 说明书 55 页 序列表 40 页 附图 35 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 5 页 说明书 55 页 序列表 40 页 附图 35 页 1/5 页 2 1. 结合 TGF- 的包含重链可变区 (VH) 的人源化抗体， 其 (i) 包含轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR

4、-L1 ； WASTRES(SEQ ID NO ： 19) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22)作为CDR-H2 ； 和SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23)作 为 CDR-H3， 或 (ii) 包含轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为

5、 CDR-L1 ； WASTRES(SEQ ID NO ： 19) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VINPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 43)作为CDR-H2 ； 和SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23)作 为 CDR-H3， 或 (iii) 包含轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 1

6、8) 作为 CDR-L1 ； YASSLQS(SEQ ID NO ： 8) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22)作为CDR-H2 ； 和SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23)作 为 CDR-H3， 或 (vi) 包含轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQGISSYLA(SEQ IDNO ： 7) 作为

7、 CDR-L1 ； YASSLQS(SEQ ID NO ： 8) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3， 或 (v) 包含轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQGISSYLA(SEQ ID NO ： 7) 作为

8、CDR-L1 ； YASSLQS(SEQ ID NO ： 8) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VINPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 43) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3， 所述重链可变区 (VH) 包含掺入人 VH结构域的非人高变区残基， 所述可变区在选自 48、 49、 68、 70、 72、 74

9、 和 79 的位置上包含 SEQ ID NO ： 6 中的构架区 (FR) 取代， 其中 在 (i) 的情况中， (1) 在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯丙氨酸改变成丙 氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸 ； (2) 在 48 位上缬氨酸改变成异亮氨酸， 在 49 位上 丙氨酸改变成甘氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸 ； (3) 在 49 位上丙氨酸改变成甘氨 酸， 在 70 位上异亮氨酸改变成亮氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸 ； (4) 在 49 位上丙 氨酸改变成甘氨酸， 在 70 位上异亮氨酸改变成亮氨酸， 在 72 位上精氨酸改变成丙氨

10、酸， 且 在74位上天冬酰胺改变成赖氨酸 ； (5)在49位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在72位上精氨酸改 变成丙氨酸， 且在 74 位上天冬酰胺改变成赖氨酸 ； 或 (6) 在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且在 79 位上亮氨酸改变成丙氨酸， 或 在 (ii)-(v) 的情况中， 在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯丙氨酸改变成丙 氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸。 2. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯 权 利 要 求 书 CN 1961003 B 2 2/5 页 3 丙

11、氨酸改变成丙氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻 链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L1 ； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3， 且 包 含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR

12、-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 3. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 48 位上缬氨酸改变成异亮氨酸， 在 49 位 上丙氨酸改变成甘氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含 轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L 1 ； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3， 且 包含重链可变区 (VH) 互

13、补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 4. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 70 位上异 亮氨酸改变成亮氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻 链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L1

14、； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3， 且 包 含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 5. 权利要求 4 所述的人源化抗体， 其中在 74 位上天冬酰胺改变成赖氨酸。 6. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49

15、位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 72 位上精 氨酸改变成丙氨酸， 且在 74 位上天冬酰胺改变成赖氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻 链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L1 ； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3， 且 包 含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(

16、SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 7. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 72 位上 精氨酸改变成丙氨酸， 且在 79 位上亮氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻 链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L1 ； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR

17、-L3， 且 包 含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 8. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上 苯丙氨酸改变成丙氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含 轻链可变区 (VL) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ

18、ID NO ： 18) 作为 CDR-L 1 ； WASTRES(SEQID NO ： 19) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3， 且 权 利 要 求 书 CN 1961003 B 3 3/5 页 4 包含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VINPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 43) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 9. 权利要求 1 所述的

19、人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯 丙氨酸改变成丙氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻 链可变区 (VI) 互补决定区 (CDR) 残基 RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO ： 18) 作为 CDR-L1 ； YASSLQS(SEQ IDNO ： 8) 作 为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作 为 CDR-L3，且 包 含重链可变区 (VH) 互补决定区 (CDR) 残基 GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21) 作为 CDR-H1 ； VNNPGS

20、GGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作 为 CDR-H2 ；和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作 为 CDR-H3。 10. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯 丙氨酸改变成丙氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻链 可变区(VL)互补决定区(CDR)残基RASQGISSYLA(SEQ ID NO ： 7)作为CDR-L1 ； YASSLQS(SEQ ID NO ： 8) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L

21、3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区(CDR)残基GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21)作为CDR-H1 ； VNNPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 22) 作为 CDR-H2 ； 和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作为 CDR-H3。 11. 权利要求 1 所述的人源化抗体， 其中在 49 位上丙氨酸改变成甘氨酸， 在 68 位上苯 丙氨酸改变成丙氨酸， 且在 72 位上精氨酸改变成丙氨酸， 且其中所述人源化抗体包含轻链 可变区(VL)互补决定区(CDR)残基RASQGISSYLA(SEQ ID NO ： 7)作为CDR-L1 ；

22、 YASSLQS(SEQ ID NO ： 8) 作为 CDR-L2 ； 和 HQYLSSDT(SEQ ID NO ： 20) 作为 CDR-L3， 且包含重链可变区 (VH) 互补决定区(CDR)残基GYAFTNYLIE(SEQ ID NO ： 21)作为CDR-H1 ； VINPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO ： 43) 作为 CDR-H2 ； 和 SGGFYFDY(SEQ ID NO ： 23) 作为 CDR-H3。 12.权利要求1或2所述的人源化抗体， 包含SEQ ID NO ： 3中的VL结构域氨基酸序列。 13. 权利要求 1、 2 和 12 任一项所述的人源化抗体

23、， 包含 SEQ ID NO ： 4 中的 VH结构域氨 基酸序列。 14. 权利要求 1-13 任一项所述的人源化抗体， 为完整 IgG1 抗体。 15. 权利要求 1-13 任一项所述的人源化抗体， 为选自下组的抗体片段 ： Fab， Fab ， F(ab )2 和 scFv。 16. 权利要求 15 所述的人源化抗体， 为 Fab 片段。 17. 权利要求 1-16 任一项所述的人源化抗体， 未与胞毒剂偶联。 18. 权利要求 1-16 任一项所述的人源化抗体， 已与胞毒剂偶联。 19. 组合物， 包含权利要求 1-18 任一项所述的人源化抗体和载体。 20. 分离的核酸， 编码权利要求

24、 1-18 任一项所述的人源化抗体。 21. 载体， 包含权利要求 20 所述的核酸。 22. 宿主细胞， 包含权利要求 20 所述的核酸。 23. 生产人源化抗体的方法， 包括培养权利要求 22 所述的宿主细胞， 以便表达所述核 酸并产生所述抗体。 24. 权利要求 23 所述的方法， 还包括从所述宿主细胞培养物回收所述抗体。 25. 权利要求 24 所述的方法， 其中从宿主细胞培养基中回收所述抗体。 权 利 要 求 书 CN 1961003 B 4 4/5 页 5 26. 权利要求 23-25 任一项所述的方法， 其中在培养前用包含编码重链可变区的核酸 的载体和包含编码轻链可变区的核酸的载

25、体共转染所述宿主细胞。 27.用于检测身体样品中的TGF-的方法， 包括使权利要求1-18任一项所述的人源化 抗体接触所述身体样品并测定是否发生抗体与 TGF- 的结合。 28.用于治疗TGF-病症的产品， 包括装有权利要求1-18任一项所述的人源化抗体的 容器和指导使用者用有效量的该抗体治疗哺乳动物中的 TGF- 病症的说明书， 其中所述 TGF- 病症为癌症， 其中所述癌症为结肠癌、 结肠直肠癌、 直肠癌、 肺癌、 乳腺癌或恶性黑素 瘤。 29. 权利要求 28 所述的产品， 额外包括装有所述人源化抗体以外的治疗剂的容器， 其 中所述说明书指导使用者使用所述抗体联合有效量的所述治疗剂治疗所

26、述病症， 所述治疗 剂为结合血管内皮生长因子的抗体。 30. 权利要求 29 所述的产品， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体为 AVASTIN。 31. 权利要求 28-30 任一项所述的产品， 其中所述哺乳动物为人。 32. 权利要求 1-18 任一项所述的人源化抗体在制备治疗哺乳动物 TGF- 病症的药物 中的用途， 其中所述病症为癌症， 其中所述癌症为结肠癌、 结肠直肠癌、 直肠癌、 肺癌、 乳腺 癌或恶性黑素瘤。 33. 权利要求 32 所述的用途， 其中所述哺乳动物为灵长类。 34. 权利要求 32 或 33 所述的用途， 其中所述哺乳动物为人。 35. 权利要求 32-34 任一

27、项所述的用途， 其中所述药物还包括有效量的所述人源化抗 体以外的治疗剂， 所述治疗剂为结合血管内皮生长因子的抗体。 36. 权利要求 35 所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体为 AVASTIN。 37. 权利要求 35 所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体为完整抗体。 38. 权利要求 35 所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体为选自下组的抗 体片段 ： Fab， Fab ， F(ab )2和 scFv。 39. 权利要求 38 所述的用途， 其中所述抗体片段为 Fab 片段。 40. 权利要求 35-39 任一项所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子

28、的抗体已与 胞毒剂偶联。 41. 权利要求 35-39 任一项所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体未与 胞毒剂偶联。 42. 权利要求 1-18 任一项的人源化抗体和结合血管内皮生长因子的抗体在制备治疗 哺乳动物癌症的药物中的用途， 其中所述癌症为结肠癌、 结肠直肠癌、 直肠癌、 肺癌、 乳腺癌 或恶性黑素瘤。 43. 权利要求 42 所述的用途， 其中所述哺乳动物为人。 44. 权利要求 42 或 43 所述的用途， 其中所述结合血管内皮生长因子的抗体为 AVASTIN。 45. 权利要求 42-44 任一项所述的用途， 其中所述 TGF- 抗体结合 TGF-1、 TGF-2 和

29、 TGF-3 中的任一种或多种。 46. 权利要求 42-45 任一项所述的用途， 其中所述抗体结合 TGF-1。 47. 权利要求 42-46 任一项所述的用途， 其中所述抗体结合 TGF-1 和 TGF-2。 权 利 要 求 书 CN 1961003 B 5 5/5 页 6 48. 权利要求 1-18 任一项所述的人源化抗体在制备用于检测身体样品中的 TGF- 的 药物中的用途， 所述检测包括使所述人源化抗体接触所述身体样品并测定是否发生抗体与 TGF- 的结合。 权 利 要 求 书 CN 1961003 B 6 1/55 页 7 人源化抗 TGF- 抗体 0001 相关申请 0002 本

30、申请要求 2004 年 3 月 31 日提交的美国临时申请 60/558,290 的优先权， 在 35 U.S.C.119 下本申请要求该美国临时申请的优先权， 将其内容引入本文作为参考。 发明领域 0003 本发明涉及人源化抗TGF-抗体及其制备方法和使用它们治疗TGF-相关病症 的方法。 例如， 所述抗体可用于免疫亲和纯化、 免疫测定、 体内成像、 放射性受体测定和需要 拮抗 TGF- 活性， 特别是 TGF-1 活性的治疗。 0004 发明背景 0005 转化生长因子 -(TGF-) 为最初因其将正常成纤维细胞转化成能不依赖锚 泊生长的细胞的能力而命名的多功能细胞因子。主要由造血细胞和肿

31、瘤细胞产生的 TGF- 可调节， 即刺激或抑制来源于各种正常和肿瘤组织的细胞的生长和分化 (Sporn 等， Science， 233 ： 532(1986)， 并刺激各种基质成分的形成和加工 (elaboration)。关于 TGF- 及其作用的一般性综述参见 Sporn 等， J.Cell Biol.， 105 ： 1039-1045(1987) 及 Sporn 和 Roberts， Nature， 332 ： 217-219(1988)。 0006 已知它们涉及许多增殖性和非增殖性细胞过程， 诸如细胞增殖和分化、 胚胎 发育、 胞外基质形成、 骨发育、 创伤愈合、 血细胞生成及免疫和炎症

32、应答。Pircher 等， Biochem.Biophys.Res.Commun.， 136 ： 30-37(1986) ； Wakefield 等， Growth Factors， 1 ： 203-218(1989) ； Roberts 和 Sporn， pp 419-472in Handbook of Experimental Pharmacology M.B.Sporn 和 A.B.Roberts 编， Springer， Heidelberg， 1990 ； Massague 等， Annual Rev.Cell Biol.， 6 ： 597-646(1990) ； Singer 和

33、Clark， New Eng.J.Med.， 341 ： 738-745(1999)。此外， TGF- 用于治疗和预防肠粘膜疾病。WO 2001/24813。 0007 从免疫学观点来看特别令人关注的是 TGF- 的有效免疫抑制活性， 包 括淋巴 因子激活的杀伤细胞 (LAK) 和细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 抑制 (Ranges 等， J.Exp.Med.， 166 ： 991(1987) ； Espevik 等， J.Immunol.， 140 ： 2312(1988) ； Grimm 等， Cancer Immunol. Immunother.， 27 ： 53(1988) ； K

34、asid 等， J.Immunol.， 141 ： 690(1988) ； Mule 等， Cancer Immunol.Immunother.， 26 ： 95(1988)、 阻抑的 B 细胞淋巴细胞生成和 轻链表达 (Lee 等， J.Exp.Med.， 166 ： 1290(1987)、 血 细 胞 生 成 的 负 调 节 (Hino 等， Br.J.Haematol.， 70 ： 143(1988) ； Sing 等， Blood， 72 ： 1504(1988)、肿 瘤 细 胞 上 HLA-DR 表 达 的 下 调 (Czarniecki 等， J.Immunol.， 140 ： 4

35、217(1988) ； Zuber 等， Eur.J.Immunol.， 18 ： 1623(1988)、 及响应 B 细胞生长因子的抗原活化 B 淋巴细胞增殖的抑制 (Petit-Koskas 等， Eur.J.Immunol.， 18 ： 111(1988)。许多人肿瘤 (deMartin 等， EMBO J.， 6 ： 3673(1987) ； Kuppner等， Int.J.Cancer， 42 ： 562(1988)和许多肿瘤细胞系(Derynck等， Cancer Res.， 47 ： 707(1987) ； Roberts 等， Br.J.Cancer， 57 ： 594(198

36、8) 产生 TGF- 的观察结果提示了 那些肿瘤避免正常免疫监视的可能机制。 这种负免疫调节与某些转化细胞系失去以自分泌 方式响应TGF-的能力(Wakefield等， J.Cell Biol.， 105 ： 965(1987) ； McMahon等， Cancer 说 明 书 CN 1961003 B 7 2/55 页 8 Res.， 46 ： 4665(1986) 和 TGF- 刺激基质形成并减少对肿瘤的免疫监视的观察结果结合， 提示了瘤性失调和增殖的有吸引力的模型 (Roberts 等， Br.J.Cancer， 同上 )。 0008 此外， 美国专利5,824,297和5,262,31

37、9披露了通过对正常细胞施用TGF-， 诸如 TGF-3 抑制其细胞毒性中毒的方法。 0009 目前鉴定的 TGF- 至少存在 5 种形式 ： TGF-1、 TGF-2、 TGF-3、 TGF-4 和 TGF-5。 已知用于从不同物种， 诸如人、 小鼠、 绿猴、 猪、 牛、 鸡和蛙及从不同身体来源， 诸如 骨、 血小板或胎盘纯化该 TGF- 家族， 用于在重组细胞培养物中产生它， 及用于测定其活 性的合适方法。例如参见 Derynck 等， Nature， 316 ： 701-705(1985) ； 1986 年 12 月 10 日公 布的欧洲专利公开号 200,341、 1986 年 1 月

38、22 日公布的 169,016、 1988 年 5 月 25 日公布 的 268,561 和 1988 年 5 月 18 日公布的 267,463 ； 美国专利 4,774,322 ； Cheifetz 等， Cell， 48 ： 409-415(1987) ； Jakowlew 等， Molecular Endocrin.， 2 ： 747-755(1988) ； Dijke 等， Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)， 85 ： 4715-4719(1988) ； Derynck 等， J.Biol.Chem.， 261 ： 4377-4379(1986) ； Sharp

39、les等， DNA， 6 ： 239-244(1987) ； Derynck等， Nucl.Acids.Res.， 15 ： 3188-3189(1987) ； Derynck等， Nucl.Acids.Res.， 15 ： 3187(1987) ； Derynck等， EMBO J.， 7 ： 3737-3743(1988) ； Seyedin等， J.Biol.Chem.， 261 ： 5693-5695(1986) ； Madisen等， DNA， 7 ： 1-8(1988) ； 和 Hanks 等， Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)， 85 ： 79-82(198

40、8)， 明确将这些出 版物的全部内容引入作为参考。 0010 TGF-1 的活化形式为通过 390 个氨基酸的前体的羧基末端 112 个氨基酸二聚 化形成的同二聚体 (Derynck 等， Nature， 同上 )。TGF-2 具有 414 个氨基酸的前体形 式， 且还从羧基末端 112 个氨基酸加工成同二聚体， 与 TGF-1 活性形式共享约 70同 源 性 (Marquardt 等， J.Biol.Chem.， 262 ： 12127(1987)。 已 从 猪 血 小 板 (Seyedin 等， J.Biol.Chem.， 262 ： 1946-1949(1987) 和人成胶质细胞瘤细胞

41、(Wrann 等， EMBO J.， 6 ： 1633(1987) 纯化得到 TGF-2 并已克隆重组人 TGF-2(deMartin 等， 同上 )。已克隆重 组 TGF-1(Derynck 等， Nature， 同上 ) 并在中国仓鼠卵巢细胞中表达 (Gentry 等， Mol. Cell.Biol.， 7 ： 3418-3427(1987)。 关于目前分别公认为TGF-1和2的CIF-A和CIF-B参 见美国专利 4,774,322、 4,843,063 和 4,848,063。Ellingsworth 等， J.Biol.Chem.， 261 ： 12362-12367(1986)。尽

42、管在两种形式 (TGF-1 和 TGF-2) 的前 36 个氨基酸残基中存在 14 个氨基酸差异， 但是它们的生物学活性相似。Cheifetz 等， Cell， 48 ： 409-415(1987) ； Seyedin 等， J.Biol.Chem.， 262 ： 同上。 0011 TGF- 的最新发现形式 TGF-3、 TGF-4 和 TGF-5 是通过筛选 cDNA 文库鉴 定到的。这三种推定的蛋白质没有一种已从天然来源分离到， 不过 RNA 印迹证实了相应 mRNA 的表达。已经克隆了人和猪 TGF-3 并描述为同二聚体且在中国仓鼠卵巢细胞中得 到表达 (Derynck 等， EMBO

43、J.， 7 ： 3737-3743(1988) ； ten Dijke 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 85 ： 4715(1988) ； 美国专利 4,886,747)。另外， 有关 TGF-3 蛋白质及其抗体参见 WO 1992/00318。TGF-1 不同于 TGF-2 的方面在于 27 个主要保守改变， 而不同于 TGF-3 的方面在于 22 个主要保守改变。已经将这些差异与 3D 结构联系起来。Schlunegger 和 Grutter， Nature， 358 ： 430-434(1992)。 0012 TGF-4 和 TGF-5 分别克隆自鸡软骨细胞 cD

44、NA 文库 (Jakowlew 等， Molec. Endocrinol.， 2 ： 1186-1195(1988) 和蛙卵母细胞 cDNA 文库。可以使用衍生自另一种类 说 明 书 CN 1961003 B 8 3/55 页 9 型 TGF- 的一种或多种序列的探针筛选蛙卵母细胞 cDNA 文库。在鸡胚软骨细胞中可检 测到 TGF-4 mRNA， 但远不如在发育中的胚胎或鸡胚成纤维细胞中的 TGF-3 mRNA 丰富。 TGF-5 mRNA 在超出神经胚态 (neurula state) 的蛙胚胎和非洲蟾蜍属 (Xenopus) 蝌蚪 (XTC) 细胞中表达。 0013 美国专利5,061,

45、786、 5,268,455和5,801,231描述了TGF-1、 TGF-2和TGF- 的重组生产。另外， 有关用于治疗激素响应性癌和产生抗体的 TGF-2 参见美国专利 5,120,535。如美国专利 4,931,548 和 5,304,541 中所述， 已经鉴定了称作 TGF-1.2 的 TGF-1 和 TGF-2 的异二聚体并演示了其用途， 后者披露了其抗体。1989 年 7 月 20 日提 交的 WO 1990/00900 披露了用同二聚体 TGF-1 和 -2 和异二聚体 TGF-1.2 治疗炎性 病症。美国专利 5,462,925 披露了 TGF-2 和 TGF-3 的异二聚体。

46、美国专利 5,780,436 披露了 TGF- 的小肽模拟物。 0014 TGF- 活性水平升高涉及许多病理情况， 包括但不限于如下情况 ： (i) 创伤愈合 过程中的纤维化、 瘢痕形成和粘连 ； (ii) 肺、 肝和肾的纤维变性疾病 ； (iii) 动脉粥样硬化 和动脉硬化 ； (iv) 某些类型的癌症， 包括前列腺癌、 消化系统的神经内分泌瘤、 宫颈癌、 成 胶质细胞瘤和胃癌 ； (v) 血管病、 血管病变、 肾病 ； (vi) 全身性硬化症 ； (vii) 病毒感染， 诸 如丙型肝炎和 HIV ； 及 (viii) 免疫和炎性病症及缺陷， 诸如类风湿性关节炎。TGF- 调节 免疫和炎症应

47、答包括 ： (i)抑制所有T细胞亚群的增殖 ； (ii)对B淋巴细胞增殖和功能的抑 制作用 ； (iii) 对天然杀伤细胞活性和 T 细胞应答的下调 ； (iv) 对免疫细胞细胞因子产生 的调节 ； (v) 对巨噬细胞功能的调节 ； 及 (vi) 白细胞募集和活化。 0015 特别就癌症而言， 已知 TGF- 家族的成员具有许多与肿瘤发生 ( 包括血管发生 ) 和转移相关的生物学活性。TGF- 抑制许多细胞类型的增殖， 包括毛细管内皮细胞和平滑 肌细胞。TGF- 下调整联蛋白表达 ( 涉及内皮细胞迁移的 11、 21 和 v3)。整 联蛋白涉及所有细胞的迁移， 包括转移细胞。TGF- 下调血管

48、发生和转移所需的基质金属 蛋白酶表达。TGF- 诱导纤溶酶原激活物抑制剂， 它抑制血管发生和转移所需的蛋白酶级 联。TGF- 诱导正常细胞以便抑制转化细胞。例如参见 Yingling 等， Nature Reviews， 3(12) ： 1011-1022(2004)， 它披露了 TGF- 的失调涉及多种疾病， 包括癌症和纤维化的发 病机理， 并为评价TGF-信号传导抑制剂作为癌症治疗剂、 生物标志物/诊断剂、 研发中的 小分子抑制剂的结构、 及应用于其研发的靶向药物研发模型提供了基本原理。癌症的早期 检测是非常重要的 (Ruth 等， NatureReviews Cancer， 3 ： 24

49、3-252(2003)， 且正在研究癌症 转移的发病机理。Fidler， Nature Reviews Cancer， 3 ： 453-458(2003)。 0016 TGF- 已经通过调节内皮细胞增殖、 迁移、 胞外基质 (ECM) 代谢和黏着分子表达 而表现为血管发生的主要调节物。 它是正常乳腺上皮细胞和许多乳腺癌细胞系的有效生长 抑制剂。TGF- 看起来以前后关系 (contextual) 的方式在乳腺癌的肿瘤生成中发挥多效 性作用， 即它通过直接抑制血管发生和肿瘤细胞生长在早期阶段抑制肿瘤发生。 然而， 晚期 肿瘤过度产生 TGF- 可能通过间接刺激血管发生和免疫抑制而加速疾病发展。细胞膜抗 原 CD105( 内皮糖蛋白 ) 结合 TGF1 和 TGF3 且优先在生血管的血管内皮细胞中表达。 HUVEC中CD105水平的下降在有TGF-1存在下在体外导致血管发生抑制和大量细胞死亡。 CD105 裸鼠在子宫内死于脉管系统受损， 这表明了 CD105 在血管发育中的关键作用。Li 等， Microsc.Res.Tech.， 52 ： 437-449(2001)。在 TGF-I 型受体缺陷型小鼠中观察到异常血 说 明 书 CN 1961003 B 9 4/55 页 10 管发生， 但造