具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102216452 A (43)申请公布日 2011.10.12 CN 102216452 A *CN102216452A* (21)申请号 200980145664.4 (22)申请日 2009.07.21 61/194,292 2008.09.26 US 61/120,722 2008.12.08 US 61/168,186 2009.04.09 US C12N 9/10(2006.01) C07K 16/18(2006.01) (71)申请人 尤里卡治疗公司 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 刘诚 向京宜 言苏 王培 戴炜展 (74)专利代理机构 北京市金

2、杜律师事务所 11256 代理人 陈文平 (54) 发明名称 具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质 (57) 摘要 本发明提供一种包含产生具有变异糖基化方 式的糖蛋白的细胞的组合物和方法。所述方法和 组合物可以用来制备具有治疗价值的抗体和蛋白 质。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.05.16 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/051325 2009.07.21 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/036443 EN 2010.04.01 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 7 页

3、 说明书 45 页 附图 32 页 CN 102216463 A1/7 页 2 1. 一种糖蛋白， 该糖蛋白被修饰为表现出变异糖基化方式， 其中所述变异糖基化方式 的特征在于， 与对应的野生型糖蛋白相比， 至少两种糖分子的水平发生变化。 2. 根据权利要求 1 所述的糖蛋白， 其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖、 半乳糖、 或这 二者的水平变化来证实。 3. 根据权利要求 1 所述的糖蛋白， 其中所述半乳糖的水平变化为降低。 4. 根据权利要求 1 所述的糖蛋白， 其中所述葡萄糖的水平变化为增加。 5. 根据权利要求 1 所述的糖蛋白， 其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖水平的增加、 半乳糖水平的

4、降低以及岩藻糖水平的降低来证实。 6. 根据权利要求 1 所述的糖蛋白， 所述变异糖基化方式通过末端葡萄糖部分来证实。 7.根据权利要求1所述的糖蛋白， 所述变异糖基化方式包括具有式(I)或(II)所示结 构的 N- 连接多糖 ： 8. 一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体， 该抗体包含 N- 连接多糖， 其中， 与对应的由 未修饰的宿主细胞产生的抗体相比， 所述抗体对 Fc 受体 IIIa(FcRIIIa) 的结合亲和 性增加， 并且 / 或者对 Fc 受体 IIb(FcRIIb) 的结合亲和性降低， 从而提高了对表达 FcRIIIa 和 / 或 FcRIIb 的效应细胞的 ADCC( 抗体依赖

5、性细胞介导的细胞毒性 ) 活性。 9. 一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体， 该抗体包含 N- 连接多糖， 其中， 与由对应的 未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比， 所述抗体的 ADCC 活性增加， 并且其中， 所述增 加的 ADCC 活性针对表达高亲和性 Fc 受体 FcRIIIa 158V/V 的效应细胞、 以及表达低亲 和性 Fc 受体 FcRIIIa158F/F 或 FcRIIIa 158F/V 的效应细胞。 10.根据权利要求8或9所述的抗体， 其中所述N-连接多糖包含一个葡萄糖分子、 四个 甘露糖分子和两个 N- 乙酰基葡萄糖胺分子。 11. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体，

6、 其中所述 N- 连接多糖包含一个或多个岩藻糖分 子。 12. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述 N- 连接多糖具有式 (I) 或 (II) 所示的 结构 ： 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A2/7 页 3 13. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述 N- 连接多糖与所述抗体的 Fc 区相连。 14. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述抗体结合癌抗原。 15. 根据权利要求 14 所述的抗体， 其中所述癌抗原选自由 HER2、 免疫球蛋白 Fc 受 体 II、 Alk-1、 CD20、 EGF 受体、 V

7、EGF 受体、 FGF 受体、 NGF 受体、 PDGF 受体、 EpCam、 CD3、 CD4、 CD11a、 CD19、 CD22、 CD30、 CD33、 CD38、 CD40、 CD51、 CD55、 CD80、 CD95、 CCR2、 CCR3、 CCR4、 CCR5、 CTLA-4、 黏蛋白 1、 黏蛋白 16、 内皮糖蛋白、 间皮蛋白受体、 Nogo 受体、 叶酸受体、 CXCR4、 胰岛 素样生长因子受体、 神经节苷脂 GD3、 以及 和 整联蛋白所组成的组。 16. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述抗体为抑制性抗体。 17. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗

8、体， 其中所述抗体为 IgG 抗体。 18. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中， 与对应的由未修饰的 CHO 细胞克隆、 CHO-K1(ATCC#CCL-61 和 CRL-9618) 或 CHO-DG44(Invitrogen#12609-012) 产生的抗体相 比， 所述抗体对表达低亲和性 FcR 的 FcRIIIa158F/F 或 FcRIIIa 158F/V 的效应细胞的 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ) 活性增加。 19. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中， 与对应的由未修饰的 CHO 细胞克隆、 CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-961

9、8)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比， 所述抗体对表达高亲和性 FcR 的 FcRIIIa158V/V 的效应细胞的 ADCC( 抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性 ) 活性增加。 20. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。 21. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述宿主细胞选自由 NS0、 SP2/0、 HEK293、 PER.C6 和 YB2/0 细胞组成的组。 22. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述宿主细胞为骨髓瘤细胞。 23. 根据权利要求 8 或 9 所述的

10、抗体， 其中所述效应细胞为人外周血液单核细胞 (PBMC)。 24. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述抗体为抗 -Her2 抗体。 25. 根据权利要求 8 或 9 所述的抗体， 其中所述效应细胞为 NK 细胞、 单核细胞、 巨噬细 胞、 或多形核中性粒细胞 (PMN)。 26. 一种 N- 连接多糖， 包含一个葡萄糖分子、 四个甘露糖分子和两个 N- 乙酰基葡萄糖 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A3/7 页 4 胺分子。 27. 根据权利要求 26 所述的 N- 连接多糖， 其中所述葡萄糖位于所述 N- 连接多糖的末 端， 并且该

11、 N- 连接多糖可任选地包含一个或多个岩藻糖分子。 28. 根据权利要求 26 所述的 N- 连接多糖， 具有式 (I) 所示的结构 ： 29. 根据权利要求 26 所述的 N- 连接多糖， 具有式 (II) 所示的结构 ： 30. 一种经分离的糖蛋白， 其包含权利要求 26 至 29 中任意一项所述的 N- 多糖。 31. 根据权利要求 30 所述的糖蛋白， 其中该糖蛋白为抗体。 32. 根据权利要求 30 所述的糖蛋白， 其中该糖蛋白为酶。 33. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中所述 N- 连接多糖与所述抗体的 Fc 区相连。 34. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中所述

12、抗体结合癌抗原。 35. 根据权利要求 34 所述的糖蛋白， 其中所述癌抗原选自由 HER2、 免疫球蛋白 Fc 受 体 II、 Alk-1、 CD20、 EGF 受体、 VEGF 受体、 FGF 受体、 NGF 受体、 PDGF 受体、 EpCam、 CD3、 CD4、 CD11a、 CD19、 CD22、 CD30、 CD33、 CD38、 CD40、 CD51、 CD55、 CD80、 CD95、 CCR2、 CCR3、 CCR4、 CCR5、 CTLA-4、 黏蛋白 1、 黏蛋白 16、 内皮糖蛋白、 间皮蛋白受体、 Nogo 受体、 叶酸受体、 CXCR4、 胰岛 素样生长因子受体、

13、 神经节苷脂 GD3、 以及 和 整联蛋白所组成的组。 36. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中所述抗体由经修饰的宿主细胞产生， 所述宿 主细胞产生基本上同种群的 N- 连接多糖。 37. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中， 与对应的由未修饰的 CHO 细胞克隆、 CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比， 所述抗体的 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ) 活性增加。 38. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中， 与对应的由未修饰的 CHO 细胞克隆、 CHO-K1(ATC

14、C#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比， 所述抗体对 FcRIIIA 受体的结合亲和性增加。 39. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中所述抗体为抑制性抗体。 40. 根据权利要求 31 所述的糖蛋白， 其中所述抗体为 IgG 抗体。 41. 一种制备经修饰的糖蛋白的方法， 包括 ： (a) 提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列 ； 以及 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A4/7 页 5 (b) 使所述经修饰的糖蛋白在宿主细胞中表达， 其中所述宿主细胞产生具有变异

15、糖基 化方式的 N- 连接多糖， 所述变异糖基化方式的特征在于， 选自由葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖和 葡萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。 42. 根据权利要求 41 所述的方法， 其中所述宿主细胞保持在无血清培养基中。 43. 根据权利要求 41 所述的方法， 其中所述宿主细胞保持在悬浮液培养物中。 44. 根据权利要求 41 所述的方法， 其中所述经修饰的糖蛋白为抗体。 45.根据权利要求41所述的方法， 其中所述宿主细胞产生具有式(I)或(II)所示结构 的 N- 连接多糖 ： 46. 一种经修饰的宿主细胞， 其产生具有变异糖基化方式的 N- 连接多糖， 所述变异糖 基

16、化方式的特征在于， 与未修饰的母本宿主细胞相比， 选自由葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖和葡 萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。 47. 根据权利要求 46 所述的经修饰的宿主细胞， 其中所述变异糖基化方式的特征在 于， 与所述未修饰的母本宿主细胞相比， 所述宿主细胞表面上存在的至少两种糖分子的水 平发生变化。 48. 一种经分离的宿主细胞， 其产生糖蛋白， 该糖蛋白表现出基本上同种方式的 N- 连 接多糖。 49.根据权利要求48所述的宿主细胞， 其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过 质谱解析的单峰来证实。 50. 一种经修饰的宿主细胞， 其特征在于能够产生具有 N- 连接

17、多糖的经修饰 的抗体， 其中， 与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比， 该抗体对 Fc 受体 IIIa(FcRIIIa) 的结合亲和性增加， 并且 / 或者对 Fc 受体 IIb(FcRIIb) 的结合亲和 性降低， 从而提高对表达 FcRIIIa 和 / 或 FcRIIb 的效应细胞的 ADCC( 抗体依赖性细胞 介导的细胞毒性 ) 活性。 51. 根据权利要求 50 所述的宿主细胞， 其中提高的 ADCC 活性针对表达高亲和性 Fc 受体 FcRIIIa 158V/V 的效应细胞、 以及表达低亲和性 Fc 受体的 FcRIIIa 158F/F 或 FcRIIIa 158F/V 的效应细

18、胞。 52. 根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述 N- 连接多糖表现出 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A5/7 页 6 变异方式， 该变异方式的特征在于， 半乳糖水平降低。 53.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述变异糖基化方式的特 征在于， 葡萄糖水平增加。 54. 根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞， 其产生这样的抗体， 该抗体表 现出的 ADCC 活性高于对应的未修饰的宿主细胞的 ADCC 活性。 55.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述变异糖

19、基化方式的特 征在于， 存在末端葡萄糖部分。 56.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述变异糖基化方式的特 征在于， 岩藻糖水平降低， 葡萄糖水平增加并且半乳糖水平降低。 57. 根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述 N- 连接方式具有式 I 或 II 所示的结构 ： (II)。 58.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为中华仓鼠 卵巢 (CHO) 细胞。 59. 根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞， 其中所述细胞为骨髓瘤细胞。 60. 根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞

20、， 其中所述细胞在至少约 60 代 后仍保持所述变异糖基化方式。 61. 一种培养基， 其包含根据权利要求 46 至 51 中任意一项所述的宿主细胞。 62.一种培养发酵罐， 其包含在无血清培养基中的多种根据权利要求46至51中任意一 项所述的宿主细胞。 63. 一种选择具有变异糖基化方式的真核细胞的方法， 包括 ： (a) 提供多个真核细胞 ； (b) 将随机基因突变引入到所述多个真核细胞中 ； 以及， (c) 从所述多个细胞中选择至少一个表现出变异糖基化方式的细胞， 所述变异糖基化 方式的特征在于， 与对应的未进行所述随机基因突变的母本细胞相比， 至少一种糖分子的 水平发生变化。 64.

21、根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述基因突变由化学诱变剂诱导。 65. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， 选自由葡萄 糖、 半乳糖、 甘露糖和葡萄糖胺中的一种或多种糖部分的水平发生变化。 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A6/7 页 7 66. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， 半乳糖水平 降低。 67. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， D- 葡萄糖胺 水平降低。 68. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在

22、于， 甘露糖水平 增加。 69. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， 存在末端葡 萄糖分子。 70. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体， 该抗 体表现出的 ADCC 活性高于对应的未进行所述随机基因突变的细胞的 ADCC 活性。 71. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体， 与对 应的由未进行所述随机基因突变的细胞产生的抗体相比， 该抗体对 FcRIIIA 受体的结合 亲和性增加。 72. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述真核细胞为中华仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。 73.

23、根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述真核细胞选自由 NS0、 SP2/0、 HEK293、 PER. C6 和 YB2/0 细胞组成的组。 74. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述真核细胞为骨髓瘤细胞。 75.根据权利要求63所述的方法， 其中所选择的所述细胞在至少约60代之后仍保持所 述变异糖基化方式。 76. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所选择的所述细胞在无血清培养基中生长。 77. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所选择的所述细胞在悬浮液中生长。 78. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所选择的所述细胞包含编码异源糖蛋白的异源 序列。 79.根据权利

24、要求63所述的方法， 其中所选择的所述细胞表达基本上同种方式的N-连 接多糖。 80.根据权利要求79所述的方法， 其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过质谱 解析的单峰来证实。 81. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， 所述 N- 连接 方式具有式 I 或 II 所示的结构 ： 权 利 要 求 书 CN 102216452 A CN 102216463 A7/7 页 8 82. 根据权利要求 63 所述的方法， 其中所述变异糖基化方式的特征在于， 半乳糖水平 降低， 葡萄糖水平增加， 并且岩藻糖水平降低。 权 利 要 求 书 CN 102216452

25、A CN 102216463 A1/45 页 9 具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质 0001 交叉引用 0002 本申请要求享有 2008 年 9 月 26 日提交的美国专利申请 No.61/194,292、 2008 年 12 月 8 日提交的美国专利申请 No.61/120,722、 以及 2009 年 4 月 9 日提交的美国专利申请 No.61/168,186 的优先权， 其全部内容以引用的方式并入本文。 技术领域 0003 已经表明碳水化合物、 糖类、 或者糖分子组成中的变化会影响 IgG 对三类 FcR(FcRI、 FcRII和FcRIII)的亲和性， 其中FcR将IgG-介导的

26、免疫反应与效应 子功能联系起来 (Wright 和 Morrison， Trends Biotechnol 15(1) ： 26-32 ； Gessner 等， Ann Hematol 76(6) ： 231-48(1998) ； Jefferis 等， Immunol Rev 163 ： 59-76(1998).Ravetch 和 Bolland， Annu Rev Immunol 19 ： 275-90(2001)。 0004 根据与蛋白质部分的结合形式的不同， 通常将糖蛋白的糖链分为下列两大类 ： 即， 与天冬酰胺结合的糖链(N-糖苷连接的糖链) ； 以及与其它氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)

27、结 合的糖链 (O- 糖苷连接的糖链 )。通常， 它们具有下述结构式 (I) 所示的基本共同核结构 ： 0005 0006 N-糖苷连接的糖链具有多种结构并具有不同糖分子。 与天冬酰胺结合的糖链末端 通常称为还原末端， 而相对的一侧称为非还原末端。N- 糖苷连接的糖链可以包括 ： 高甘露 糖型， 其中只有甘露糖与核心结构的非还原末端结合 ； 复合型， 其中核心结构的非还原末端 侧具有至少一个半乳糖 -N- 乙酰基葡萄糖胺 (Gal-GlcNAc) 的平行分支， 并且 Gal-GlcNAc 的非还原末端侧具有唾液酸结构， 将 N- 乙酰基葡萄糖胺等一分为二 ； 杂化型， 其中核心结 构的非还原末

28、端侧具有高甘露糖型和复合型这二者的分支 ； 等。可以通过糖链基因 ( 如合 成糖链的糖基转移酶的基因和 / 或水解糖链的糖分解酶的基因 ) 来确定糖链的结构。 0007 通常在内质网(ER)腔中通过糖链来修饰糖蛋白。 例如， 在N-糖苷连接的糖链的生 物合成步骤过程中， 相对较大的糖链转移至多肽链 ( 其在 ER 腔中延长 ) 中。糖分子可以连 续地被加入到包含约 20 个 - 异戊二烯单元的长链脂质载体的磷酸酯基 ( 如长醇磷酸酯 (P-Dol) 上。例如， N- 乙酰基葡萄糖胺 (GlcNAc) 被转移至 P-Dol 以形成 GlcNAc-P-P-Dol， 然后又有一个 GlcNAc 被转

29、移来从而形成 GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。接下来， 五个甘露糖 (Man) 被转移来从而形成 (Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol， 然后四个甘露糖和三个葡萄糖 (Glc) 被转移来。结果， 形成糖链前体 (Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-Dol， 其为核心寡糖。然后在 ER腔中， 包含14个糖的糖链前体可以被转移至具有天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏 氨酸序列的多肽。与核心寡糖结合的长醇焦磷酸酯 (P-P-Dol) 通常通过焦磷酸酶的水解作 用而被释放并成为长醇磷酸酯(P-Dol)， 并被回收。 通常在糖链结合到多肽上之后开始糖链 说

30、明 书 CN 102216452 A CN 102216463 A2/45 页 10 的修剪。例如， 在 -1， 2- 葡萄糖苷酶 I、 -1， 3- 葡萄糖苷酶 II 和 -1， 2- 甘露糖苷酶的 作用下， 在 ER 中消除 3 个 Glc 和 1 或 2 个 Man。 0008 在 ER 中经过修剪的糖蛋白可以被转移至高尔基体并被进一步修饰。例如， 存在于 高尔基体的顺 (cis) 面的是 N- 乙酰基葡萄糖胺磷酸转移酶 ( 其有助于甘露糖磷酸酯的添 加 )、 N- 乙酰基葡萄糖胺 1- 磷酸二酯 -N- 乙酰基葡萄糖胺酶和 - 甘露糖苷酶 I( 其将 Man 残基减少至 5 个 )。存

31、在于高尔基体中间部分的是 N- 乙酰基葡萄糖胺转移酶 I(GnTI) ( 其有助于复合型 N- 糖苷连接的糖链第一外侧 GlcNAc 的添加 )、 - 甘露糖苷酶 II( 其 有助于除去 2 个 Man)、 N- 乙酰基葡萄糖胺转移酶 II(GnTII)( 其有助于从外侧添加第二 GlcNAc)以及-1， 6-岩藻糖基转移酶(其有助于将岩藻糖添加至N-乙酰基葡萄糖胺的还 原末端 )。存在于高尔基体反 (trans) 面的是半乳糖转移酶 ( 其有助于半乳糖的添加 ) 以 及唾液酸转移酶 ( 其与 N- 乙酰基神经氨酸之类的唾液酸的添加有关 )。因此， 可以通过这 些不同酶的活性来形成不同的 N-

32、 糖苷连接的糖链。 0009 糖链结构变异、 或该链中不同糖分子含量引起的变异糖基化方式在糖蛋白 ( 如抗 体 ) 的效应子功能中发挥重要作用。例如， 在 IgG 型抗体的 Fc 区， 通常存在两个 N- 糖苷连 接的糖链结合位点。在血清 IgG 中， 糖链结合位点一般结合具有多个分支的复合型糖链， 并 且在血清 IgG 中唾液酸或等分 N- 乙酰基葡萄糖胺的添加较低。有多种方式和形式使得半 乳糖添加至复合型糖链的非还原末端并且使岩藻糖添加至还原末端中的 N- 乙酰基葡萄糖 胺 ( 例如参见 Leppanen 等人， Biochemistry， 36， 7026-7036(1997)。 001

33、0 岩藻糖基化为这样的过程的例子， 在该过程中， 新合成的抗体在细胞的高尔基体 中可以通过添加岩藻糖而被修饰。通过用结合有萤光团的 LCA( 扁豆凝集素 A， 其为一种 偏向性地与经岩藻糖修饰的蛋白质结合的化学品 ) 将细胞染色可以看到这种蛋白质修 饰。最近， 发现抗体的岩藻糖基化会影响抗体对人 FcR 的结合以及抗体依赖性细胞毒 性 (ADCC)。当抗体的岩藻糖水平低时， 抗体结合的亲和性以及抗体介导的 ADCC 大大提 高 (Shields 等人， J Biol Chem 277(30) ： 26733-4(2002) ； Shinkawa 等人， J Biol Chem 278(5) ：

34、 3466-73(2003)。 0011 蛋白质岩藻糖基化为这样的过程 ： 首先摄取自由的岩藻糖， 接下来被岩藻糖激酶 磷酸化并被 GDP- 岩藻糖焦磷酸化酶转化为 GDP- 岩藻糖。在分泌途径中岩藻糖基转移酶将 岩藻糖残基转移至多糖或蛋白质， 接着， 修饰后的糖蛋白被转运至分泌细胞表面。产生抗 体的细胞的岩藻糖基化状态与所产生的抗体中的岩藻糖含量相关， 并且在细胞和抗体水平 上， 没有岩藻糖基转移酶就不会发生岩藻糖基化(Yamane-Ohnuki等人， Biotechnol Bioeng 87(5) ： 614-22(2004)。 0012 ADCC 为重要的作用机理， 通过该作用机理， 治

35、疗性抗体诱导免疫反应并介导癌 细胞的杀死。治疗性抗体提高了 ADCC， 从而可以改善临床反应并降低治疗剂量， 从而减 少可能的副作用 (Adams 和 Weiner， Nat Biotechnol 23(9) ： 1147-57(2005)。体内模 型和临床试验已经表明治疗性抗体 ( 如赫赛汀 ) 具有细胞毒性， 包括 ADCC。在赫赛汀 诱导的胸部肿瘤退化和防止肺转移方面这些性质是主要因素 (Carter 等人， Proc Natl Acad Sci USA 89(10) ： 4285-9(1992) ； Lewis 等人， Cancer Immunol Immunother 37(4) ：

36、 255-63(1993) ； Cooley 等 人， Exp Hematol 27(10) ： 1533-41(1999) ； Clynes 等 人， Nat Med 6(4) ： 443-6(2000) ； Repka 等人， Clin Cancer Res 9(7) ： 2440-6(2003) ； Gennari 等 说 明 书 CN 102216452 A CN 102216463 A3/45 页 11 人， Clin Cancer Res 10(17) ： 5650-5(2004) ； Nahta 和 Esteva， Cancer Lett 232(2) ： 123-38(2006

37、)。另外， 已经表明， 由岩藻糖基化低的细胞产生的抗体能够提高 ADCC 活 性 (Shields 等人， J Biol Chem 277(30) ： 26733-4(2002) ； Shinkawa 等人， J Biol Chem 278(5) ： 3466-73(2003)。 0013 人 IgG1 亚型抗体的 ADCC 活性表达通常需要将抗体的 Fc 区结合至存在于效应 细胞 ( 如杀伤细胞、 天然杀伤细胞、 活化巨噬细胞等 (FcR) 以及各种补体成分 ) 的表面 上的抗体受体。已经表明， 对于这种结合反应而言， 抗体铰链区的第二域和 C 区 ( 下文称 为 C2 域 ) 以及与 C2

38、 域连接的糖链中的多个氨基酸残基是重要的。 0014 现在， 为了提高针对肿瘤细胞的单克隆抗体介导的 ADCC， 已提出了多种策略， 如 ： 1) 开发特定的抗癌抗体， 其中抗体的一个臂与 IgG 受体结合以更有效地吸引免疫效应细胞 (Segal 等人， J Immunol Methods 248(1-2) ： 1-6(2001) ； 2) 使用重组人细胞因子以增加 免疫效应细胞的效应子功能 (Carson 等人， Eur J Immunol 31(10) ： 3016-25(2001) ； Repka 等人， Clin Cancer Res 9(7) ： 2440-6(2003) ； 3)

39、使用 IgG- 细胞因子融合蛋白 (Penichet 和 Morrison， J Immunol Methods 248(1-2) ： 91-101(2001) ； 4) 改变抗体的 Fc 序列以提 高与 IgG 受体的结合 (Shields 等人， J Biol Chem 276(9) ： 6591-604(2001) ； 以及 5) 优 化Asn297-连接的碳水化合物的水平(Umana等人， Nat Biotechnol 17(2) ： 176-80(1999) ； Davies 等 人， Biotechnol Bioeng 74(4) ： 288-94(2001) ； Shinkawa

40、 等 人， J Biol Chem 278(5) ： 3466-73(2003)。 0015 一个方案是修饰抗癌抗体的岩藻糖含量以提高 FcR 和 ADCC 的结合亲和性。 IgG1 具有两个与 Asn297 结合的 N- 连接的低聚糖链， 该低聚糖链由三甘露糖基核心结构 ( 存在或不存在核心岩藻糖 )、 等分 N- 乙酰基葡萄糖胺和末端半乳糖构成 (Rademacher 等 人， Biochem Soc Symp 51 ： 131-48(1986)。早已经认识到 Asn297- 连接的碳水化合物在 免疫球蛋白 G 效应子功能中的性质和重要性。已经证明， 去岩藻糖化的利妥昔单抗 ( 其为 淋巴

41、癌治疗用抗 CD20 抗体 ) 以高亲和性与 FcRIIIa 强结合， 并且 ADCC 活性提高 100 倍 (Shinkawa 等人， J Biol Chem 278(5) ： 3466-73(2003) ； Yamane-Ohnuki 等人， Biotechnol Bioeng 87(5) ： 614-22(2004) ； Kanda 等人， Biotechnol Bioeng 94(4) ： 680-8(2006)。其 它文献已经表明， 与正常岩藻糖赫赛汀相比， 使低岩藻糖赫赛汀与 FcRIIIa 结合可以提 高约 50 倍， 结果， 赫赛汀介导的 ADCC 被实质性提高 (Shield

42、s 等人， J Biol Chem 277(30) ： 26733-40(2002)。这表明， 抗癌抗体的去岩藻糖基化使它们与 FcR 的结合亲和性增加 并提高了 ADCC。另外还表明， 岩藻糖含量的改变表示了用于提高抗体的抗癌免疫反应的方 式， 以提高它们的治疗有效性， 并且使该治疗可以扩展至对岩藻糖基化抗体无响应的癌症 患者。 0016 然而， 人们依然需求一种用于改变具有高治疗可能性的抗体的其它方法。 0017 发明概述 0018 存在这样的需求 ： 制备出效应子功能得以提高的治疗用蛋白质。通过制备具有变 异糖基化方式或者与对应的野生型蛋白质相比得以修饰的糖基化方式的细胞系和糖蛋白、 或

43、者制备在具有未被修饰的糖基化方式的细胞系中产生的蛋白质， 本发明公开提供了可满 足上述需求以及相关优点的方法和组成。 宿主细胞表达的糖蛋白的糖链含量的差异以及诸 如抗体等宿主细胞 ( 其可用来生产具有变异糖基化方式的糖蛋白 ) 的生长， 可以具有较高 说 明 书 CN 102216452 A CN 102216463 A4/45 页 12 的效应子功能。 0019 在一个实施方案中， 提供一种用于生产和选择宿主细胞的方法和组成， 其中所述 宿主细胞被修饰以产生与未被修饰的母本宿主细胞相比的变异糖基化方式。 具有变异糖基 化方式的宿主细胞的选择方法可以包括下列步骤 ： 提供多个宿主细胞 ； 将随

44、机基因突变引 入所述多个宿主细胞中 ； 以及从所述多个细胞中选出至少一个表现出变异糖基化方式的细 胞， 该变异糖基化方式的特征在于， 与对应的未进行所述随机基因突变的母细胞相比， 至少 一种糖分子的水平发生改变。另外， 可以通过化学诱变剂来诱导所述基因突变。 0020 所述宿主细胞可以为真核细胞， 如哺乳动物细胞。所述经修饰的宿主细胞可以为 中华仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。所述宿主细胞可以是经修饰的 CHO 细胞， 如 CHO-1E5、 CHO-3F 或 CHO-2.6 细胞。所述宿主细胞也可以是骨髓瘤细胞。所述经修饰的宿主细胞可以是 NS0、 SP2/0、 HEK293、 PER.C6 或

45、YB2/0 细胞。经修饰的所述宿主细胞表现出变异糖基化方式， 其 特征在于， 与未修饰的母本宿主细胞相比， 存在于宿主细胞表面的至少两种糖分子的水平 发生改变。 所述水平的改变可以是至少约一倍、 两倍、 三倍、 四倍、 五倍、 六倍、 七倍、 八倍、 九 倍、 十倍或更多倍。可以通过岩藻糖基化、 甘露糖基化、 N- 乙酰基葡萄糖氨基化、 或它们的 组合的水平变化来证明所述变异糖基化方式。 在一些实施方案中， 该变化可以是半乳糖、 葡 萄糖或这二者的水平的变化。 该变化可以是半乳糖、 葡萄糖或这二者的水平的增加或降低。 例如， 所述变化可以是葡萄糖水平增加并且半乳糖水平降低。 0021 在一些实

46、施方案中， 所述水平的变化可以是与未修饰的母本宿主细胞相比， 经修 饰的宿主细胞的岩藻糖基化水平降低。也可以通过甘露糖基化水平 ( 如 - 连接的甘露糖 的水平 ) 的变化来证明所述变异糖基化方式。在经修饰的宿主细胞中， 甘露糖基化水平可 以增加。 也可以通过N-乙酰基葡萄糖氨基化水平的变化(如在经修饰的宿主细胞中， N-乙 酰基葡萄糖氨基化降低或增加 ) 来证明所述变异糖基化方式。所述 N- 乙酰基葡萄糖氨基 化可以涉及 - 或 - 连接的 N- 乙酰基葡萄糖胺。与未修饰的母本宿主相比， 所述宿主细 胞被修饰以产生变异糖基化方式， 该宿主细胞可以具有与未修饰的母本宿主细胞相当的 1， 6-

47、岩藻糖基转移酶活性。在其它的方面中， 所述经修饰的宿主细胞可以在约 30、 40、 50、 60、 80、 100、 120、 150、 200、 1000 或更高代之后仍保持其变异糖基化方式。所述经修饰的宿主细 胞可以在无血清培养基、 混悬液和 / 或发酵罐中生长。 0022 在其它方面中， 本发明提供一种由经修饰的非淋巴宿主细胞产生的抗体群， 其中 所述非淋巴宿主细胞产生表现出基本上同种方式的 N- 连接多糖的抗体， 其中所述抗体群 的成员结合至少两个不同的抗原。 0023 在其它方面中， 本发明提供经修饰的宿主细胞， 其产生具有变异糖基化方式的 N- 连接的多糖， 所述变异糖基化方式的特

48、征在于， 一个或多个糖部分的水平发生改变， 其中 所述糖部分选自由葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的基团。 在一些实施方 案中， 所述变异糖基化方式的特征在于， 半乳糖的水平降低。在一些实施方案中， 所述变异 糖基化方式的特征在于， D- 葡萄糖胺的水平降低。在一些实施方案中， 所述变异糖基化方 式的特征在于， 甘露糖水平的增加。在一些实施方案中， 所述变异糖基化方式的特征在于， 葡萄糖水平的增加。在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主细胞产生抗体， 该抗体的 ADCC 活性高于对应的未修饰的宿主细胞的 ADCC 活性。在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主 细胞产生抗体， 与由对

49、应的未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比， 该抗体与 FcRIIIA 说 明 书 CN 102216452 A CN 102216463 A5/45 页 13 受体的结合亲和性增加。 在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO) 细胞。在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主细胞选自由 NS0、 SP2/0、 HEK293、 PER.C6 和 YB2/0细胞构成的组。 在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主细胞为骨髓瘤细胞。 在一些实 施方案中， 所述经修饰的宿主细胞在至少约 60 代后仍保持所述变异糖基化方式。在一些实 施方案中， 所述经修饰的宿主细胞在无血清培养基中生长。 在一些实施方案中， 所述经修饰 的宿主细胞在混悬液中生长。在一些实施方案中， 所述经修饰的宿主细胞包括编码异源糖 蛋白的异源序列。 0024 在其它方面， 本发明提供一种分离的宿主细胞， 该宿主细胞产生表现出基本上同 种方式的 N- 连接多糖的糖蛋白。在一些实施方案中， 所述基本上同种方式的 N- 连接多糖 通过质谱解析中的单峰来确认。在一些实施方案中， 所述 N- 连接方式具有式 I 或 II 所示 的结构， 其中， 岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一 4GlcNAc 连接。 0025