一种胰岛素衍生物的制备方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811074273.5 (22)申请日 2018.09.14 (71)申请人 苏州康宇生物科技有限公司 地址 215100 江苏省苏州市吴中区石湖西 路188号万达广场西楼13楼1301室 (72)发明人 龙乔明宫燚 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 曹成俊徐洋洋 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A23L 3

2、3/17(2016.01) A61K 38/28(2006.01) A61K 47/64(2017.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 一种胰岛素衍生物的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种胰岛素衍生物的制备方 法， 属于生物医药技术领域。 采用本发明的融合 体， 有效促进胰岛素原蛋白在机体内的活性最大 化， 本发明还提供一套优化的蛋白体外变性复性 反应体系， 以使无活性的转铁蛋白-胰岛素融合 蛋白转变为有活性的转铁蛋白-胰岛素融合蛋 白， 为转铁蛋白-胰岛素融合的高效、 低成本工业 化生产提供一种新的、 更为简化的工艺流程。 权利要求书1页 说明书5页 序列表

3、3页 附图4页 CN 109180819 A 2019.01.11 CN 109180819 A 1.一种胰岛素原-转铁蛋白融合体， 其特征在于， 所述胰岛素原-转铁蛋白融合体融合 表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰岛素蛋白和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的 转铁蛋白； 所述胰岛素蛋白和转铁蛋白之间通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker 连接。 2.一种权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因。 3.一种携带权利要求2所述的编码基因的表达载体。 4.根据权利要求3所述的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体为pET系列或pQE系列。 5.一种表

4、达权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的重组菌。 6.根据权利要求6所述的重组菌， 其特征在于， 所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌。 7.一种权利要求6所述的重组菌的构建方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)基因合成胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因； (2)将上述编码基因通过连接酶插入pET28a载体中； (3)将步骤(2)中插入编码基因的载体导入大肠杆菌BL21感受态细胞中， 得到所述的重 组菌。 8.一种权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的变性、 复性方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： (1)将包涵体先用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2各洗涤两次， 每次洗涤0.51.5h；

5、所述 的洗涤缓冲液1为50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100pH8.5； 所述的洗涤缓冲 液2为2M尿素， 50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100pH8.5； (2)将步骤(1)洗涤后的包涵体用变性液进行溶解； 所述变性液为8M尿素， 50mM Tris, 50mM NaCl,1mM EDTA， 50mM DTT， pH9.5； (3)将步骤(2)溶解的包涵体依次在复性液1、 复性液2、 复性液3、 复性液4和复性液5中 进行梯度透析复性， 每级透析1014h； 所述复性液1为6M尿素， 50mM

6、TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH9.5； 所述复性液2为4M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH9； 所述复性液3为2M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH8.5； 所述复性液4为1M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH8.0； 所述复性液5为0

7、.01M PBS pH7.5。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述透析是在4以下进行透析。 10.权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体在制备降血糖药物或保健品中的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109180819 A 2 一种胰岛素衍生物的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种胰岛素衍生物的制备方法， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 糖尿病是一类以血糖偏高为主要症状的代谢性疾病， 主要分为I型和II型。 I型糖 尿病(Type1 Diabetes Mellitus,T1DM)， 又名胰岛素依赖型糖尿病， 由自身免疫紊乱导致 的胰岛 -细胞缺失所

8、引起,多发生在儿童和青少年。 II型糖尿病则由于外周组织对胰岛素 的不敏感性(胰岛素抗性)， 而胰岛 -细胞又分泌不足而引起的一种胰岛素相对不足的一种 状况。 据世界卫生组织数据显示， 全球目前共有糖尿病患者4亿2千万， 另外还有1.6亿人处 于糖尿病前期。 糖尿病已成为严重危害人类健康的重大疾病之一。 0003 胰岛素是由人体胰岛 细胞产生的， 用于调节机体碳水化合物和脂肪代谢平衡的 重要激素。 在未来的20年， 全球所需要的胰岛素消费将从目前的120亿美元增加至540亿美 元。 0004 人血清转铁蛋白(Human Transferrin,hTF)是一种非血红素结合铁的 -球蛋白， 人转铁

9、蛋白具有N端和C端两个同源性极高的结构域， 能够与Fe3+紧密结合， 由肝脏合成并 最终分泌到血浆内。 由于转铁蛋白能够通过转铁蛋白受体介导的方式在血清中反复的循 环， 稳定性很高， 而且机体内各组织普遍分布有丰富的转铁蛋白受体， 有学者曾提出将转铁 蛋白作为一种蛋白标签与胰岛素分子进行融合来生产新的胰岛素衍生物。 这种以转铁蛋白 融合为基础的胰岛素衍生物至少有以下几个优点： (1)在血液中半衰期长， 稳定性高， 所以 降糖效果好； (2)转铁蛋白受体遍布机体各组织， 故其生物活性无组织局限性； (3)转铁蛋白 为一天然血清蛋白， 不会引起免疫或其它不良反应； (4)作为一种重组蛋白， 生产工

10、艺较其 它胰岛素衍生物更为简单； (5)胰岛素原转铁蛋白的融合体， 能够直接利用转铁蛋白受体介 导的方式进入肝脏， 并转变为有活性的胰岛素， 故不需要在体外进行C肽的切割。 因此， 转铁 蛋白-胰岛素融合蛋白具有很大的临床应用潜力。 0005 转铁蛋白-胰岛素融合蛋白可以通过应用转基因技术， 在培养的高等生物细胞中 进行生产。 然而， 利用培养的高等生物细胞进行转铁蛋白-胰岛素融合蛋白生产， 其产量相 对较低， 操作难度较大、 成本较高。 而大肠杆菌则具有生长快速， 生长周期短； 易在分子水平 上进行改造和修饰； 培养基便宜； 蛋白产量高的优势。 因此， 在胰岛素及其衍生物生产工业 上， 大肠

11、杆菌是目前应用最为广泛的表达系统。 0006 大肠杆菌表达系统虽然广泛应用于胰岛素生产工业上， 但存在着严重的技术瓶颈 问题。 大肠杆菌缺少真核细胞具有的蛋白翻译后的修饰能力， 因此表达出来的目标蛋白通 常会以不可溶的、 无活性的包涵体形式存在， 然后对来自包涵体的不溶蛋白进行复杂的变 性和复性操作， 使目标蛋白变为有活性。 采用这样的方式制备得到的胰岛素衍生物活性较 低， 并且稳定性有待进一步提升。 说明书 1/5 页 3 CN 109180819 A 3 发明内容 0007 为解决上述技术问题， 本发明提供一种胰岛素原-转铁蛋白融合体， 所述胰岛素 原-转铁蛋白融合体融合表达了核苷酸序列如

12、SEQ ID NO.1所示的胰岛素蛋白和核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示的转铁蛋白； 所述胰岛素蛋白和转铁蛋白之间通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker连接。 0008 本发明的第二个目的是提供一种所述胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因。 0009 本发明的第三个目的是提供一种携带上述编码基因的表达载体。 0010 在本发明的一种实施方式中， 所述表达载体为pET系列或pQE系列。 0011 本发明的第四个目的是提供一种表达所述胰岛素原-转铁蛋白融合体的重组菌。 0012 在本发明的一种实施方式中， 所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌。 0013 本发明的第五个目的是提供

13、一种所述重组菌的构建方法， 包括如下步骤： 0014 (1)基因合成胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因； 0015 (2)将上述编码基因通过连接酶插入pET28a载体中； 0016 (3)将步骤(2)中插入编码基因的载体导入大肠杆菌BL21感受态细胞中， 得到所述 的重组菌。 0017 本发明的第六个目的是提供一种所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的变性、 复性 方法， 包括如下步骤： 0018 (1)将包涵体先用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2各洗涤两次， 每次洗涤0.51.5h； 所述的洗涤缓冲液1为50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100 pH 8.5

14、； 所述的洗 涤缓冲液2为2M尿素， 50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100 pH 8.5； 0019 (2)将步骤(1)洗涤后的包涵体用变性液进行溶解； 所述变性液为8M尿素， 50mM Tris,50mM NaCl,1mM EDTA， 50mM DTT， pH 9.5； 0020 (3)将步骤(2)溶解的包涵体依次在复性液1、 复性液2、 复性液3、 复性液4和复性液 5中进行梯度透析复性， 每级透析1014h； 所述复性液1为6M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM

15、GSSG， pH 9.5； 所述复性液2为4M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM 0021 GSSG， pH 9； 所述复性液3为2M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH 8.5； 所述复性液4为1M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， pH 8.0； 所述复性液5为0.01M PBS pH 7.5。 0022 在本发明的一种实施方式中， 所述

16、透析是在4以下进行透析。 0023 本发明的第七个目的是提供所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体在制备降血糖药物 或保健品中的应用。 0024 本发明的有益效果是： 采用本发明的融合体， 有效促进胰岛素原蛋白在机体内的 活性最大化， 本发明还提供一套优化的蛋白体外变性复性反应体系， 以使无活性的转铁蛋 白-胰岛素融合蛋白转变为有活性的转铁蛋白-胰岛素融合蛋白， 为转铁蛋白-胰岛素融合 的高效、 低成本工业化生产提供一种新的、 更为简化的工艺流程。 附图说明 0025 图1为胰岛素原-转铁蛋白融合基因表达载体示意图； 说明书 2/5 页 4 CN 109180819 A 4 0026 图2为IPTG诱

17、导ProINS-Tf重组蛋白表达结果； A： 10SDS-PAGE分析ProINS-Tf的 表达情况； B： Western blot分析ProINS-Tf的表达情况(M： 蛋白marker； lane 1： pET28a/ BL21的细胞裂解产物； lane 2： 未诱导的pET28a-ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物； lane 3- 6分别为1mM IPTG诱导2h、 4h、 6h和8h的pET28a-ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物)； 0027 图3为ProINS-Tf重组蛋白的可溶性分析； M： 蛋白marker； lane 1： 未诱导pET28a- ProI

18、NS-Tf/BL21的细胞裂解产物； lane 2： pET28a-ProINS-Tf/BL21诱导8h的细胞裂解产 物； lane 3： pET28a-ProINS-Tf/BL21裂解沉淀； lane 4： pET28a-ProINS-Tf/BL21裂解上清； 0028 图4为IPTG诱导ProINS-NTf重组蛋白表达结果； A： 10SDS-PAGE分析ProINS-NTf 的表达情况； B： Western blot分析ProINS-NTf的表达情况(M： 蛋白marker； lane 1： pET28a/ BL21的细胞裂解产物； lane 2： 未诱导的pET28a-ProINS-

19、NTf/BL21的细胞裂解产物； lane 3-6分别为1mM IPTG诱导2h、 4h、 6h和8h的pET28a-ProINS-NTf/BL21的细胞裂解产物)； 0029 图5为ProINS-NTf重组蛋白的可溶性分析； M： 蛋白marker； lane 1： 未诱导pET28a- ProINS-NTf/BL21的细胞裂解产物； lane 2： pET28a-ProINS-NTf/BL21诱导8h的细胞裂解产 物； lane 3： pET28a-ProINS-NTf/BL21裂解沉淀； lane 4： pET28a-ProINS-NTf/BL21裂解上 清； 0030 图6为ProIN

20、S-Tf与ProINS-NTf复性对比； M： 蛋白marker； lane 1： 未诱导pET28a- ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物； lane 2： 未诱导pET28a-ProINS-NTf/BL21的细胞裂解产 物； lane 3:pET28a-ProINS-Tf/BL21诱导8h的细胞裂解产物； lane4： pET28a-ProINS-NTf/ BL21诱导8h的细胞裂解产物； lane 5： ProINS-Tf包涵体； lane 6： ProINS-NTf包涵体； lane7： 复性后可溶ProINS-Tf； lane8： 复性后可溶ProINS-NTf； 0031

21、图7为重组蛋白在1型糖尿病小鼠降血糖效果。 具体实施方式 0032 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0033 实施例1： 胰岛素原-转铁蛋白融合基因的构建 0034 以pET28a为基础载体 ,我们设计并构建了两种胰岛素原表达质粒:pET28a- Proinsulin-Tf(胰岛素原-转铁蛋白)和pET28a-Proinsulin-NTf(胰岛素原-转铁蛋白氨 端)(图1)， 这两个质粒表达的产物分别是胰岛原-转铁蛋白全长,胰岛原-转铁蛋白氨端的 融合蛋白。 在胰岛原序列与转铁蛋白序列

22、之间， 插入了一段连接序列， 其目的是使产生的融 合蛋白中胰岛原和转铁蛋白部分可以自由旋转， 互不制约二者的空间结构， 从而最大限度 发挥其生物活性。 0035 为了构建pET28a-Proinsulin-Tf(胰岛素原-转铁蛋白)， 我们先通过化学合成方 法得到一段DNA片段， 其中依次包括T7启动子(SEQ ID NO.5)、 Lac控制子(SEQ ID NO.6)、 胰 岛素原基因序列(SEQ ID NO.1)、 连接肽序列(SEQ ID NO.3)和人转铁蛋白基因序列(SEQ ID NO.2)。 这个片段分别在5 和3 端带有XbaI和NotI两个内切酶位点， 中间序列包含有编 译人胰

23、岛原全长(A链+B链+C肽)、 4H2连接肽、 人转轶蛋白全长的DNA序列。 合成以后， 该片段 通过T4DNA连接酶的作用， 直接被插入到pET28a载体的XbaI和NotI酶位点之间。 0036 为了构建pET28a-Proinsulin-NTf， 先以上述化学合成得到的DNA片段为模板， 通 说明书 3/5 页 5 CN 109180819 A 5 过PCR扩增的方法得到一段不含转铁蛋白碳端的DNA片段， 其中依次包括T7启动子(SEQ ID NO.5)、 Lac控制子(SEQ ID NO.6)、 胰岛素原基因序列(SEQ ID NO.1)、 连接肽序列(SEQ ID NO.3)和人转铁

24、蛋白氨端基因序列(SEQ ID NO.4)。 然后将该DNA片段， 经T4DNA连接酶反应， 插入到pET28a载体的XbaI和NotI酶切位点之间。 0037 实施例2： ProINS-Tf和ProINS-NTf重组蛋白的表达及可溶性分析 0038 将重组质粒转化入BL21感受态细胞， 涂布含Kan+抗性的LB平板上， 37倒置培养 16h， 挑取单菌落， 加在含Kan+抗性的LB培养基中， 37， 250rpm/min培养16h。 按照1:20的比 例， 取5ml菌液加入100ml含Kan+抗性和1葡萄糖的LB培养基， 250rpm/min摇3h， 使菌液的 OD600值为0.6-0.8，

25、 此时加入IPTG(终浓度1mM)进行诱导表达， 37分别诱导表达2h， 4h， 6h， 8h。 6000rpm/min离心10min收集菌体， 高压均质机破碎菌体， 12000rpm/min离心10min， 收集上清和沉淀， 利用10SDS-PAGE检测菌体内蛋白的表达水平及对表达蛋白的可溶性进 行分析。 图2结果显示， IPTG诱导约2小时后， 即开始有ProINS-Tf重组蛋白表达， 且其表达量 有随诱导时间延长而增加的趋势。 将诱导表达后的菌体通过高压均质机破碎， 分别取上清 和沉淀进行10SDS-PAGE分析， 结果发现(图3)ProINS-Tf重组蛋白大部分为不溶蛋白， 也 即以包

26、涵体的形式存在。 0039 与ProINS-Tf重组蛋白透导表达实验对比， 可以发现ProINS-NTf重组蛋白的表达 时间相接近， 但其产量明显高于ProINS-Tf重组蛋白(图4)。 我们推测， 这可能与ProINS-NTf 融合基因相对较小， 更易于被转录翻译有关。 0040 对ProINS-NTf融合蛋白可溶性分析结果发现， 与ProINS-Tf重组蛋白一样， 大部分 ProINS-NTf蛋白也是以不溶的包涵体形式存在(图5)。 0041 实施例3： ProINS-Tf及ProINS-NTf融合蛋白的变性复性 0042 图3和图5的结果显示ProINS-Tf和ProINS-NTf重组蛋

27、白均以不可溶的包涵体形式 存在表达于大肠杆菌中。 为了得到可溶的ProINS-Tf和ProINS-NTf重组蛋白， 我们将包涵体 先用洗涤缓冲液1(50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100PH8.5)和洗涤缓冲液2 (2M尿素， 50mM Tris， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1TritonX100PH8.5)各洗涤两次， 每次1h， 洗 涤后的包涵体用变性液(8M尿素， 50mM Tris， 50mM NaCl,1mM EDTA， 50mM DTT， PH9.5)溶解。 0043 下一步是对将溶解的包涵体蛋白进行变性复性处理。 首

28、先， 将包涵体液置于透析 袋， 在复性液1(6M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， PH9.5)， 复性液2(4M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， PH9)， 复性液3(2M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GSH， 0.1mM GSSG， PH8.5)， 复性液4(1M尿素， 50mM TrisHCl， 50mM NaCl， 1mM EDTA， 1.0mM GS

29、H， 0.1mM GSSG， PH8.0)， 复性液5(0.01M PBS PH7.5)中梯度透析复性， 每级12h， 透析过程在4下进行。 将 最后一步复性的蛋白12000rpm/min离心20min， 上清即为复性后的可溶蛋白。 0044 对包涵体进行洗涤， 变性和复性。 分别取等比例的包涵体， 变性产物以及复性产物 后进行10SDS-PAGE分析。 图6结果显示， 包涵体经过洗涤后纯度有所增加， 去除了大多数 的杂蛋白， 但是除了目的蛋白外在55kd附近依旧有着一条较明显的蛋白带， 结合图2中的 Western blot结果猜想可能是由于目的蛋白在表达过程中发生了部分的降解。 通过Ima

30、geJ 对条带灰度值分析， 大约有50重组蛋白通过复性转变成了可溶蛋白。 0045 实施例4： ProINS-Tf和ProINS-NTf的降糖活性检验 说明书 4/5 页 6 CN 109180819 A 6 0046 为了检测ProINS-Tf和ProINS-NTf的降糖活性， 我们利用链脲佐菌素(STZ)诱导胰 岛细胞凋亡的方式构建了1型糖尿病的小鼠模型。 然而向1型糖尿病的小鼠分别注射了PBS (n5)， 人胰岛素(67.5mg/dL， n5)和纯化后的ProINS-Tf和ProINS-NTf重组蛋白 (67.5mg/dL， n5)， 检测其血糖的变化情况。 如图6所示， 胰岛素在注射后

31、快速起效， 60分钟 后血糖就下降到了65mg/dL左右， 随后血糖急速上升， 120分钟血糖就接近于初始血糖水平。 ProINS-Tf(67.5mg/dL)注射后缓慢起效， 血糖下降更加平缓， 注射1小时内血糖变化不明 显， 240分钟左右血糖下降到120mg/dL， 之后缓慢的上升， 300分钟后血糖依旧维持在200mg/ dL以下。 而注射同样剂量的ProINS-NTf则没有对小鼠血糖产生任何明显的影响。 这些结果 说明ProINS-Tf(胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白)具有长效降血糖的活性， 而ProINS-NTf(胰 岛素原-转铁蛋白氨端融合蛋白)不具备降糖的生物学活性。 我们推测， 这

32、可能是由于转铁 蛋白与其受体的结合需要转铁蛋白N端和C端结构域的协同参与， 因此仅仅转铁蛋白的N端 结构域并不能够高效的结合转铁蛋白受体， 从而将胰岛素原带进肝脏转变成具有活性的胰 岛素。 0047 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范 围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明 的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说明书 5/5 页 7 CN 109180819 A 7 序列表 苏州康宇生物科技有限公司 一种胰岛素衍生物的制备方法 6 SIPOSequenceListing 1.0 1 258 DN

33、A (人工序列) 1 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact

34、 actgcaac 258 2 2037 DNA (人工序列) 2 gtccctgata aaactgtgag atggtgtgca gtgtcggagc atgaggccac taagtgccag 60 agtttccgcg accatatgaa aagcgtcatt ccatccgatg gtcccagtgt tgcttgtgtg 120 aagaaagcct cctaccttga ttgcatcagg gccattgcgg caaacgaagc ggatgctgtg 180 acactggatg caggtttggt gtatgatgct tacctggctc ccaataacct ga

35、agcctgtg 240 gtggcagagt tctatgggtc aaaagaggat ccacagactt tctattatgc tgttgctgtg 300 gtgaagaagg atagtggctt ccagatgaac cagcttcgag gcaagaagtc ctgccacacg 360 ggtctaggca ggtccgctgg gtggaacatc cccataggct tactttactg tgacttacct 420 gagccacgta aacctcttga gaaagcagtg gccaatttct tctcgggcag ctgtgcccct 480 tgtgcgg

36、atg ggacggactt cccccagctg tgtcaactgt gtccagggtg tggctgctcc 540 acccttaacc aatacttcgg ctactcggga gccttcaagt gtctgaagga tggtgctggg 600 gatgtggcct ttgtcaagca ctcgactata tttgagaact tggcaaacaa ggctgacagg 660 gaccagtatg agctgctttg cctggacaac acccggaagc cggtagatga atacaaggac 720 tgccacttgg cccaggtccc ttctc

37、atacc gtcgtggccc gaagtatggg cggcaaggag 780 gacttgatct gggagcttct caaccaggcc caggaacatt ttggcaaaga caaatcaaaa 840 gaattccaac tattcagctc tcctcatggg aaggacctgc tgtttaagga ctctgcccac 900 gggtttttaa aagtcccccc caggatggat gccaagatgt acctgggcta tgagtatgtc 960 actgccatcc ggaatctacg ggaaggcaca tgcccagaag ccc

38、caacaga tgaatgcaag 1020 cctgtgaagt ggtgtgcgct gagccaccac gagaggctca agtgtgatga gtggagtgtt 1080 序列表 1/3 页 8 CN 109180819 A 8 aacagtgtag ggaaaataga gtgtgtatca gcagagacca ccgaagactg catcgccaag 1140 atcatgaatg gagaagctga tgccatgagc ttggatggag ggtttgtcta catagcgggc 1200 aagtgtggtc tggtgcctgt cttggcagaa a

39、actacaata agagcgataa ttgtgaggat 1260 acaccagagg cagggtattt tgctgtagca gtggtgaaga aatcagcttc tgacctcacc 1320 tgggacaatc tgaaaggcaa gaagtcctgc catacggcag ttggcagaac cgctggctgg 1380 aacatcccca tgggcctgct ctacaataag atcaaccact gcagatttga tgaatttttc 1440 agtgaaggtt gtgcccctgg gtctaagaaa gactccagtc tctgta

40、agct gtgtatgggc 1500 tcaggcctaa acctgtgtga acccaacaac aaagagggat actacggcta cacaggcgct 1560 ttcaggtgtc tggttgagaa gggagatgtg gcctttgtga aacaccagac tgtcccacag 1620 aacactgggg gaaaaaaccc tgatccatgg gctaagaatc tgaatgaaaa agactatgag 1680 ttgctgtgcc ttgatggtac caggaaacct gtggaggagt atgcgaactg ccacctggcc

41、1740 agagccccga atcacgctgt ggtcacacgg aaagataagg aagcttgcgt ccacaagata 1800 ttacgtcaac agcagcacct atttggaagc aacgtaactg actgctcggg caacttttgt 1860 ttgttccggt cggaaaccaa ggaccttctg ttcagagatg acacagtatg tttggccaaa 1920 cttcatgaca gaaacacata tgaaaaatac ttaggagaag aatatgtcaa ggctgttggt 1980 aacctgagaa

42、aatgctccac ctcatcactc ctggaagcct gcactttccg tagacct 2037 3 138 DNA (人工序列) 3 gcagaggctg ctgctaaaga ggctgctgca aaagaggctg ctgcaaaaga ggctgctgca 60 aaagctgcag aggctgctgc taaagaggct gctgcaaaag aggctgctgc aaaagaggct 120 gctgcaaaag ctctcgag 138 4 1014 DNA (人工序列) 4 gtccctgata aaactgtgag atggtgtgca gtgtcgga

43、gc atgaggccac taagtgccag 60 agtttccgcg accatatgaa aagcgtcatt ccatccgatg gtcccagtgt tgcttgtgtg 120 aagaaagcct cctaccttga ttgcatcagg gccattgcgg caaacgaagc ggatgctgtg 180 acactggatg caggtttggt gtatgatgct tacctggctc ccaataacct gaagcctgtg 240 gtggcagagt tctatgggtc aaaagaggat ccacagactt tctattatgc tgttgct

44、gtg 300 gtgaagaagg atagtggctt ccagatgaac cagcttcgag gcaagaagtc ctgccacacg 360 ggtctaggca ggtccgctgg gtggaacatc cccataggct tactttactg tgacttacct 420 gagccacgta aacctcttga gaaagcagtg gccaatttct tctcgggcag ctgtgcccct 480 tgtgcggatg ggacggactt cccccagctg tgtcaactgt gtccagggtg tggctgctcc 540 acccttaacc a

45、atacttcgg ctactcggga gccttcaagt gtctgaagga tggtgctggg 600 序列表 2/3 页 9 CN 109180819 A 9 gatgtggcct ttgtcaagca ctcgactata tttgagaact tggcaaacaa ggctgacagg 660 gaccagtatg agctgctttg cctggacaac acccggaagc cggtagatga atacaaggac 720 tgccacttgg cccaggtccc ttctcatacc gtcgtggccc gaagtatggg cggcaaggag 780 gac

46、ttgatct gggagcttct caaccaggcc caggaacatt ttggcaaaga caaatcaaaa 840 gaattccaac tattcagctc tcctcatggg aaggacctgc tgtttaagga ctctgcccac 900 gggtttttaa aagtcccccc caggatggat gccaagatgt acctgggcta tgagtatgtc 960 actgccatcc ggaatctacg ggaaggcaca tgcccagaag ccccaacaga tgaa 1014 5 17 DNA (人工序列) 5 taatacgact cactata 17 6 25 DNA (人工序列) 6 ggaattgtga gcggataaca attcc 25 序列表 3/3 页 10 CN 109180819 A 10 图1 说明书附图 1/4 页 11 CN 109180819 A 11 图2 图3 说明书附图 2/4 页 12 CN 109180819 A 12 图4 图5 说明书附图 3/4 页 13 CN 109180819 A 13 图6 图7 说明书附图 4/4 页 14 CN 109180819 A 14