1、10申请公布号CN101965404A43申请公布日20110202CN101965404ACN101965404A21申请号200880127745722申请日2008122261/020,16620080110USC12N15/82200601C07K14/32520060171申请人先锋国际良种公司地址美国依阿华州72发明人安德烈R阿贝德董华休B罗施晓梅74专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理有限责任公司11204代理人王达佐洪欣54发明名称具有鞘翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因57摘要本发明提供获自苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS菌株的核酸,及其变体和其片段,其
2、编码具有针对包括鞘翅目的虫害的杀虫活性多肽。本发明的特定实施方式提供编码杀虫蛋白的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体,和包含实施方式的核酸的转化的微生物和植物。所述组合物用于控制害虫尤其是植物害虫的方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010090286PCT申请的申请数据PCT/US2008/0879462008122287PCT申请的公布数据WO2009/088735EN2009071651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书42页序列表3页附图0页CN101965405A1/2页21分离的核酸分子,选自A包含SEQIDNO1核苷酸序
3、列的核酸分子或其全长互补体;B与SEQIDNO1核苷酸序列具有至少80序列一致性的核酸分子或其互补体;C编码包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子;和D编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与SEQIDNO2氨基酸序列具有至少80序列一致性的氨基酸序列。2如权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述核苷酸序列是设计为在植物中表达的合成序列。3DNA构建体,包含如权利要求1所述的核酸分子。4如权利要求3所述的DNA构建体,还包含编码异源多肽的核酸分子。5宿主细胞,包含如权利要求3所述的DNA构建体。6如权利要求5所述的宿主细胞,所述细胞是细菌细胞。7如权利要求5所述的宿主细胞,所述细胞是植物细
4、胞。8转基因植物,包含如权利要求7所述的宿主细胞。9如权利要求8所述的转基因植物,其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。10如权利要求9所述的植物的转化的种子,其中所述种子包含所述DNA构建体。11具有杀虫活性的分离的多肽,选自A包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽;B包含与SEQIDNO2具有至少80序列一致性的氨基酸序列的多肽;C由SEQIDNO1核苷酸序列编码的多肽;和D由与SEQIDNO1核苷酸序列至少80一致的核苷酸序列编码的多肽。12如权利要求11所述的多肽,还包含异源氨基酸序列。13组合物
5、,包含如权利要求11所述的多肽。14如权利要求13所述的组合物,其中所述组合物选自粉末、粉剂、小球、颗粒、喷雾剂、乳剂、胶体和溶液。15如权利要求13所述的组合物,其中通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS细胞培养物来制备所述组合物。16如权利要求13所述的组合物,包括以重量计约1至约99的所述多肽。17控制鞘翅目害虫群体的方法,包括使所述群体与杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽接触。18杀死鞘翅目害虫的方法,包括使所述害虫与杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽接触,或向所述害虫喂食杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽。19
6、产生具有杀虫活性的多肽的方法,包括将如权利要求4所述的宿主细胞在表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养,所述多肽选自A包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽;B包含与SEQIDNO2具有至少80序列一致性的氨基酸序列的多肽;C由SEQIDNO1核苷酸序列编码的多肽;和D由与SEQIDNO1核苷酸序列至少80一致的核苷酸序列编码的多肽。权利要求书CN101965404ACN101965405A2/2页320植物,所述植物使DNA构建体稳定整合至其基因组,所述DNA构建体包含编码具有杀虫活性的蛋白的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列选自A包含SEQIDNO1核苷酸序列的核酸分子或其全长互补体;B与SEQ
7、IDNO1核苷酸序列具有至少80序列一致性的核酸分子或其互补体;C编码包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子;和D编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与SEQIDNO2氨基酸序列具有至少80序列一致性的氨基酸序列;其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子可操作连接。21如权利要求20所述的植物,其中所述植物是植物细胞。22保护植物免于害虫的方法,包括将至少一种包含编码杀虫多肽的核苷酸序列的表达载体引入所述植物或其细胞,其中所述核苷酸序列选自A包含SEQIDNO1核苷酸序列的核酸分子或其全长互补体;B与SEQIDNO1核苷酸序列具有至少80序列一致性的核酸分子或其互补体;C
8、编码包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子;和D编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与SEQIDNO2氨基酸序列具有至少80序列一致性的氨基酸序列。23如权利要求22所述的方法,其中所述植物产生具有针对鞘翅目害虫的杀虫活性的杀虫多肽。权利要求书CN101965404ACN101965405A1/42页4具有鞘翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因发明领域0001本发明涉及从新的苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS基因获得的天然存在的核酸和重组核酸,所述基因编码以抗虫害杀虫活性为特征的杀虫多肽。本发明的组合物和方法使用所公开核酸及其所编码的杀虫多肽来控制植物疫害。0002发明
9、背景0003虫害是世界农作物损失的主要因素。例如,西方玉米根虫WESTERNCORNROOTWORM进食、黑切根虫损害或欧洲玉米螟损害可以在经济上摧毁农业生产者。仅欧洲玉米螟攻击田地和甜玉米带来的虫害相关的农作物损失就已在损害和控制开销上达到每年十亿美元。0004传统地,影响虫害群体的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而,消费者与政府调节员一样越来越关心与生产和使用合成的化学杀虫剂相关的环境危害。调节员出于这种关心已禁止或限制使用一些更为危险的杀虫剂。因此,开发替代杀虫剂具有实质性利益。0005使用诸如真菌、细菌或其它昆虫物种的微生物剂对农业上重要的虫害进行生物学控制,这为合成的化学杀虫剂提供
10、了对环境友好且具有商业吸引力的替代途径。一般来讲,使用生物杀虫剂造成污染和环境危害的风险较低,并且生物杀虫剂相对于传统广谱化学杀昆虫剂的性质提供了更强的靶标特异性。此外,生物杀虫剂的生产成本通常更低,并因而提高大量品种的农作物的经济收益。0006已知芽孢杆菌属的某些种的微生物具有抗广谱虫害的杀虫活性,所述虫害包括鳞翅目LEPIDOPTERA、双翅目DIPTERA、鞘翅目COLEOPTERA、半翅目HEMIPTERA及其它。苏云金芽孢杆菌BT和甲虫芽孢杆菌BACILLUSPAPILLIAE属于迄今所发现的最为成功的生物控制剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌BLARVAE、缓病芽孢杆菌BLENTI
11、MORBUS、球形芽孢杆菌BSPHAERICUSHARWOOK,ED,1989BACILLUS芽孢杆菌PLENUMPRESS,306和蜡状芽孢杆菌BCEREUSWO96/10083菌株。虽然也已从营养生长期的芽孢杆菌分离出杀虫蛋白,但是杀虫活性看上去集中在伴孢晶体蛋白包涵体上。已分离并表征编码这些杀虫蛋白的数种基因参见,例如,美国专利第5,366,892号和第5,840,868号。0007微生物杀昆虫剂,特别是获自芽孢杆菌菌株的那些,作为化学疫害控制的替代品在农业上起重要作用。近来,农业科研工作者通过基因工程改造农作物植物来产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白,已开发出具有增强的昆虫抗性的农作物植物。例
12、如,玉米和棉花植物已被基因工程化以产生分离自BT菌株的杀虫蛋白参见,例如,ARONSON2002CELLMOLLIFESCI593417425;SCHNEPFETAL1998MICROBIOLMOLBIOLREV623775806。这些基因工程农作物现在广泛用于美国农业,并且向农民提供了传统昆虫控制方法的环境友好替代品。此外,已向美国农民销售经基因工程改造而包含杀虫的CRY毒素的马铃薯。这些基因工程改造的抗昆虫的农作物植物已被证明在商业上非常成功,但是它们仅提供对小范围的商业上重要虫害的抗性。0008因此,仍需要具有更广泛的抗虫害杀昆虫活性的新的BT毒蛋白,例如对鞘翅目中说明书CN101965
13、404ACN101965405A2/42页5更多品种的昆虫具有活性的毒素。此外,仍需要具有抗更多虫害活性的生物杀虫剂和具有改良杀昆虫活性的生物杀虫剂。0009发明概述0010本发明提供影响虫害的组合物和方法。更具体地,本发明的实施方式涉及影响昆虫的方法,所述方法利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列,从而产生表达实施方式中的杀昆虫多肽的转化的微生物和植物。这些害虫包括农业上重要的害虫,诸如,例如,西方玉米根虫,例如玉米根萤叶甲DIABROTICAVIRGIFERALECONTE。在一些实施方式中,该核苷酸序列编码对属于鞘翅目的至少一种昆虫具有杀虫性的多肽。0011实施方式提供核酸及其片段和其变体,其编码
14、具有抗虫害杀虫活性的多肽例如,编码SEQIDNO2的SEQIDNO1。实施方式的野生型例如,天然存在的核苷酸序列编码新的杀昆虫肽,所述核苷酸序列获得自BT。实施方式还提供所公开的编码生物学活性例如,杀昆虫多肽的核苷酸序列的片段及变体。0012实施方式还提供分离的杀虫例如,杀昆虫多肽,其由实施方式的天然存在的核酸或经修饰的例如,突变的或经操作的核酸所编码。在特定实例中,实施方式的杀虫蛋白包括全长蛋白和多肽的片段,其产生自突变的核酸,所述核酸经设计以将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中,所述多肽相对于其衍生自的天然存在的多肽具有增强的杀虫活性。0013实施方式的核酸还可以用于产生转
15、基因的例如,转化的单子叶或双子叶植物,所述植物的特征在于基因组包含至少一个稳定整合的核苷酸构建体,所述构建体包含实施方式的编码序列,所述编码序列与驱动所编码杀虫多肽表达的启动子可操作地连接。因此,还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。0014在特定实施方式中,可以使用经优化而在宿主植物中提高表达的核酸来产生转化的植物。例如,可以回译BACKTRANSLATE实施方式的一种杀虫多肽,从而产生包含为在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸,所述特定宿主例如诸如玉米ZEAMAYS植物的农作物植物。这种转化的植物例如,双子叶或单子叶植物表达编码序列,从而导致产生杀虫多肽,并赋予所述植物增加的昆虫抗
16、性。一些实施方式提供表达杀虫多肽的转基因植物,所述杀虫多肽用于影响各种虫害的方法。0015实施方式还包括含有实施方式的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物,并且可以任选地包括另外的杀昆虫肽。实施方式包括将该组合物应用于虫害环境,从而影响虫害。0016发明详述0017本发明的实施方式涉及影响虫害、特别是植物疫害的组合物和方法。更为具体地,实施方式的分离的核酸及其片段和其变体包含编码杀虫多肽例如蛋白的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对诸如但不限于鞘翅目虫害的虫害具有生物学活性例如杀虫性。目的虫害包括但不限于西方玉米根虫玉米根萤叶甲。0018实施方式的组合物包含分离的核酸及其片段和其变体,其编码杀虫多肽、包含
17、实施方式的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白和杀虫组合物。一些实施方式提供经修饰的杀虫多肽,所述多肽的特征在于相对于相应野生型蛋白的杀虫活性具有改良的抗鞘翅目杀昆虫活性。实施方式还提供用这些新的核酸转化的植物和微生物,以及涉及将该核酸、杀虫组合物、转化生物体及其产物用于影响虫害的方法。说明书CN101965404ACN101965405A3/42页60019实施方式的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物体,从而产生所编码的杀虫蛋白。所提供的方法涉及将该转化生物体用于影响或控制植物疫害。实施方式的核酸和核苷酸序列还可以用于转化诸如叶绿体的细胞器MCBRIDEETAL1995BIOTECHNOLO
18、GY13362365;和KOTAETAL1999PROCNATLACADSCIUSA9618401845。0020实施方式还涉及鉴定编码生物学活性杀虫蛋白的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核苷酸序列直接用于影响疫害、特别是诸如鞘翅目疫害的虫害的方法。因此,实施方式提供影响虫害的新方法,所述方法不依赖传统的合成的化学杀昆虫剂的使用。实施方式涉及发现天然存在的、可生物降解的杀虫剂以及编码它们的基因。0021实施方式还提供同样编码生物学活性例如,杀虫多肽的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核酸包括经优化用于特定生物体的细胞表达的核酸或核苷酸序列,例如使用植物偏好密码子,以具有增强杀虫活
19、性的多肽氨基酸序列为基础而回译即反向翻译的核酸序列。实施方式还提供突变,所述突变赋予实施方式的多肽改良的或改变的性质。参见,例如,共同未决的2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号和2003年12月24日提交的第10/746,914号。0022在随后的描述中,广泛使用了大量术语。为促进对实施方式的理解,提供以下定义。0023可以用SI可接受的形式表示单位、前缀和符号。除非另有所指,分别地,核酸以5至3方向从左向右书写;氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。数字范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPACIUB生物化学命名委员会推荐的一字母符
20、号来表示。同样地,可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。参考说明书整体更为充分地定义以上定义的术语。0024如本文所用,“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物,并且除非另有限制,包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物例如,肽核酸,所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。0025如本文所用,术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时,指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以包含位于该核酸翻译区内的非翻译序列例如,内含子或者可以缺少这样的居间非翻译序列例如,如同在CDNA中。0026如本文所
21、用,涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然非合成内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。0027如本文所用,用于核苷酸序列方向上下文的术语“反义”涉及二倍多核苷酸序列,所述多核苷酸序列以转录该反义链的方向与启动子可操作地连接。该反义链与内源转录产物充分互补,以致该内源转录产物的翻译通常受抑制。因而,将术语“反义”用于特定核苷酸序列的上下文时,该术语涉及该参考转录产物的互补链。0028本文可互换地使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”,以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工
22、化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。0029本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”,以指被并入蛋白、多说明书CN101965404ACN101965405A4/42页7肽或肽统称“蛋白”的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸,并且除非另有限制,可以包括天然氨基酸的已知类似物,所述类似物可以以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。0030可以从本文公开的核酸或者使用标准分子生物学技术制备实施方式的多肽。例如,可以通过在适当宿主细胞中表达实施方式的重组核酸,或可选择地通过间接体内EXVIVO方法的组合,来制备实施方式的蛋白。0031如本文所用,可以互换地使用术语“分离的
23、”和“纯化的”,以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分,其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而,用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时,分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基,或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时,基本上不含化学前体或其它化学品。0032“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸即位于该核酸5和3端的序列的序列诸如,例如编码蛋白的序列。例如,在各种实施方式中,所分离的核酸可以包含少于约5KB,4KB,3KB,2KB,1KB,05KB或01KB的核苷酸序列,所述核苷酸序列在该核
24、酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸。0033如本文所用,将术语“分离的”或“纯化的”用于涉及实施方式的多肽时,指分离的蛋白基本上不含细胞物质并且包含具有少于约30,20,10或5干重计的污染蛋白的蛋白制备物。当重组地产生实施方式的蛋白或其生物学活性部分时,培养基代表少于约30,20,10或5干重计的化学前体或非目的蛋白化学品。0034贯穿申请文件,将词语“包括COMPRISING”或诸如“包括COMPRISES”或“包括COMPRISING”的变体理解成提示包含所称元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组,而非排除任何其它元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组。0035如本
25、文所用,术语“影响虫害”指对任何发育阶段的昆虫进食、生长和/或行为的有影响的改变,包括但不限于杀灭昆虫、延迟生长、阻碍生殖能力、拒食素活性等等。0036如本文所用,将术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地使用以指生物体或物质诸如,例如蛋白的活性,其测量可以通过但不限于害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性REPELLENCY以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。因而,具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响至少一种可测量的害虫健康参数。例如,“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。0037如本文所用,术语“杀虫有效量”指存在于害虫环境的具有杀虫活性的物质或生物体的量。
26、对每一物质或生物体而言,通过经验来确定在特定环境中受影响的每一害虫的杀虫有效量。类似地,当害虫是昆虫时,“杀昆虫有效量”可以用于指“杀虫有效量”。0038如本文所用,术语“重组工程化的”或“工程化的”指利用重组DNA技术引入例如工程化蛋白结构的改变,这基于对蛋白作用机制的理解以及对被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考虑。0039如本文所用,术语“突变核苷酸序列”或“突变”或“诱变的核苷酸序列”指经诱变或改变而包含一个或多个核苷酸残基例如碱基对的核苷酸序列,所述核苷酸残基不存在于相应的野生型序列中。这样的诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、缺失或取代或说明书CN101965404ACN10196
27、5405A5/42页8替换所组成。当通过添加、移除或替换蛋白水解位点的氨基酸来制备突变时,这样的添加、移除或替换可以在该蛋白水解位点基序内或邻近该基序,只要完成了突变的目的即只要改变了该位点的蛋白水解。0040突变体核苷酸序列可以编码突变体杀昆虫毒素,所述毒素显示改良的或降低的杀昆虫活性,或者可以编码氨基酸序列,所述氨基酸序列赋予包含它的多肽改良的或降低的杀昆虫活性。如本文所用的,蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的术语“突变体”或“突变”指经突变或经改造而包含一个或多个氨基酸残基的序列,所述氨基酸残基不存在于相应的野生型序列中。这样的突变或改变由氨基酸残基的一个或多个添加、缺失或取代或替换所组成。
28、突变体多肽显示改良的或降低的杀昆虫活性,或者代表氨基酸序列,所述氨基酸序列赋予包含它的多肽改良的杀昆虫活性。因而,术语“突变体”或“突变”指突变体核苷酸序列和所编码的氨基酸之一或两者。突变体可以单独使用或者与其它突变体或与实施方式的其它突变体相容地任意组合使用。“突变体多肽”可以相反地显示杀昆虫活性的降低。将超过一个突变添加至特定核酸或蛋白时,所述突变可以同时或顺序添加;如果顺序添加,突变可以以任何合适的次序添加。0041如本文所用,术语“改良的杀昆虫活性”或“改良的杀虫活性”涉及实施方式的杀昆虫多肽,所述多肽相对于其相应的野生型蛋白具有增强的杀昆虫活性,和/或涉及对更广谱的昆虫有效的杀昆虫多
29、肽,和/或涉及对不易受野生型蛋白毒性影响的昆虫具有特异性的杀昆虫多肽。改良的或增强的杀虫活性的发现需要证明相对于野生型杀昆虫多肽的杀虫活性,对昆虫靶标的杀虫活性提高至少10,或者杀虫活性提高至少20,25,30,35,40,45,50,60,70,100,150,200或300或更多,所述活性的确定是针对同样的昆虫。0042例如,提供改良的杀虫或杀昆虫活性,其中相对于受野生型BT毒蛋白影响的昆虫的范围,受该多肽影响的昆虫的范围更宽或者更窄。当需要多功能性时,可能需要较宽的影响范围,而当例如有益的昆虫另外有可能受该毒素的使用或存在所影响时,可能需要较窄的影响范围。虽然实施方式不受任何特别的作用机
30、制的限制,但是也可以通过改变多肽的一个或多个特性来提供改良的杀虫活性;例如,可以增加多肽在昆虫肠内的稳定性或寿命,所述增加相对于相应野生型蛋白的稳定性或寿命。0043本文所用术语“毒素”指表现杀虫活性或杀昆虫活性或改良的杀虫活性或改良的杀昆虫活性的多肽。“BT”或“苏云金芽孢杆菌”毒素意在包括在BT的各种菌株中发现的较宽种类的CRY毒素,其包括诸如例如CRY1S,CRY2S或CRY3S的毒蛋白。0044术语“蛋白水解位点”或“切割位点”指氨基酸序列,其将敏感性赋予一类蛋白酶或特别的蛋白酶,以致包含所述氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或特别的蛋白酶所消化。据称,蛋白水解位点对识别该位点的一种或多种蛋
31、白酶“敏感”。本领域理解,消化效率各不相同,并且消化效率的降低可以导致该多肽在昆虫肠内稳定性或寿命的增加。因而,蛋白水解位点可以将敏感性赋予不止一种蛋白酶或者不止一类蛋白酶,但是各种蛋白酶对该位点的消化效率可以各不相同。蛋白水解位点包括,例如,胰蛋白酶位点、糜蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。0045例如,研究已表明鳞翅目的昆虫肠蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶。参见,例如,LENZETAL1991ARCHINSECTBIOCHEMPHYSIOL16201212;和说明书CN101965404ACN101965405A6/42页9HEDEGUSETAL2003ARCHINSECTBIOCHE
32、MPHYSIOL533047。例如,已在HELICOVERPAARMIGERA幼虫的中肠内发现约18种不同的胰蛋白酶参见GATEHOUSEETAL1997INSECTBIOCHEMMOLBIOL27929944。已研究了这些蛋白酶所偏好的蛋白水解底物位点。参见,例如PETERSONETAL1995INSECTBIOCHEMMOLBIOL25765774。0046已努力理解BT毒蛋白的作用机制并利用改良的性质工程化毒素。已表明昆虫肠蛋白酶可以影响BTCRY蛋白对该昆虫的影响。一些蛋白酶通过将CRY蛋白从“毒素原PROTOXIN”形式加工至毒性形式或“毒素”,来活化CRY蛋白。参见OPPERT19
33、99ARCHINSECTBIOCHEMPHYS42112;和CARROLLETAL1997JINVERTEBRATEPATHOLOGY704149。该毒蛋白的活化可以包括从所述蛋白移除N末端和C末端肽,并且还可以包括从内部切割该蛋白。其它蛋白酶可以降解所述CRY蛋白。参见OPPERT,如前。0047不同特异性的CRY毒素的氨基酸序列的比较揭示了5个高度保守的序列单元BLOCK。所述毒素在结构上包含3个不同的结构域,从N末端到C末端为涉及孔形成的7个螺旋的簇称作“结构域1”、涉及细胞结合的3个反平行片层称作“结构域2”以及三明治称作“结构域3”。本领域技术人员已知这些结构域的位置和性质。参见,例
34、如,LIETAL1991NATURE,305815821和MORSEETAL2001STRUCTURE,9409417。涉及特定结构域,例如涉及结构域1时,应理解关于特定序列的结构域的确切终点并不是关键的,只要该序列或其部分包含提供归因于该特定结构域的至少一些功能的序列。因而,例如,当提及“结构域1”时,意在指特定序列包括7个螺旋的簇,但所用序列或关于该簇的序列的确切终点并不关键。本领域技术人员熟悉这类终点的确定以及对这类功能的评价。0048为了尝试更好地表征和改良BT毒蛋白,研究了BT细菌菌株。发现从BT菌株培养物制备的晶体制备物具有抗西方玉米根虫的杀虫活性见实施例1。尝试鉴定来自所选菌株的
35、编码晶体蛋白的核苷酸序列,从这些细菌菌株分离实施方式的野生型即天然存在的核酸,将其克隆至表达载体并转化进大肠杆菌。依赖给定制备物的特性,认识到杀虫活性的证明有时需要胰蛋白酶预处理以活化该杀虫蛋白。因而,应理解一些杀虫蛋白的活化需要蛋白酶消化例如,通过胰蛋白酶、糜蛋白酶等等,而其它蛋白在无活化作用下便是生物活性的例如,杀虫性。0049可以通过2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号和2003年12月24日提交的第10/746,914号所述的方法改造所述分子。此外,可以将核酸序列工程化,以编码包含另外的突变的多肽,所述突变赋予相对于天然存在的多肽的杀虫活性的改良的或改变的杀虫活性
36、。该工程化的核酸的核苷酸序列包含未在野生型序列中发现的突变。0050通常通过包括以下步骤的方法制备实施方式的突变体多肽获得编码CRY家族多肽的核酸序列;分析所述多肽的结构,以鉴定特定“靶”位点的潜在基因序列的诱变,这基于对所述靶结构域在毒素作用模式中的所提议功能的考虑;将一个或多个突变引入核酸序列以产生对所编码多肽序列的一个或多个氨基酸残基的所需改变;以及分析所产生多肽的杀虫活性。0051BT杀昆虫毒素中的许多都是相关的,其氨基酸序列和三级结构的相似程度各不相同,并且公知获得BT毒蛋白晶体结构的方法。从文献可获得示例性的CRY3A和CRY3B多肽两者的高分辨率晶体结构解析。解析到的CRY3A基
37、因结构LIETAL1991NATURE353说明书CN101965404ACN101965405A7/42页10815821提供了对该毒素结构与功能间关系的深刻理解。组合考虑BT毒素的已公开的结构分析和所报道的与特定结构、基序等等相关的功能,说明该毒素的特定区域与该蛋白的特定功能和特定作用模式的不连续步骤相关。例如,通常将分离自BT的许多毒素描述为包含三个结构域涉及孔形成的7螺旋束、涉及受体结合的3片层结构域和三明治基序LIETAL1991NATURE353815821。0052如美国专利第7,105,332号和2003年12月24日提交的未决美国申请第10/746,914号所报道,可以通过将
38、位于该毒素结构域1的螺旋3和4之间的区域作为靶标,来改良CRY蛋白的毒性。这一理论建立于关于杀昆虫毒素的知识体系,包括1据报道CRY3A毒素结构域1的螺旋4和5插入内衬易感昆虫中肠的细胞的脂双分子层GAZITETAL1998PROCNATLACADSCIUSA951228912294;2发明人了解野生型蛋白氨基酸序列内胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的位置;3观察到在借助胰蛋白酶或糜蛋白酶处理的体外活化之后,野生型蛋白对某些昆虫更具活性;以及4报道从3端消化毒素导致了对昆虫毒性的降低。0053可以制备一系列突变,并将其置于各种背景序列中,从而制备具有增强的或者改变的杀虫活性的新的多肽。参见,例如,如
39、今已放弃的、2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号以及2003年12月24日提交的第10/746,914号。这些突变体包括但不限于在位于结构域1的螺旋3和4之间的区域另外添加至少一个蛋白酶敏感的位点例如胰蛋白酶切割位点;用不同蛋白酶敏感的位点替换野生型序列的原始蛋白酶敏感的位点;在特定位置添加多蛋白酶敏感位点;在一个或多个蛋白酶敏感的位点附近添加氨基酸残基,从而改变所述多肽的折叠并因而增强在该一个或多个蛋白酶敏感的位点处的多肽消化;和添加突变以保护该多肽免受使毒性降低的降解性消化例如,制备一系列突变,其中用缬氨酸替换野生型氨基酸以保护所述多肽免于消化。可以单独或以任意组合使
40、用突变,从而提供实施方式的多肽。0054实施方式以这种方式提供包含各种突变的序列,所述突变诸如,例如包含位于所编码多肽结构域1的螺旋3和4之间的另外的或可选择的蛋白酶敏感位点的突变。另外的或可选择的蛋白酶敏感位点的突变可以对诸如丝氨酸蛋白酶的数种蛋白酶或者诸如弹性蛋白酶的酶敏感,所述丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和糜蛋白酶。因而,另外的或者可选择的蛋白酶敏感位点的突变可以经设计以致该位点被蛋白酶类容易地识别和/或切割,所述蛋白酶诸如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶。还可以将蛋白酶敏感的位点设计为被已知产生于生物体的特定种类的酶或特定酶切割,所述酶诸如,例如棉铃虫HELIOTHISZEA产生的糜蛋白酶LEN
41、ZETAL1991ARCHINSECTBIOCHEMPHYSIOL16201212。突变还可以赋予对蛋白水解消化的抗性,例如对糜蛋白酶在所述肽的C末端的消化的抗性。0055所编码多肽的氨基酸序列存在另外的和/或可选择的蛋白酶敏感位点,这可以提高实施方式的核酸编码的多肽的杀虫活性和/或杀虫特异性。因此,实施方式的核苷酸序列可以被重组工程化或者被操作以产生具有改良的或改变的杀虫活性和/或特异性的多肽,所述改良或改变相对于未经修饰的野生型毒蛋白。另外,本文公开的突变可以被置于其它核苷酸序列或与其它核苷酸序列联用,从而提供改良的性质。例如,昆虫糜蛋白酶容易切割的蛋白酶敏感位点可以被置于CRY背景序列,
42、以提供针对该序列的改良的毒性,所述昆虫糜蛋白酶例如在花边粘虫BERTHAARMYWORM或棉铃虫中发现的糜蛋白酶HEGEDUSET说明书CN101965404ACN101965405A8/42页11AL2003ARCHINSECTBIOCHEMPHYSIOL533047;和LENZETAL1991ARCHINSECTBIOCHEMPHYSIOL16201212。实施方式以这种方式提供具有改良性质的毒性多肽。0056例如,突变的CRY核苷酸序列可以包含另外的突变体,所述突变体包含将第二胰蛋白酶敏感的氨基酸序列除开天然存在的胰蛋白酶位点引入所编码多肽的另外的密码子。实施方式的可选择的添加突变体包含
43、另外的密码子,所述密码子经设计以将至少一个另外的不同的蛋白酶敏感的位点引入该多肽,例如,紧靠天然存在的胰蛋白酶位点5或3的糜蛋白酶敏感的位点。可选择地,可以制备取代突变体,其中破坏编码天然存在的蛋白酶敏感位点的核酸的至少一个密码子,并且将可选择的密码子引入核酸序列,从而提供不同的例如取代的蛋白酶敏感的位点。还可以将替换突变体添加至CRY序列,其中破坏所编码多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位点,并且将糜蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点引入它的位置。0057认识到可以使用编码蛋白水解位点或推定的蛋白水解位点例如诸如NGSR、RR或LKM的序列氨基酸序列的任何核苷酸序列,并且用于将这些切割位点中的任何位
44、点引入变体多肽的密码子的确切身份可以根据用途而不同,所述用途即在特定植物物种中的表达。还认识到所公开突变中的任何突变可以被引入实施方式的任一多核苷酸序列,所述序列包含提供天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基的密码子,所述切割位点是修饰的靶标。因此,可以修饰全长毒素或其片段的变体,以包含另外的或可选择的切割位点,并且这些实施方式意在为本文公开的实施方式的范围所包括。0058本领域技术人员会理解,只要所编码多肽保留杀虫活性,任何有用的突变可以被添加至实施方式的序列。因而,也可以突变序列,以致所编码多肽对糜蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。可以以任何组合在特定位置添加超过一个的识别位点,并且可以向所述毒素添
45、加或从所述毒素移除多识别位点。因而,另外的突变可以包括3个、4个或更多个识别位点。将认识到可以在任一合适的多核苷酸序列中工程化多突变;因此,可以修饰全长序列或其片段,以包含另外的或可选择的切割位点以及对蛋白水解消化具有抗性。如此,实施方式提供包含突变的CRY毒素,所述突变改善杀虫活性,实施方式还提供改良的组合物以及使用其它BT毒素影响害虫的方法。0059突变可以保护该多肽免于蛋白酶降解,所述保护例如是通过从不同区域移除诸如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点的推定的蛋白水解位点。可以移除或改造这些推定位点的一些或全部,以致原始位点位置的蛋白水解被降低。可以通过比较突变体多肽和野生型毒素或
46、者通过比较氨基酸序列各不相同的突变体毒素,来评价蛋白水解的变化。蛋白水解位点和推定的蛋白水解位点包括但不限于以下序列RR,胰蛋白酶切割位点;LKM,糜蛋白酶位点;和NGSR,胰蛋白酶位点。只要所述多肽的杀虫活性被提高,可以通过添加或缺失任意数目和种类的氨基酸残基来改造这些位点。因而,相对于天然序列或背景序列,由包含突变的核苷酸序列编码的多肽将包含至少一个氨基酸改变或添加,或者2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,32,35,38,40,45,47,50,60,70,80,90
47、,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270或280或更多个氨基酸改变或添加。如本领域所知,还可以通过截短天然或全长序列来提高多肽的杀虫活性。0060实施方式的组合物包括核酸及其片段和其变体,其编码杀虫多肽。特别地,实施方说明书CN101965404ACN101965405A9/42页12式提供分离的核酸分子,所述核酸分子包含编码SEQIDNO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列,或者包含编码所述氨基酸序列的核苷酸序列,例如SEQIDNO1所示的核苷酸序列,及其片段和其变体。0061另外受到关注的是编
48、码实施方式的杀虫蛋白的优化核苷酸序列。如本文所用,短语“优化核苷酸序列”指为在特定生物体表达而优化的核酸,所述特定生物体例如是植物。可以使用本领域已知方法制备用于任何目的生物体的优化核苷酸序列。参见,例如,如今已放弃的、2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号以及2003年12月24日提交的第10/746,914号,它们描述了编码所公开杀虫蛋白的优化核苷酸序列。在本实施例中,所述核苷酸序列的制备是通过反向翻译蛋白的氨基酸序列,并改变核苷酸序列以致包含玉米偏好密码子但仍编码相同的氨基酸序列。该方法的更多细节描述于MURRAYETAL1989NUCLEICACIDSRES1747
49、7498。优化核苷酸序列可用于提高杀虫蛋白在植物中的表达,所述植物例如禾本科GRAMINEAEPOACEAE单子叶植物,例如玉米MAIZE或CORN植物。0062实施方式还提供分离的杀虫例如杀昆虫多肽,其由实施方式的天然存在的或修饰的核酸所编码。更为具体地,实施方式提供包括SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽,以及本文所述核酸编码的多肽,本文所述核酸例如SEQIDNO1所示的核酸,及其片段和其变体。0063在特定实施方式中,实施方式的杀虫蛋白提供全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段以及由突变核酸产生的变体多肽,所述突变核酸经设计将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中,被引入所述多肽的氨基酸序列包括提供诸如蛋白酶的酶的切割位点的序列。0064本领域已知BT毒素的杀虫活性通常通过各种蛋白酶在昆虫肠内对所述肽的切割被活化。因为肽在昆虫肠内不总是以全效切割,所以全长毒素的片段相对于全长毒素自身可以具有增强的杀虫活性。因而,实施方式的多肽中的一些包括全长杀昆虫多肽的片段,并且多肽片段、变异体和突变中的一些将相对于其衍生自的天然存在的杀昆虫多肽的活性,具有增强的杀虫活性,特别是如果天然存在的杀昆虫多肽在筛选活性前未用蛋白酶进行体外活化。因而,本申请包括所述序列的截短形式或片段。006
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