通过原生质体融合得到的乙醇抗性酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GP-01其生产方法通过利用酿酒酵母GP-01和作为锗来源的高水溶性偏锗酸钠生产包含高含量生物有机锗的酵母的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102239246 A (43)申请公布日 2011.11.09 CN 102239246 A *CN102239246A* (21)申请号 200880132218.5 (22)申请日 2008.12.31 10-2008-0122704 2008.12.04 KR C12N 1/16(2006.01) C12N 1/00(2006.01) (71)申请人 得瑞制药有限公司 地址 韩国首尔 (72)发明人 孙昌旭 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 刘丹妮 (54) 发明名称 通过原生质体融合得到的乙醇抗性酿酒酵母 (Sac

2、charomyces cerevisiae)GP-01， 其 生 产 方 法， 通过利用酿酒酵母 GP-01 和作为锗来源的高 水溶性偏锗酸钠生产包含高含量生物有机锗的酵 母的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种通过使用乙醇抗性酵母和 偏锗酸钠 (Na2GeO3)， 通过原生质体融合， 生产 包含高含量有机生物锗的酵母的方法。为了 增强对抑制酵母生长的乙醇的抗性， 本发明提 供了用于生产突变的酿酒酵母 (ye， d&tGP-01， KCTC 11399BP) 的 方 法， 该 酵 母 GP-01 具 有 乙 醇 抗 性 并 通 过 将 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cervis

3、iae)(KCTC7904) 和 乙 醇 假 丝 酵 母 (Candidaethanolica)(KCTC7181) 的原生质体融 合得到。 此外， 本发明提供了包含高含量有机生物 锗的酵母 ( 酵母 Ge-32K) 和用于生产酵母 Ge-32K 的方法， 该方法包括以下步骤 ： 将酵母 GP-01 以 1 0.5-2 的体积比加入到偏锗酸钠 (Na2GeO3) 中 ； 加入 0.1-0.4wt的表面活性剂， 代替现有技 术中使用的二氧化锗 ； 和培养所得到的肉汤。与 通过利用二氧化锗生产的常规酵母相比， 获得的 酵母 Ge-32K 包含较高含量的生物有机锗。 (30)优先权数据 (85)PC

4、T申请进入国家阶段日 2011.06.03 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2008/007834 2008.12.31 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/064759 EN 2010.06.10 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 2 页 CN 102239253 A1/1 页 2 1. 具有生产有机生物锗能力的酵母 GP-01( 突变的酿酒酵母， KCTC11399BP)。 2. 一种用于生产具有乙醇抗性的酵母 GP-01 的方法， 所述方法包括将酿酒酵母 (Saccharom

5、cervisiae)(KCTC 7904)和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)(KCTC 7181) 进行原生质体融合的步骤。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 所述方法还包括加入由球团状的酿酒酵母 (KCTC 7904)和乙醇假丝酵母(KCTC 7181)、 1M的山梨醇和0.5M的2-巯基乙醇的所得到的原生质 体的步骤。 4. 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述原生质体融合通过采用 1M 的山梨醇和聚乙 二醇 ( 分子量 4000) 融合原生质体进行。 5. 一种用于包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K 的方法， 所述方法包括在使用之前 将酵母 GP-0

6、1 加入到偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液中的步骤。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其中， 所述偏锗酸钠 (Na2GeO3) 通过以下方法制备 ： 将 选自碳酸钠 (Na2CO3)、 cardium carbonate(CaCO3) 和碳酸氢钾 (KHCO3) 其中之一溶解在水 中并将二氧化锗 (GeO2) 以相等的体积比加入到以上所制备的溶液中。 7. 根据权利要求 5 所述的方法， 其中， 酵母 GP-01(KCTC 11399BP) 与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的混合比例为 1 0.5-2.0( 按体积 )。 8. 根据权利要求 6 所述的方法， 所述方法还包括将包含酵

7、母 GP-01(KCTC 11399BP) 和 偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的肉汤在 pH 9-10 和 30-40温度下培养 19-21 小时。 9. 一种根据权利要求 5-8 中任一项所述生产的包含高含量有机生物锗的酵母 ( 酵母 Ge-32K)。 权 利 要 求 书 CN 102239246 A CN 102239253 A1/10 页 3 通过原生质体融合得到的乙醇抗性酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GP-01， 其生产方法， 通过利 用酿酒酵母 GP-01 和作为锗来源的高水溶性偏锗酸钠生产 包含高含量生物有机锗的酵母的方法 技术领域 0001 本发明

8、涉及具有乙醇抗性并包含高含量有机生物锗的酵母和用于生产该酵母的 方法。更具体地说， 该方法包括 ： 通过酿酒酵母 (Saccharomy ces cervisiae)(KCTC7904) 和乙醇假丝酵母 (Candida ethanolica)(KCTC7181) 的原生质体融合生产突变的酿酒酵母 (S.cervisiae)， 即酵母 GP-01， 所述的酵母 GP-01 对高浓度乙醇具有抗性 ； 将酵母 GP-01 与 偏锗酸钠 (Na2GeO3) 进行培养， 以便通过生物转化将锗接种到酵母 GP-01 中 ； 和最终获得具 有乙醇抗性并包含高含量有机生物锗的突变的酵母 ( 以下称酵母 Ge

9、-32K)。 背景技术 0002 锗分类为有机锗和无机锗(GeO2)。 已知在人类器官内累积较长时间的无机锗导致 强的毒性。 0003 有机锗天然地包含在微生物、 矿物质水和医用草药中。而且， 可以通过在真菌 体内生物合成或者化学合成生产有机锗。有机锗与细胞中的蛋白质、 肽等结合， 并且通 过许多论文和科学期刊 (Kor.J.Microbiol.Biotechnol.， 2007.35(2) ： 118-127 ； J.Kor. Soc.Food Sci.Nutr.2006.35(6) ： 683-689 ； J.Kor.Soc.Appl.Biol.Chem.2005.48(3) ： 246-

10、251 ； Immune Network.2006.6(2) ： 86-92) 建立了有机锗用于增强免疫力、 抑制肿瘤细 胞的产生和扩散 ( 转移 )、 治疗和预防各种慢性疾病等的疗效。此外， 众所周知有机锗具 有以下功能 ： 通过向细胞提供氧的抗癌活性 (J.Orthomol.Medicin.， 1986.1 ： 145-148) ； 纯化血液 (Medicin.Hy-phothesis.， 1988.26 ： 207-215) ； 通过活化 NK 细胞和巨噬细胞 增 强 免 疫 力 (Microbiol.Immunol.， 1985.29 ： 65-74 ； Kor.J.Microbiol

11、.Biotechnol.， 2007.35(2) ： 118-127) ； 诱 导 干 扰 素 生 成 (Gantokagakutyoho， 9 ： 1976-1980)、 抑 制 癌 细胞产生和扩散 (Cancer and Chemotheraphy.1985.12(12) ： 2345-2351) ； 抑制关节炎 (Autonomic&Autacoid Pharmacol.2005.25 ： 129-134) ； 预防和治疗各种疾病， 例如神经痛 (Biotechnol.Appl.Biochem.， 1986.8 ： 379-386)、 骨质疏松症(Germanium ； The heal

12、th and life enhancer.1988) ； 降低高的血压(高血压)和高脂血症胆固醇(Pharmacol.， 1990.41 ： 286-291) ； 缓解肝毒素 (J.Kor.Soc.Food.Nutr.， 1994.23(4) ： 581-586) 等。由于所述的 众所周知的疗效， 在美国、 日本、 欧洲和韩国， 在几十年中， 对有机锗已经广泛地进行了许多 研究， 所述的研究试图将其用于治疗各种顽固性疾病， 例如癌症和心脏病等 (Anticancer Res.， 1985.5(5) ： 479-483)。 0004 可以通过从药用草药， 例如人参 (ginseng)、 灵芝 (

13、ganoderma) 中提取得到有机 锗， 但由于其高成本和低生产率此种方法很难商业化。 此外， 可以通过利用有机酸化学合成 二氧化锗 (GeO2) 获得有机锗， 但从化学合成中得到的产品中包含无机锗， 因此由于未确认 的安全性， 在食物或药物供给中的用途受到限制 (US FDA 的进口警戒， 1988)。 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A2/10 页 4 0005 事实上， 酵母在烘焙业、 糖果业和酿酒业中大量地使用了数千年。而且， 酵母自身 作为人类食物的来源是有用的， 并且作为下一代蛋白质的来源作为单细胞蛋白 (SCP) 是有 吸引力的， ， 所述的

14、单细胞蛋白理想地由蛋白质、 维生素、 矿物质等组成， 其特征在于高蛋白 和低脂肪。 0006 此外， 在单细胞中， 酵母是维生素 B 的最好来源， 并包含许多酶类等， 这些酶主要 服务于体内的代谢。在这方面， 酵母用作保健产品。最近， 对保健产品进行了大量的研究和 开发， 从而通过得到的酵母实现生理和药用效果。 为了实现所述目的， 非常需要开发包含高 含量有机生物锗的酵母。 0007 在传统方法中， 通过在包含无机锗 (GeO2) 的培养基中培养酵母来生产包含有机生 物锗的酵母。由于酵母在包含高含量无机锗的培养基条件下生长受到限制这一缺点， 因此 在传统方法中难以有成本效益并且大规模地生产包含

15、适量有机生物锗的酵母。 0008 为了弥补上述缺点， 尝试了将生产球团 (pellet) 形式的酵母的过程和将二氧 化锗 (GeO2) 接种到所得到的酵母中的过程独立地进行的方法。然而， 在以上方法中， 由 于在酵母培养过程中产生的乙醇和接种到酵母中的二氧化锗 (GeO2) 的含量极低， 球团状 (palletized) 酵母的产率太低以致不能商业化。 0009 而且， 已知的是在上述方法中使用的二氧化锗 (GeO2) 在 25下的溶解度为 5.2g/L， 该溶解度对于酵母生长是抑制剂 (J.Ind.Microbiol.Biotechnol.， 1989.4(4) ： 299-306)。 00

16、10 因此， 非常地需要发明出通过使用具有较高溶解度但毒性远低于二氧化锗 (GeO2) 的无机锗， 来生产包含高含量有机锗的乙醇抗性酵母的方法。 0011 发明公开内容 0012 技术问题 0013 本发明的目的是提供具有乙醇抗性的酵母 GP-01(Saccharomyces cervisiae GP-01， KCTCl 1399BP) 以增加酵母产率， 和用于生产酵母 GP-01 的方法。 0014 本发明的另一个目的是提供用于生产酵母 Ge-32K 的方法， 所述的酵母含有高含 量有机生物锗， 通过突变的酿酒酵母 ( 乙醇抗性酵母 GP-01) 和偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的生物 合成

17、获得的。 0015 本发明的再一个目的是提供用于生产通过突变的酿酒酵母 ( 酵母 GP-01， KCTC-11399BP) 的生物合成和偏锗酸钠 (Na2GeO3) 获得的、 包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K 的方法。 0016 技术方案 0017 本发明涉及具有乙醇抗性并具有有机锗生产能力的突变的酿酒酵母 ( 酵母 GP-01， KCTC 11399BP) 和用于生产包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K 的方法， 所述方法 包括用偏锗酸钠 (Na2GeO3) 培养所述的酵母 GP-01。 0018 有益效果 0019 根据本发明， 通过酿酒酵母(KCTC-7904)和乙醇假丝酵母

18、(KCTC7181)的原生质体 融合可以生产多种的酵母GP-01。 所得到的酵母GP-01具有乙醇抗性， 这使得能够在高乙醇 条件下培养。本发明的乙醇抗性酵母 GP-01 可以克服现有技术中由于在酵母培养过程中产 生乙醇而导致酵母生长产率降低的缺点。 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A3/10 页 5 0020 此外， 由于培养的酵母GP-01的生产率与最初酵母(KCTC-7904)的生产率相比， 增 加了超过 3 倍， 因此可以通过利用本发明的酵母 GP-01 实现包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K 的大规模生产。 0021 在将锗接种到球团状酵母G

19、P-01的过程中， 本发明使用溶解度为500g/L的偏锗酸 钠 (Na2GeO3) 代替现有技术中通常使用的二氧化锗 (GeO2)， 由于锗的更高溶解度和离子可 传送性， 同时锗的毒性低于二氧化锗从而增加了酵母中锗的生物转化速率。 因此， 获得包含 的有机生物锗的含量比使用二氧化锗 (GeO2) 的现有技术的含量高 2 或 3 倍的酵母 Ge-32K 对于本发明来说是可能的。 0022 同时， 在用偏锗酸钠 (Na2GeO3) 培养酵母 GP-01(KCTC 11399BP) 的过程中， 为了使 有机生物锗更有效地通过生物转化接种到球团状酵母中， 本发明添加了表面活性剂。 0023 附图简述

20、0024 图 1 是显示根据 pH 的变化， 本发明的酵母 GP-01 中生物锗含量的图形。 0025 图 2 是显示根据温度的改变， 本发明的酵母 GP-01 中生物锗含量的图形。 0026 图 3 是显示根据表面活性剂按 wt计的浓度的变化， 本发明的酵母 GP-01 中生物 锗含量的图形。 0027 发明的方式 0028 本发明涉及突变的酿酒酵母， 即具有生产有机锗能力的酵母 GP-01(KCTC 11399BP)。 0029 所述的突变的酿酒酵母， 即酵母 GP-01 适当地保存在韩国生命科学与生物技术研 究院 (Korea Research Institute of Bioscien

21、ce and Biotechnology) 的韩国典型菌种 保藏中心 (Korea Collection for Type Culture)， 保藏编号为 KCTC 11399BP。 0030 更具体地说， 本发明提供了具有乙醇抗性的突变酿酒酵母 GP-01( 酵母 GP-01， KCTC 11399BP)， 其中所述方法包括将酿酒酵母 (KCTC7904) 与有效利用乙醇的乙醇假丝酵 母 (KCTC 7904) 的原生质体融合。 0031 此外， 本发明提供了包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K， 所述酵母可以通过将 酵母 GP-01 与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液培养， 从而通过

22、生物转化将锗接种到酵母中进行制 备。 0032 所述的突变酵母可以通过酿酒酵母 (KCTC7904) 和乙醇假丝酵母 (KCTC7181) 的 原生质体融合获得， 所述的原生质体融合使用混合了 1M 山梨醇作为渗透压稳定剂， 0.5M 的 2- 巯基乙醇作为还原剂的溶液。 0033 而且， 原生质体可以通过将球团状的酵母悬浮在添加细胞壁水解酶使细胞壁分解 的山梨醇溶液中获得。在这种情况下， 1M 山梨醇与 2- 巯基乙醇优选的体积比为 1 2-4， 更优选地为 1 2-3。 0034 同时， 所述的原生质体融合通过将酿酒酵母 (KCTC7904) 和乙醇假丝酵母 (KCTC7181) 的两种原

23、生质体加入到混合溶液中实现， 该混合溶液由分子量为 4000 的聚乙 二醇、 10mM 氯化钙 (CaCl2) 和选自 1M 山梨醇、 蔗糖和甘露醇的溶液之一组成。 0035 在这种情况下， 选择的一种溶液 (1M 山梨醇 )、 聚乙二醇和氯化钙 (CaCl2) 的优选 体积比为 1 2-4 2-5， 更优选地为 1 2-3 2-4。 0036 本发明提供了用于生产包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K 的方法。该方法包 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A4/10 页 6 括将酵母 GP-01 与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 培养。 0037 酵母 GP-

24、01(KCTC 11399BP) 与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的优选体积比为 1 0.5-2， 更 优选地为 1 1。 0038 此外， 为了通过生物转化将锗接种到酵母中， 优选地在 pH 9-10 和 30-40温度下 将酵母 GP-01 与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 培养。以上培养步骤可以通过培养酵母的普通方法实 现。 0039 通过本发明所述方法， 可以获得包含相对高含量的有机生物锗的酵母 Ge-32K。 0040 在下文中， 提供了用于生产乙醇抗性酵母 GP-01 和用于生产包含高含量有机生物 锗的酵母 Ge-32K 的本发明的更加详细的方法。 0041 第一个过程 ： 生产乙醇

25、抗性的原生质体融合酵母 0042 通过融合和培养酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假丝酵母(KCTC7181)的两种原生质 体获得原生质体融合的酵母， 其中酿酒酵母和乙醇假丝酵母保藏在韩国生命科学与生物技 术研究院的韩国典型菌种保藏中心 (KCTC)。 0043 更详细地说， 分别培养酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假丝酵母(KCTC7181)。 离心所 得到的培养基以获得球团状的酵母。 0044 优选的是， 在对数生长早期当培养基的光密度值(O.D.)为0.45-0.50时进行培养 基的离心。 可以从菌株的每个培养基或者两个菌株一起培养的一个培养基中获得球团状酵 母。 0045 以 1 1

26、 的比例将两种球团状酵母加入到混合了 1M 山梨醇和 0.5M 2- 巯基乙醇 的溶液中以清洗酵母两次。将经清洗的酵母静置预定的时间， 然后将包含细胞壁水解酶的 溶液以 1 1 的比例加入到肉汤 ( 包含球团状的酵母、 1M 山梨醇和 0.5M 2- 巯基乙醇 ) 中。 使酵母悬浮在肉汤中以生成原生质体。 0046 将 1M 山梨醇、 聚乙二醇 ( 分子量 4000) 和 10mM 的氯化钙 (CaCl2) 加入到肉汤中， 以便原生质体融合。最后， 离心肉汤以得到原生质体融合的酵母。 0047 将所述的原生质体融合的酵母在琼脂培养基中培养 6-8 天， 并对其染色以检查是 否要鉴定原生质体融合

27、的酵母。之后， 收集原生质体融合的酵母， 所述的酵母通过染色确 认。 0048 优选地， 使用的琼脂培养基由 3-5wt的酵母提取物、 7-9的蛋白胨、 7-9wt的 葡萄糖、 0.1-0.6wt的氯化钙、 72-75wt的山梨醇和 5-8wt的琼脂组成， 但不限于上述 组成。也可以应用本领域中通常使用的琼脂。 0049 第二个过程 ： 生产对高浓度锗具有高适应性的乙醇抗性酵母 ( 酵母 GP-01， (KCTC 11399BP)， 和配制偏锗酸钠溶液 (Na2GeO3)。 0050 在包含偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的培养基中培养在第一个过程中得到的原生质体融合 的酵母以增强酵母对高浓度锗

28、的适应性。 0051 为了生产酵母 GP-01(KCTC 11399BP)， 由于对锗的适应性， 使用偏锗酸钠 (Na2GeO3)。将从第一个过程中得到的原生质体融合的酵母在液体培养基中培养 10-13 小 时， 从而使锗的浓度达到 3,000-20,000ppm。 0052 优选地， 液体培养基由 6-10wt的乙醇、 0.1-0.5wt的蛋白胨、 0.1-0.4wt的酵 母提取物、 2-5wt的葡萄糖、 0.1-0.4wt的麦芽提取物和 84-90wt的水组成， 但不限于 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A5/10 页 7 上述组成。 0053 优选地，

29、 在液体培养基中乙醇的最佳浓度为 8-10wt， 偏锗酸钠 (Na2GeO3) 中锗的 含量为 3,000-10,000ppm。 0054 在乙醇的浓度低于 6wt或者超过 10wt的情况下， 其可以导致难以获得酵母的 最佳量或者难以有效地收集乙醇抗性酵母。而且， 在偏锗酸钠 (Na2GeO3) 中锗的含量小于 3,000ppm 的情况下， 难以有效地收集包含高含量锗的酵母并且在偏锗酸钠 (Na2GeO3) 中锗 的含量超过 20,000ppm 的情况下， 也很难得到有成本效益的产率。 0055 在液体培养基中， 收集了生长活跃并且在培养物的上清液中具有较低含量锗的 酵母。在平板培养基中继代培

30、养收集到的酵母以分离并获得突变的酿酒酵母， 即酵母 GP-01(KCTC 11399BP)。 0056 由于所获得的酵母 GP-01 对乙醇具有高度抗性， 因此酵母的产率增加是可能的。 0057 优选地， 以上使用的平板培养基由 3-5wt的琼脂、 10-12wt的酵母提取物、 20-23wt的蛋白胨、 20-23wt的葡萄糖和 39-42wt的乙醇组成， 但不限于以上组成其中 在平板凝固之前加入乙醇。 0058 在酵母的继代培养之后， 在室温下对制备的平板进行双重密封以防止乙醇挥发。 0059 通过向碳酸钠 (Na2CO3)、 碳酸钙 (CaCO3)、 碳酸钾 (K2CO3) 或者碳酸氢钾

31、(KHCO3) 之一中加入相等比例的二氧化锗并进行灭菌来合成本发明中用作无机锗的偏锗酸钠 (Na2GeO3)。所得到的偏锗酸钠 (Na2GeO3) 为高溶解度的锗溶液并且应在生物转化过程中的 使用之前立即配制。 0060 在本发明的第二个过程中， 为了使酵母发生突变， 可以在将酵母在包含偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的培养基中培养之前， 额外地将该原生质体融合的酵母在 2.0-2.5KGy(D10值 ) 的 射线 (Co60) 下辐射， 持续 2-4 小时。 0061 如果 射线 (Co60) 辐射小于 2.0KGy， 则由于在平板上形成了突变菌株的太多菌 落， 因此很难获得需要的突变酵母。并

32、且， 如果 射线 (Co60) 辐射大于 2.5KGy， 则由于酵 母的消失率极高， 也很难获得需要的突变酵母。 0062 通过如上所述的 射线 (Co60) 辐射的突变酵母， 在 YM 肉汤中培养 1 小时并稳定 之后， 可以用于继代培养。 0063 第三个过程 ： 无机锗离子流入酵母 GP-01 中 0064 为了生产包含高含量有机生物锗的酵母， 将第二个过程中所获得的酵母 GP-01 与 偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液进行培养。 0065 为了生产包含高含量的有机生物锗的酵母 ( 酵母 Ge-32K)， 将第二个过程中 制备的培养基离心， 从而仅收集酵母。并且， 通过将收集到的酵母加

33、入到锗的含量为 3,000-10,000ppm 的包含偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的溶液中制备包含锗的培养基。 0066 加入的酵母与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的体积比为 1 0.5-2.0。 0067 在加入 0.01-0.04的表面活性剂之后， 将所获得的包含锗的培养基在 pH 9-10 和 30-40下培养 19-21 小时。从而生产本发明的包含高含量的有机生物锗的酵母 ( 酵母 Ge-32K)。 0068 加入的表面活性剂可以通过增加的细胞膜通透性， 引起细胞中锗的含量增加。因 此， 对于将无机锗接种到突变酵母， 即酵母 GP-01(KCTC11399BP) 中是可能的。 说

34、 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A6/10 页 8 0069 优选地， 本发明中使用的表面活性剂为 Twin-80， 但不限于此。 0070 如果酵母与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的混合比例小于 1 0.5 或者大于 1 2， 由 于包含酵母的悬浮液的高粘度和锗与酵母细胞壁之间的较低的扩散速度， 可以引起酵母中 生物锗的含量降低。 0071 而且， 如果 pH 小于 9 或者大于 10， 或者温度低于 30或高于 40， 可以引起酵母 中生物锗的含量降低。 0072 此外， 如果加入到包含锗的培养基中的表面活性剂的量低于 0.1wt， 则细胞壁的 通透性

35、差。而且， 如果加入到培养基中的表面活性剂的量超过 0.4wt， 则由于酵母细胞壁 的结构遭到破坏， 因此膜的通透性受到抑制。 因此， 所述的情况可以导致酵母与未加入表面 活性剂的情况具有相同的有机锗含量。 0073 在通过利用突变的酿酒酵母， 即酵母 GP-01 生产包含高含量的有机生物锗的酵 母， 即酵母Ge-32K之后， 剩余的包含锗的培养基可以通过采用0.2m的膜过滤器进行过滤 而再利用。 0074 为了帮助你理解本发明， 以下将更加详细地描述本发明的示例性实施方案。 然而， 以下的实施例用于解释说明的目的， 并且本领域的技术人员能够理解， 在不脱离本发明的 范围和精神的情况下有可能进

36、行各种修改、 添加和 / 或替换， 本发明的范围和精神由所附 权利要求书和它们的等同替代形式限定。 0075 制备实施例 1 ： 偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的配制 0076 通过将碳酸钠 (Na2CO3， Kanto， Japan) 溶解在水中， 以与所述碳酸钠的相同比例 (1 1) 加入二氧化锗 (GeO2， PPM GmbH， Germany) 来配制偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液， 并对所 得到的溶液进行灭菌。 0077 按照前文配制的偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的溶解度非常高， 为 500g/L(25 )。 0078 实施方案 1 ： 原生质体融合的酵母的生产， 以及

37、通过使用所述原生质体融合的酵 母的乙醇抗性酵母的生产。 0079 在 30下， 将韩国典型菌种保藏中心提供的酿酒酵母 (KCTC7904) 和乙醇假丝酵 母 (KCTC7181) 在含有 YPD 培养基的锥形烧瓶 (Erlenmeyer flask) 中培养 10 小时。在酵 母的 UV 分光光度计为 0.5 的对数早期， 离心制备的培养基以收集酵母。用灭菌生理盐水清 洗收集的酵母两次。 0080 在 30下， 将经过清洗的酵母悬浮在 1M 山梨醇和 0.5M 巯基乙醇以 1 2 的体积 比混合的溶液中 30 分钟。之后， 通过离心， 清洗包含酵母的溶液。 0081 然后， 将 200 个单位

38、的细胞壁降解酶， 酵母裂解酶 (L4025， sigma， USA) 以 1 1 的 比例加入到离心清洗的溶液 ( 包含酵母、 1M 山梨醇和巯基乙醇 ) 中。在 30下， 将所得到 的溶液放置 1 小时以产生酵母的原生质体。 0082 将由 1M 山梨醇、 聚乙二醇 (MW 4000) 和 10mL 的氯化钙 (CaCl2) 以 1 3 2 的 体积比组成的溶液以相等的比例加入到上述包含原生质体融合的酵母中。在 30下， 将该 混合的溶液融合 30 分钟以生产本发明的原生质体融合的酵母。 0083 为了分离原生质体融合的酵母， 在 SOS 固体培养基中培养原生质体融合的酵母 1 周， 所述的

39、 SOS 固体培养基包含 4.1wt的酵母提取物、 8.1wt的蛋白胨、 8.1wt的葡萄 糖、 0.4wt的氯化钠、 73.2wt的山梨醇和 6.1wt的琼脂。在培养 1 周之后， 通过采用苯 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A7/10 页 9 酚品红 (carbol fuchin) 对其染色分离酵母。 0084 在添加 30wt的含有 10,000ppm 锗的偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液之后， 在 YM 液体培 养基中培养分离的酵母 10 小时， 所述的 YM 培养基包含 10wt的乙醇、 0.4wt的蛋白胨、 0.2wt的酵母提取物、 4wt的葡

40、萄糖、 0.2wt的麦芽提取物和 85.2wt的水。 0085 在液体培养基中， 从培养物的上清液中收集生长活跃并且锗的含量较低的酵母。 在包含 4.1wt的琼脂 (Difco)、 11.1wt酵母提取物 (Genico， Korea)、 22.0wt的蛋白胨 (Difco)、 22.0wt的葡萄糖 (Daesang， Korea) 和 40.8wt的乙醇的平板培养基中继代培 养收集的酵母从而分离并获得突变的酿酒酵母， 即酵母 GP-01(KCTC 11399BP)。 0086 为了研究所得到的酵母 GP-01 的乙醇抗性， 按照各浓度加入生长抑制剂乙醇， 并 检查了酵母的生长状态。 0087

41、 下文的表 1 通过乙醇浓度显示了酵母的生长状态， 为了准确性， 对浓度的每个值 检查三次。 0088 表 1 0089 0090 当培养微生物时产生乙醇， 但乙醇抑制它们的生长。 0091 如以上表 1 所示， 与缺乏乙醇的情况相比， 在乙醇存在的情况下酿酒酵母， 酵母 GP-01(KCTC 1139BP) 的生长速率增加。在乙醇浓度为 6-10的情况下， 获得酵母 GP-01 的 最好生长率。 0092 根据本发明， 在这种情况下， 可以获得在乙醇存在下其生长率增加的乙醇抗性酵 母， 即酵母 GP-01(KCTC 11399BP)。 0093 此外， 通过将本发明的酵母GP-01的产率与最

42、初的酵母(酿酒酵母， KCTC 7904)的 产率进行比较， 本发明的酵母 GP-01(KCTC-11399BP) 的产率增加了超过 3 倍。 0094 实施方案 2 ： 通过偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液的浓度改变酵母 GP-01 中锗的含量 0095 将包含突变的酿酒酵母， 酵母 GP-01(KCTC 11399BP) 的肉汤培养基进行离心以收 集球团状酵母。将收集到的球团状酵母以 1 1 的体积比加入到偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液 中。 由于制备了就包含的锗浓度而言的多种偏锗酸钠(Na2GeO3)溶液， 配制了在其中加入球 说 明 书 CN 102239246 A CN 102

43、239253 A8/10 页 10 团状酵母的多种溶液。将配制的溶液在 pH 10 和 40下培养 20 小时。 0096 为了确定酵母 GP-01 中生物锗的含量， 将 1g 经过培养和干燥的酵母 GP-01 加入到 30ml 的硝酸中。加热所得到的样品以使其分解。在将 pH 值调节至 6 之后， 将 1ml 样品与 1ml 苯基荧光酮和 1ml 环状核酸混合。所得到的样品在 30下静置 30 小时， 然后利用 UV 分光光度计在 525nm 处测定酵母 GP-01 中锗的含量。 0097 同时， 作为对照， 进行了与实施方案 2 中描述的相同的过程， 除了采用二氧化锗 (GeO2) 溶液代

44、替偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液之外。 0098 下表 2 显示了根据偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液与二氧化锗 (GeO2) 溶液中锗的含量， 接种到酵母 GP-01 和最初的酿酒酵母 (KCTC 7904) 的生物锗的含量的比较。 0099 表 2 0100 0101 通过按照各溶液比较接种的生物锗的含量， 表 2 显示了在溶液中锗的含量相同的 情况下， 在二氧化锗 (GeO2) 溶液中相比， 在偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液中接种到酵母中的生物 锗的量较多。 0102 而且， 通过按照各酵母比较接种的生物锗的量， 表 2 显示了与最初的酿酒酵母 (KCTC 7904) 相比，

45、有更多量的生物锗接种到本发明的突变的酿酒酵母 ( 酵母 GP-01， KCTC 11399BP) 中。 0103 如果偏锗酸钠 (Na2GeO3) 中锗的含量为 3,000-10,000ppm， 则有最大量的无机锗离 子被接种到酵母中。此外， 溶液中锗的含量为 5,000ppm 时， 则被接种的锗的产率达到最高。 0104 实施方案 3 ： 根据球团状的酵母与无机锗 (GeO2和 Na2GeO3) 溶液的混合比例， 比较 了酵母 GP-01 中生物锗的含量。 0105 将包含实施方案 1 中制备的乙醇抗性酵母 GP-01 的肉汤进行离心以收集酵母。将 收集的酵母加入到包含偏锗酸钠 (Na2Ge

46、O3) 和二氧化锗的溶液中， 所述的溶液具有偏锗酸 钠 (Na2GeO3) 和二氧化锗的溶液的不同混合比例。将所得到的溶液在 pH 10 和 40下培养 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A9/10 页 11 20 小时。 0106 同时， 作为对照， 进行了与实施方案 3 中描述的相同的过程， 除了采用 ( 无机 ) 二 氧化锗 (GeO2) 溶液代替偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液之外。 0107 通过与实施方案 2 相同的方法测定酵母 GP-01(KCTC 11399BP) 中锗的含量。 0108 表 3 显示了随着酵母与二氧化锗 (GeO2) 以及酵

47、母与偏锗酸钠 (Na2GeO3) 的混合比 例变化， 酵母 GP-01 中生物锗含量的比较 0109 表 3 0110 0111 表3显示了将最大量的生物锗接种到其中酵母和无机锗的混合比例为10.5-2。 此外， 当加入偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液时比加入无机锗 (GeO2) 时生物锗的量增加超过 2-4 倍。 0112 实施方案 4 ： 将无机锗离子接种到酵母中的最佳条件 0113 对包含如实施方案 1 中制备的乙醇抗性酵母 GP-01 的肉汤进行离心以收集酵母。 以 1 0.5 的比例将收集到的酵母加入到具有 5,000ppm 锗的偏锗酸钠 (Na2GeO3) 溶液中。 在加入表面活

48、性剂 (Twin-80) 之后， 将所得到的溶液在 pH、 温度或者包含锗的肉汤的多种 条件下培养 20 小时。 0114 通过利用 1N NaOH 调节 pH， 并在不同的温度和表面活性剂浓度下重复进行大量的 测试。 0115 当测定锗的含量时， 将未添加表面活性剂的肉汤用作对照。 0116 通过与实施方案 2 相同的方法测定本发明的酵母 GP-01(KCTC11399BP) 中生物锗 的含量。 0117 表4显示了通过pH、 温度和表面活性剂(Twin-80)浓度的变化， 接种到酵母中的锗 离子的含量。 0118 表 4 0119 说 明 书 CN 102239246 A CN 10223

49、9253 A10/10 页 12 0120 表4显示了用于将无机锗接种到酵母中的最佳条件由pH 8-10、 温度30-40和在 包含锗的肉汤中 0.1-0.4wt的表面活性剂组成， 更优选地， 由 pH10、 温度 40和 0.2wt 的表面活性剂组成。 0121 在所附的图2、 3和4中显示根据pH、 温度和无机锗的浓度， 接种的生物锗的含量的 变化。 说 明 书 CN 102239246 A CN 102239253 A1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102239246 A CN 102239253 A2/2 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102239246 A