一种基因工程菌生产-胡萝卜素的方法及其基因工程菌.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611082146.0 (22)申请日 2016.11.30 (71)申请人 上海医药工业研究院 地址 200040 上海市静安区北京西路1320 号 申请人 中国医药工业研究总院 (72)发明人 陈少欣尹升明吴运杰杨松柏 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 薛琦沈利 (51)Int.Cl. C12N 1/19(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12P 23/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01)

2、(54)发明名称 一种基因工程菌生产-胡萝 卜素的方法及 其基因工程菌 (57)摘要 本发明公开了一种基因工程菌生产-胡萝 卜素的方法及其基因工程菌。 该基因工程菌是一 种含有carRA基因和carB基因的耶罗维解脂酵母 (Yarrowialipotica)基因工程菌。 本发明通过 基因工程方法向耶罗维解脂酵母引入来源于三 孢布拉霉(Blakesleatrispora)carRA基因和 carB基因， 进一步增强双香儿基焦磷酸合酶 (GGS)和3-羟基3-甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG- CoAcatareductase)的表达， 敲除3-磷酸甘油脱 氢酶(Gut2)与过氧化物酶(Pox2)，

3、获得了异源表 达-胡萝 卜素的耶罗维解脂酵母菌株， 发酵条件 简单， -胡萝 卜素产量较高， 具有重要的生产价 值。 权利要求书1页 说明书11页 序列表39页 附图4页 CN 108118007 A 2018.06.05 CN 108118007 A 1.一种含有carRA基因和carB基因的耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)基因工程 菌。 2.如权利要求1所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的carRA基因的 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示； 所述的carB基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。 3.如权利要求1所述的耶罗维

4、解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的耶罗维解脂酵 母基因工程菌还进一步含有GGS基因。 4.如权利要求3所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的GGS基因的核 苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示； 或者， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法包括以下步骤： 将包括采用含有carRA 基因、 carB基因和GGS基因的重组载体导入耶罗维解脂酵母即可； 优选的， 所述的含有carRA 基因、 carB基因和GGS基因的重组载体， 由包括以下步骤的方法构建而得： 克隆来源于三孢 布拉霉的carRA基因、 carB基因， 在其上游和下游连接来源于耶罗维解脂酵母的启动子和

5、终 止子， 使其成为完整的表达元件， 并与GGS基因的表达元件整合到一个质粒上， 即获得的重 组载体； 优选的， 所述的重组载体是质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)； 或者， 所述的carB基因， carRA基因和GGS基因在所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌中的拷贝 数大于1个， 较佳的为2-100个， 甚至1000个。 5.如权利要求1或3所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的耶罗维解 脂酵母基因工程菌还进一步含有HMG-CoA还原酶的活性部位基因， 优选HMG-CoA还原酶的催 化部位。 6.如权利要求5所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的耶罗维解脂酵

6、 母基因工程菌的制备方法包括以下步骤： 用含有HMG-CoA还原酶活性部位基因的重组表达 载体导入耶罗维解脂酵母即可； 优选的， 所述的重组表达载体是质粒pSK-Hmg(y)-Ura3- IntB， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。 7.如权利要求1或5所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的耶罗维解 脂酵母基因工程菌还进一步敲除了Gut2基因； 和/或， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还 进一步敲除了Pox2基因。 8.如权利要求7所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的敲除方法包括 以下步骤： 采用质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)

7、敲除， 该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。 9.如权利要求7所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 其特征在于， 所述的敲除方法包括 以下步骤： 采用质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)敲除， 该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。 10.一种基因工程菌生产 -胡萝 卜素的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)制备如权利要求1所述的含有carRA基因与carB基因的耶罗维解脂酵母基因工程菌； 2)发酵培养步骤1)所得的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 从发酵液中获得 -胡萝 卜素。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108118007 A 2 一种基因

8、工程菌生产 -胡萝 卜素的方法及其基因工程菌 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种基因工程菌生产 -胡萝 卜素的方法及其 基因工程菌。 背景技术 0002 -胡萝 卜素是一种橘黄色的脂溶性的类胡萝 卜素， 是联合国粮农组织和世界卫生组 织食品添加剂联合专家委员会认定的A类的营养食品添加剂。 在人体中， -胡萝 卜素是维生 素A的前体； 可以作为抗氧化剂清除体内的自由基， 降低老年人心力衰竭的风险； 激发免疫 系统， 有防癌和抗癌的功能。 此外 -胡萝 卜素还可以用于食品色素、 动物饲料添加剂、 保健 品、 化妆品及药品中。 目前 -胡萝 卜素的市场需求不断增加， 它的应用

9、领域也从食品着色转 向营养食品、 保健品和药品三大领域。 0003 -胡萝 卜素制备生产有三种方法： 化学合成法； 天然提取法； 微生物发酵法。 采用化 学合成法人工合成的 -胡萝 卜素几乎完全是反式异构体形式， 不具备许多天然 -胡萝 卜素的 生理功能， 不能完全被人体吸收， 长期服用会对人体产生一定程度的毒副作用， 随着人们对 绿色天然食品的重视化学合成的 -胡萝 卜素不被大多数食品科学家所接受。 从植物中提取 天然 -胡萝 卜素受原料含量、 气候、 产地等条件限制， 且工艺复杂， 难以大量生产， 应用也收 到限制。 0004 微生物发酵法因不受环境等条件的影响， 并且容易培养， 产量高而

10、广泛受到国内 外的重视， 是生产 -胡萝 卜素的最好方法。 发酵常用的菌株主要分为三类： 藻类、 酵母和真 菌。 藻类和酵母的产量相对较低无法达到工业化生产的要求。 0005 三孢布拉霉(Blakeslea trispora)是目前生产 -胡萝 卜素的首选菌株， 但是以三 孢布拉霉发酵生产 -胡萝 卜素的培养基成分复杂、 成本相对较高。 三孢布拉霉是异宗结合 菌， 进行有性生殖的方式是异宗接合， 即由来源和性质不同的 “+”“-” 菌株才能相互融合， 进 行有性生殖。 接合孢子产生时通常进行减数分裂， 于是产生含有单倍体孢子的孢子囊。 诱导 配囊柄的激素成为三孢酸， 三孢酸的主要功能是诱导有性

11、生殖， 促进 -胡萝 卜素的生物合 成。 在工业生产中， 常常要考虑 “+”“-” 菌株的配比， 发酵条件相对复杂， 这也给工业生产带 来许多不必要的困难。 发明内容 0006 本发明针对现有技术中存在的三孢布拉霉发酵生产 -胡萝 卜素产量较低的不足， 提供一种一种基因工程菌生产 -胡萝 卜素的方法及其基因工程菌， 该基因工程菌生产 -胡 萝 卜素产量较高， 发酵条件简单。 0007 本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 0008 本发明的技术方案之一为： 一种含有茄红素合酶与番茄红素环化酶(carRA)基因/ 茄红素脱氢酶(carB)基因的耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica

12、)基因工程菌。 0009 其中， 所述的茄红素合酶/番茄红素环化酶(carRA)基因是常规的， 较佳的是来源 说明书 1/11 页 3 CN 108118007 A 3 于三孢布拉霉 -胡萝 卜素合成途径的carRA(茄红素合酶与番茄红素环化酶)基因， 更佳的， 是根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优化后的， 最佳的其核苷酸见序列表中 SEQ ID NO.3所示。 0010 其中， 所述的茄红素脱氢酶(carB)基因是常规的， 较佳的是来源于三孢布拉霉 - 胡萝 卜素合成途径的carB(茄红素脱氢酶)基因； 更佳的， 是根据耶罗维解脂酵母的密码子偏 好性做相应的优化后的， 最佳的其核苷酸

13、序列见序列表中SEQ ID NO.4所示。 0011 其中， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法是常规的， 较佳的用基因工 程手段构建而得， 更佳的包括以下步骤： 将含有carRA基因和carB基因重组载体导入耶罗维 解脂酵母即可。 0012 较佳的， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步含有双香儿基焦磷酸合酶 (GGS)基因。 0013 其中， 所述的双香儿基焦磷酸合酶(GGS)基因是常规的， 较佳的来源于耶罗维解脂 酵母ATCC20362， 更佳的其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。 0014 其中， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法是常规的， 较佳的用基因工

14、程手段构建而得， 更佳的包括以下步骤： 将含有carRA基因、 carB基因和GGS基因的重组载体 导入耶罗维解脂酵母即可。 0015 其中， 所述的含有carRA基因、 carB基因和GGS基因的重组载体， 较佳的， 由包括以 下步骤的方法构建而得： 克隆来源于三孢布拉霉的carRA基因、 carB基因， 在其上游和下游 连接来源于耶罗维解脂酵母的启动子和终止子， 使其成为完整的表达元件， 并与GGS基因的 表达元件整合到一个质粒上， 即获得的重组载体。 该重组载体可一次性将基因整合到耶罗 维解脂酵母基因组上。 较佳的， 所述的重组载体是质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)。 0016

15、进一步更佳的， 所述的carB基因， carRA基因和GGS基因在所述的耶罗维解脂酵母 基因工程菌中的拷贝数大于1个， 较佳的为2-100个， 甚至1000个。 0017 其中， 获得高拷贝数的carB基因， carRA基因和GGS基因的耶罗维解脂酵母基因工 程菌的方法是常规的， 较佳的可以导入多拷贝数外源基因的重组表达载体， 或者用具有多 整体位点的重组表达载体导入外源基因。 0018 进一步更佳的， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步含有HMG-CoA还原酶 的活性部位基因(HMGcata)。 0019 其中， 所述的HMG-CoAcata还原酶是常规的， 较佳的来自耶罗维解脂酵母的H

16、MG-CoA 还原酶， 更佳的是HMG-CoA还原酶的催化部位。 0020 其中， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法同常规， 较佳的， 用基因工程 手段构建而得， 更佳的， 包括以下步骤： 用含有HMG-CoA还原酶活性部位基因(HMGcata)的重 组表达载体导入耶罗维解脂酵母即可。 其中， 所述的重组表达载体较佳的是质粒pSK-Hmg (y)-Ura3-IntB， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。 0021 进一步更佳的， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步敲除了3-磷酸甘油脱 氢酶(Gut2)基因。 所述的敲除方法是常规的， 较佳的， 包括以下步骤： 采用质

17、粒pS-B-RA- GGS-Gut2-U(L)敲除， 该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。 0022 进一步更佳的， 所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步敲除了过氧化物酶 (Pox2)基因。 所述的敲除方法是常规的， 较佳的包括以下步骤： 采用质粒pS-B-RA-GGS- 说明书 2/11 页 4 CN 108118007 A 4 Pox2-U(L)敲除， 该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。 0023 本发明中， 所述的耶罗维解脂酵母是常规的。 0024 本发明的技术方案之二， 一种基因工程菌生产 -胡萝 卜素的方法， 包括以下步骤： 0025 1)

18、制备含有carRA(茄红素合酶与番茄红素环化酶)基因与carB(茄红素脱氢酶)基 因的耶罗维解脂酵母基因工程菌； 0026 2)发酵培养步骤1)所得的耶罗维解脂酵母基因工程菌， 从发酵液中获得 -胡萝 卜 素。 0027 本发明步骤1)所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌如上所述。 0028 本发明步骤2)所述的发酵培养骤1)所得的耶罗维解脂酵母基因工程菌的方法的 常规的耶罗维解脂酵母发酵方法， 在常规的耶罗维解脂酵母发酵液中发酵即可， 发酵条件 和参数是常规的。 较佳的包括在YPD液体培养基中28震荡培养所述耶罗维解脂酵母基因 工程菌即可。 步骤2)所述的从发酵液中获得 -胡萝 卜素的方法也是常规

19、的。 0029 在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发明各较佳实 例。 0030 本发明所用试剂和原料均市售可得。 0031 本发明的积极进步效果在于： 本发明通过基因工程方法向耶罗维解脂酵母 (Yarrowia lipotica)引入来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora) -胡萝 卜素基因茄红 素合酶与番茄红素环化酶(carRA)和茄红素脱氢酶(carB)基因， 进一步增强双香儿基焦磷 酸合酶(GGS)和3-羟基3-甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG-CoAcata reductase)的表达， 更进一步 敲除3-磷酸甘油脱氢酶(Gut2)与过氧化物

20、酶(Pox2)， 获得了异源表达 -胡萝 卜素耶罗维解 脂酵母菌株。 本发明选择耶罗维解脂酵母为表达宿主， 异源表达来自三孢布拉霉的 -胡萝 卜 素合成途径， 发酵条件简单， -胡萝 卜素产量较高， 具有重要的生产价值。 附图说明 0032 下面用附图进一步说明本发明。 0033 图1显示 -胡萝 卜素合成途径。 其中方框内为酵母体内的合成途径， 方框外为外源 表达的合成途径。 0034 图2为pSK-HMGcata-URA3.5N-3N质粒图谱。 0035 图3为pS-B-RA-GGS-F-U(L)质粒图谱。 0036 图4为pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB质粒图谱。 0037 图5

21、为pS-B-RA-GGS-Gut2-Ura3(L)质粒图谱。 0038 图6为pS-B-RA-GGS-Pox2-Ura3(L)质粒图谱。 0039 图7为pS-B-RA-GGS-rDNA-Ura3(L)质粒图谱。 具体实施方式 0040 本发明人通过克隆来源于三孢布拉霉 -胡萝 卜素合成途径的carRA(茄红素合酶与 番茄红素环化酶)与carB(茄红素脱氢酶)基因， 在其上游和下游连接来源于耶罗维解脂酵 母的启动子和终止子， 使其成为完整的表达元件， 并与GGS基因的表达元件整合到一个质粒 上， 一次性将基因整合到耶罗维解脂酵母基因组上， 得到异源产 -胡萝 卜素的菌株。 而后克 说明书 3/

22、11 页 5 CN 108118007 A 5 隆表达HMG-CoAcata， 增强甲羟戊酸代谢， 使 -胡萝 卜素的产量得到大幅提升。 敲除3-磷酸甘 油脱氢酶(Gut2)与过氧化物酶(Pox2)基因分别降低3-磷酸甘油的产生和过氧化物的 氧 化， 获得 -胡萝 卜素的高产耶罗维解脂酵母菌株。 0041 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规方法和条件， 或按照商 品说明书选择。 0042 1、 材料和方法 0043 应用在实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的， 相关描述可参

23、见： (1)由Cold Spring Harbor Laboratory； Cold Spring Harbor， NY(1989)出版Sambroo, J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.所著的Molecular Cloning:A Laboratory Manual； (2)由 Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor ,NY(1984)出版 T.J.Silhavy.M.L.Bennan和L.W.Enquist所著的Experiments with Gene Fusions； (3)由 Greene Publishin

24、g Assoc.和Wiley Interscience(1987)出版Ausubel,F.M等人所著的 Current Protocols in Molecular Biology。 0044 适用于微生物培养的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。 适用于下述实施 例的技术可参见American Society for Microbiology:Washington,D.C.(1994)出版的 Manual of Methods for General Bacterioloy或Thomas D .Brock在Sinauer Associates:Sunderland ,MA(1989)出版的

25、第二版Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology中所述的相关内容。 耶罗维解脂酵母的操作参见Barth G, Gaillardin C.1996.Yarrowia lipotica,p 313388.In Wolf KE(ed),Nonconventional yeasts in biotechnology。 0045 2、 耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)的培养 0046 耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)该菌株一般在28下培养， 采用的培养基 主要有以下几种， 固体培养基添加20g/L的琼脂。

26、 0047 YPD培养基： 10g/L酵母浸出物(OXOID)， 20g/L蛋白胨(OXOID)， 20g/L葡萄糖(国 药)。 0048 MM培养基： 20g/L葡萄糖， 6.7g/L YNB培养基(无氨基酸)。 0049 YNB培养基购自BIOSHARP。 0050 MM+5-FOA培养基： 20g/L葡萄糖， 6.7g/L YNB培养基(无氨基酸)， 1g/L 5-FOA(5-氟 乳清酸)， 0.075g/L尿嘧啶， 0.075g/L尿苷。 0051 酵母单菌落接种于YPD斜面上， 28培养72h； 接种斜面上的酵母菌落于20ml YPD 液体培养基(pH 5.5)中， 28， 200r

27、pm培养72h； 取1ml培养液， 12000rpm离心1min； 弃上清加 入1ml丙酮， 超声波破碎30min后12000rpm离心； 取上清用于液相检测。 0052 3、 -胡萝 卜素的HPLC检测 0053 检测方法参见Shao Z,Zhao H,Zhao H(2009)DNA assembler,an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.Nucleic Acid Res 37:e16。 采用注射器5 l进样量， 检测柱为Agilent Diamonsil SB-C18column，

28、 在472nm 处采集。 乙腈和四氢呋喃洗脱， 具体洗脱程序见表1。 0054 表1.HPLC洗脱程序 说明书 4/11 页 6 CN 108118007 A 6 0055 0056 A： 乙腈； 0057 B： 四氢呋喃。 0058 实施例1耶罗维解脂酵母基因的导入 0059 该实施例主要描述耶罗维解脂酵母的基因转化方法。 0060 感受态细胞制备过程 0061 1.接种耶罗维解脂酵母单菌落至5ml YPD液体培养基(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调 节pH至4.0)中， 28， 220rpm振荡培养10-12h； 0062 2.将50-100 L上述培养液转移至10ml YPD液体培养基(pH4.

29、0)中， 28， 220rpm过 夜培养直至细胞OD600约为5.5左右； 0063 3.培养液28， 3500rpm离心5min； 0064 4.弃上清， 用10ml 1TE缓冲液冲洗细胞2次； 0065 5.用20ml左右0.1M LiAc(pH6.0)稀释悬浮， 使细胞浓度达到5107/ml； 0066 6.悬浮液在28， 100rpm轻柔孵育1h； 0067 7.培养液28， 3500rpm离心5min后弃上清， 用2ml 100mM LiAc(pH6.0)重新悬浮， 使细胞浓度达到5108/ml； 0068 注： 感受态细胞可以在4下保存一周， 使用前需离心弃上清后重悬； 长时间保存

30、 需加25甘油在-80下保存， 取用时需在冰上融化， 使用前用0.1M LiAc冲洗重悬。 0069 转化过程 0070 1.取5 L carrier DNA(carrier DNA为鲑鱼精DNA， 10mg/ml溶于50mM Tris， 5mM EDTA溶液中， 长度约为500bp)100孵育5min放置在冰上， 1 g线性化载体置于2mL EP管底 部， 60孵育5min后放在冰上， 然后将二者混匀； 0071 2.将100 L感受态细胞与上述DNA混匀， 28， 100rpm孵育15min， 然后加700 L 40PEG4000(用0.1M LiAc溶解， 过滤除菌)混匀， 28， 10

31、0rpm孵育1h； 0072 3.细胞39热激10min， 然后加入1.2mL 100mM LiAc， 200ml悬浮液涂布在筛选平 板上平板上， 28培养34后待菌落长出(充足的O2)。 0073 实施例2URA3缺失株的获得 0074 HMG-CoA还原酶是甲羟戊酸途径中重要的限速酶， 催化HMG-CoA到甲羟戊酸的转 化。 为了增加 -胡萝 卜素的产量， 我们通过克隆表达HMG-CoA还原酶的催化部位使碳代谢流 向类异戊二烯途径。 克隆来自耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶基因， 共3000bp， 截取其催 化部位1500-3000bp， 并在起始部位添加ATG起始密码子。 为了使该序

32、列正常表达， 在其上游 说明书 5/11 页 7 CN 108118007 A 7 和下游分别添加Exp1启动子和Aco终止子， 得到完整的克隆表达元件Exp1-HMG-CoAcata- Aco， 然后整合URA3基因的上下游同源片段， 得到质粒pSK-HMGcata-URA3.5N-3N， 该质粒的序 列见SEQ ID NO1(参见表2， 图2)。 将PmeI/SphI线性化的该质粒转化进入耶罗维解脂酵母 ATCC20362(购自ATCC)， 获得菌株株Y2224。 ， 故而经采用URA3同源臂获得了Y2224， 同时导入 了催化部位。 0075 表2.质粒pSK-HMGcata-URA3.

33、5N-3N的描述 0076 0077 实施例3三孢布拉霉 -胡萝 卜素基因的表达 0078 该实施例主要描述三孢布拉霉 -胡萝 卜素在耶罗维解脂酵母菌株的构建和表达 (见图1)。 0079 构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)主要包括来源于三孢布拉霉的carB(茄红素 脱氢酶)， carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。 0080 GGS基因克隆于耶罗维解脂酵母ATCC20362， GGS基因具体序列见SEQ ID NO.2。 0081 CarRA基因克隆自三孢布拉霉， 根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优 化， 优化后的CarRA基因

34、序列见SEQ ID NO.3。 0082 CarB基因克隆自三孢布拉霉， 根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优 化， 优化后的CarB基因序列见SEQ ID NO.4。 将上述基因添加启动子与终止子构建功能组 件， 然后整合IntF同源片段， 得到pS-B-RA-GGS-F-U(L)质粒(见表3、 图3)， 该质粒的序列见 SEQ ID NO.5。 该质粒的同源片段为IntF基因， 该质粒整合至耶罗维解脂酵母IntF位点。 0083 表3.质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)的描述 说明书 6/11 页 8 CN 108118007 A 8 0084 0085 0086 将质粒pS-

35、B-RA-GGS-F-U(L)用AscI/SphI酶切， 包含表2序列的线性片段， 根据实 施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株Y2224(Ura3-)。 转化细胞涂布于MM培 养基平板上， 28培养48-72h， 得到转化子YH202。 将长出的黄色单菌落YH202重新在MM培养 基上划线， 培养48-72h后接种于YPD斜面上。 待斜面生长72h后， 转移到20ml YPD液体培养基 中， 28， 200rpm震荡培养72h后液相检测， 得到该菌株 -胡萝 卜素产量为4.35mg/L。 0087 实施例4HMG-CoA还原酶催化部位的克隆及表达 0088 HMG-CoA还原酶是甲

36、羟戊酸途径中重要的限速酶， 催化HMG-CoA到甲羟戊酸的转 化。 为了增加 -胡萝 卜素的产量， 我们通过克隆表达HMG-CoA还原酶的催化部位使碳代谢流 向类异戊二烯途径。 克隆来自耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶基因， 共3000bp， 截取其催 化部位1500-3000bp， 并在起始部位添加ATG起始密码子。 为了使该序列正常表达， 在其上游 和下游分别添加Exp1启动子和Aco终止子， 得到完整的克隆表达元件Exp1-HMG-CoAcata- Aco。 将该元件连接到表达载体上， 得到质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB(表4、 图4)。 该质粒整合 至耶罗维解脂酵母I

37、nt B位点。 该质粒具体序列见SEQ ID NO.6。 0089 表4.质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB的描述 说明书 7/11 页 9 CN 108118007 A 9 0090 0091 0092 将质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB用PmeI/SphI酶切， 回收含上述序列的片段， 根据实 施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH202(Ura3-)中。 转化细胞涂布于MM 培养基平板上， 28培养48-72h得到转化子YH306。 将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上 划线， 培养48-72h后接种于YPD斜面上。 待斜面生长72h后， 转移到20ml

38、 YPD液体培养基中， 28， 200rpm震荡培养72h后液相检测。 YH306产量为7.13mg/L， 说明过表达HMG-CoAcata能够 增强类异戊二烯途径， 增加 -胡萝 卜素的产量。 然后将YH306单菌落接种于20ml YPD培养基 中培养24h， 涂布于MM+5-FOA平板上， 培养48-72h后得到URA3缺失的菌株YH306(Ura3-)。 0093 实施例5敲除Gut2基因增加 -胡萝 卜素产量 0094 构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)(表5、 图5)。 主要包括carB(茄红素脱氢 酶)， carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(

39、焦磷酸双香叶儿基合酶)。 该质粒的 同源臂为Gut2基因的上下游片段， 目的是敲除Gut2基因， 并且补入第二个carB(茄红素脱氢 酶)， carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。 该质粒具 体序列见SEQ ID NO.7。 0095 表5.质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)的描述 0096 说明书 8/11 页 10 CN 108118007 A 10 0097 0098 将质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)用AscI/SphI酶切， 包含表5序列的线性片段， 根据 转化方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH306(Ura3-

40、)中。 转化细胞涂布于MM培养基 平板上， 28培养48-72h得到转化子YH413。 将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上划线， 培养48-72h后接种于YPD斜面上。 待斜面生长72h后， 转移到20ml YPD液体培养基中， 28， 200rpm震荡培养72h后液相检测。 YH413的 -胡萝 卜素的产量为37.4mg/L。 说明敲除Gut2可以 降低3-磷酸甘油的产生， 提升乙酰CoA的产量， 增加 -胡萝 卜素的产量。 然后将YH413单菌落 接种于20ml YPD培养基中培养24h， 涂布于MM+5-FOA平板上， 培养48-72h后得到URA3缺失的 菌株YH413(Ura3-)

41、。 0099 实施例6敲除Pox2基因增加 -胡萝 卜素产量 0100 构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)(表6、 图6)。 主要包括carB(茄红素脱氢 酶)， carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。 该质粒的 同源臂为Pox2基因的上下游片段， 目的是敲除Pox2基因， 并且补入第二个carB(茄红素脱氢 酶)， carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。 该质粒具 体序列见SEQ ID NO.8。 0101 表6.质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)的描述 说明书 9/11 页 1

42、1 CN 108118007 A 11 0102 0103 将质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)用AscI/SphI酶切， 包含表6序列的线性片段， 根据 实施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH413(Ura3-)中。 转化细胞涂布于 MM培养基平板上， 28培养48-72h得到转化子YC511。 将长出的黄色单菌落重新再MM培养基 上划线， 培养48-72h后接种于YPD斜面上。 待斜面生长72h后， 转移到20ml YPD液体培养基 中， 28， 200rpm震荡培养72h后液相检测。 菌株YC511的 -胡萝 卜素的产量为53.0mg/L， 说明 敲除Pox2可

43、以降低过氧化物， 提升乙酰CoA的产量， 增加 -胡萝 卜素的产量。 然后将YH511单 菌落接种于20ml YPD培养基中培养24h， 涂布于MM+5-FOA平板上， 培养48-72h后得到URA3缺 失的菌株YH511(Ura3-)。 0104 实施例7一次性补入多个基因增加 -胡萝 卜素产量 0105 本实施例主要描述一次性补入多个carB(茄红素脱氢酶)， carRA(茄红素合酶和番 茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)对 -胡萝 卜素产量的影响。 酵母基因组 的rDNA有多个100-200个重复单元， 以此为整合位点提高整合拷贝数的应用策略在酵母中 常被应用。 依赖于r

44、DNA的整合可以一次性导入几个甚至几十个的拷贝， 从而实现高效表达。 构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)(表7、 图7)具体序列见SEQ ID NO.9。 说明书 10/11 页 12 CN 108118007 A 12 0106 表7.质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)的描述 0107 0108 0109 将质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)用AscI/SphI酶切， 根据实施例1中的方法将该片 段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH504(Ura3-)中。 转化细胞涂布于MM培养基平板上， 28培 养48-72h得到YC607。 将长出的黄色单菌落重新

45、再MM培养基上划线， 培养48-72h后接种于 YPD斜面上。 待斜面生长72h后， 转移到20mlYPD液体培养基中， 28， 200rpm震荡培养72h后 液相检测。 YC607的 -胡萝 卜素的产量为72.9mg/L。 0110 应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 说明书 11/11 页 13 CN 108118007 A 13 上海医药工业研究院， 中国医药工业研究总院 一种基因工程菌生产 -胡萝 卜素的方法及其基因工程菌 P1611257C 9 PatentIn versio

46、n 3.5 1 7201 DNA Artificial Sequence pSK-HMGcata-URA3.5N-3N 1 cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60 ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120 cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180 ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgt

47、cta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240 accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300 gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360 gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420 caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tccca

48、ttcgc cattcaggct 480 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540 agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600 ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcgc 660 tgagctggcg cgcctctaga aacgtacgtt gtaactattt aaattccttg gtgtttaaac 720

49、 ctttggagta cgactccaac tatgagtgtg cttggatcac tttgacgata cattcttcgt 780 tggaggctgt gggtctgaca gctgcgtttt cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct 840 gcaacgtcat tgctggcttt catcatgatc acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga 900 gagccattga cgttctttct aatttggacc gatagccgta tagtccagtc tatctataag 960 ttcaactaac tcgtaactat ta