一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101942401 B (45)授权公告日 2012.08.22 CN 101942401 B *CN101942401B* (21)申请号 200910264203.0 (22)申请日 2009.12.31 CGMCC3483 2009.11.30 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 廖祥儒 蔡宇杰 张峰 郝之奎 CN 101492646 A,2009.07.29, 全文

2、 . CN 101144066 A,2008.03.19, 全文 . CN 100999718 A,2007.07.18, 全文 . Zhikui Hao 等 .Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1T, Gen. Nov., sp. Nov., a Chitin-Degrading Bacterium Isolated From Soil.Curr Microbiol .2011, 第 62 卷 1732-1738. (54) 发明名称 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 (57) 摘要 一 株 产 几 丁 质 酶 菌 株 及 高 产 几 丁 质

3、酶 的 方 法，属 于 生 物 技 术 领 域。 本 发 明 提 供 了 一 株 高 产 几 丁 质 酶 的 菌 株 (Chitinolyticbactermeiyuanensis)SYBC-H1。 已 保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中 心， 保藏编号为 CGMCC 3483， 保藏日期 2009 年 11 月 30 日。同时还发明了以该菌为出发菌种， 经种 子培养和已优化的产酶培养基发酵生产几丁质酶 的方法， 发酵液酶活最高可达6.0U/ml以上。 所制 备的酶可高效水解几丁质， 生成 N- 乙酰 -D- 氨基 葡萄糖， 可广泛用于化工、 医药、 食品、 材料、 染料 等领域。 (

4、83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 韦炜 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一 株 高 产 几 丁 质 酶 菌 株，为 变 形 菌 纲 的 一 个 新 种，其 分 类 命 名 为 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1， 已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC3483。 权 利 要 求 书 CN 101942401 B 2 1/4 页 3

5、一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 技术领域 0001 本发明利用一株高产几丁质酶的菌株 ( 细菌类 )， 为变形菌纲的一个新种， 我们将 其分类命名为 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 及利用该菌株为出发菌种， 经 种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的方法， 所制备的酶可高效水解几丁质， 所生 成的 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖， 可广泛用于化工、 医药、 食品、 材料、 染料等领域， 属于生物技 术领域。 背景技术 0002 几丁质酶可高效降解几丁质， 生成 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖。研究表明 ： N- 乙 酰 -D- 氨基葡萄

6、糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位， 尤其是甲壳类动物的外骨 骼含量最高。 它是合成双歧因子的重要前体， 在生物体内具有许多重要生理功能。 临床上用 于治疗风湿性及类风湿性关节炎。也可以作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂， 糖尿病 患者甜味剂。 主要用于临床增强人体免疫系统的功能， 抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长， 对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用 ； 对于各种炎症， 能起到有效的治疗， 对骨关节炎及 关节疼痛也有治疗作用。 0003 几丁质酶的价格极为昂贵， 如日本的chitin T-1几丁质酶市价为每50毫克20000 日元 0004 由于几丁质酶具有广阔的应用前景和极高的经济开发

7、价值， 世界上一些发达国家 都在进行生物技术生产几丁质酶的研究。 为此， 我们确定筛选高产几丁质酶的新菌株， 并建 立利用新菌株发酵生产几丁质酶的方法作为博士论文研究课题， 取得了突破性的进展。 发明内容 0005 本发明的目的利用一株高产几丁质酶的菌株 ( 细菌类 )， 为变形菌纲的一个新种， 我们将其分类命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1及利用该菌株为出发菌 种， 经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的方法， 所制备的酶可高效水解几丁质， 生成 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖， 可广泛用于化工、 医药、 食品、 材料、 染料等领域， 来

8、替代价格 昂贵的进口的几丁质酶。 0006 本发明的技术方案 ： 一株高产几丁质酶的菌株 ( 细菌类 )， 为变形菌纲的一个新 种， 我们将其分类命名为 Chitinolyticbacter meiyuanensis)SYBC-H1 已保存于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC3483。 0007 用 CGMCC3483 菌株为出发菌种， 经种子培养和已优化的培养基发酵产几丁质酶的 方法 ； 工艺为 ： 0008 (1) 种子培养 0009 种子培养基 ( 以质量浓度计 ) ： 磷酸二氢钾 0.07， 磷酸氢二钾 0.03， 硫酸镁 0.05， 七水硫酸亚铁

9、0.001， 酵母浸出物 0.4， 葡萄糖 0.2， 蛋白粉 0.4。 0010 培养条件 ： 从平板上处于指数生长期的该菌菌落取两接种环接种于盛有 50ml 种 说 明 书 CN 101942401 B 3 2/4 页 4 子培养基的 250ml 三角瓶中进行培养， pH 值 ： 7.0， 温度 ： 30， 转速 200rpm， 培养时间 ： 12h。 0011 (2) 产酶培养 0012 产 酶 培 养 基 ： 磷 酸 二 氢 钾 (0.05-0.1)， 磷 酸 氢 二 钾 (0.02-0.06)， 硫 酸 镁 (0.03-0.07)， 七水硫酸亚铁 (0.001-0.005)， 酵母浸出

10、物 (0.2-0.4)， 葡萄糖 (0.10-0.30)， 尿素 (0.4-1.0)， 几丁质粉粒 (1-2)。 0013 产酶条件 ： 再以 2 -6接种量， 进行 5L 发酵罐发酵， pH ： 7.0-8.5， 温度 ： 26-36， 发酵时间 ： 60-84h， 转速 ： 200-500prm， 通气量 ： 1.0-2.0L/min/L。 0014 根据上述条件， 在 5L 的发酵罐中进行发酵， 发酵液几丁质酶活最高可达 6U/ml。 0015 本发明从不同环境条件下的土壤中筛选出一种高产几丁质酶的新菌种， 分类命名 为 Chitinolyticbacter meiyuanensisSY

11、BC-H1。 0016 本菌株的筛选和菌种鉴定 ： 0017 1.1 采集大量不同环境条件下的土壤样品， 取 1g 土壤样本加到灭菌后的含 1粉 末几丁质的50ml溶液中， 培养24h后， 对培养液进行无菌稀释适当倍数， 涂布于种子培养基 ( 含 1琼脂 ) 平板培养。挑选产生透明圈较大的单菌落进行斜面保存。 0018 1.2 将筛选到的菌株， 用产酶培养基进行液体摇瓶发酵。最终筛选到一株产几丁 质酶活力较高的菌株 ( 图 1)， 经生理生化鉴定 ( 见表 1) 和电镜观察 ( 见图 2) 及 16S rDNA 序列鉴定 ( 见序列 SEQ ID NO ： 1)， 发现该菌株为一株产几丁质酶的

12、新种， 我们将其分类命 名为 Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1。 0019 表 1 ： SYBC-H1 的部分生理生化试验 0020 项目 类别 淀粉 水解 V-P 试验 H2S 生成 H2O2的 生成 明胶 液化 石蕊、 牛乳 甲基红 试验 乙醇的 氧化 SYBC-H1 + - - - + - + - 0021 2、 酶活的测定方法 0022 发酵液经 6000rpm、 4、 10min 离心后， 取 0.5ml 上清液， 加入 1ml 0.1M 醋酸 - 醋 酸钠缓冲液 (pH 6.5)， 0.5ml 0.5的胶体几丁质 (W/V)， 37保温

13、30min， 取出后加入 DNS 试剂 0.5ml， 沸水浴 10min 后， 迅速用冰水冷至室温， 6000rpm 离心 8min， 530nm 处比色， 重 复三次， 取平均值作试验结果， 同时以高温灭活的上清液同样处理作为对照， 最后以OD530的 平均值来计算还原糖的含量， 计算出酶活。酶活力定义为在上述条件下每分钟释放相当于 1mmolNAG 所需要的酶量为一个酶活单位 (U)。 0023 本发明的有益效果 ： 首先提供了一株高产几丁质酶的菌株为出发菌及利用该出发 菌采用液体发酵制备几丁质酶的方法。 本发明的菌种和发酵产酶方法与其他菌种和制备几 丁质酶方法相比较， 具有酶活力高， 发

14、酵技术简便和成本低的优点， 且生产的几丁质酶可高 效水解几丁质， 因此， 本发明的菌种和发酵产酶技术有着广泛的工业使用价值和显著的经 济效益前景。 0024 附图表说明 0025 图 1 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 的平板菌落。 说 明 书 CN 101942401 B 4 3/4 页 5 0026 图 2 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 的透射电镜形态。 0027 生物材料样品保藏 0028 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1， 已保存于中国微生物菌

15、种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏日期 ： 2009 年 11 月 30 日， 保藏编号为 CGMCC3483。 具体实施方式 0029 实施例 1 0030 产酶培养基 ( 以质量浓度计 ) ： 磷酸二氢钾 (0.05)， 磷酸氢二钾 (0.02)， 硫酸镁 (0.03)， 七水硫酸亚铁 (0.001)， 葡萄糖 (0.10)， 尿素 (0.4)， 几丁质粉粒 (0.4)。 0031 产酶条件 ： 接种量 2： ， 进行 5L 发酵罐发酵， pH ： 8.5， 温度 ： 26， 发酵时间 ： 72h， 转速 ： 200prm， 通气量 ： 1.0L/min/L。 0032 在以上条件下

16、发酵， 所得到的粗酶酶活可达 5.2U/mL。摇瓶对照酶活为 5.5U/mL。 0033 实施例 2 0034 产酶培养基 ( 以质量浓度计 ) ： 磷酸二氢钾 (0.07)， 磷酸氢二钾 (0.05)， 硫酸镁 (0.06， 七水硫酸亚铁 (0.001)， 葡萄糖 (0.12)， 尿素 (0.4)， 几丁质粉粒 (0.4)。 0035 产酶条件 ： 接种量 5， 进行 5L 发酵罐发酵， pH ： 7.5， 温度 ： 28， 发酵时间 ： 60h， 转速 ： 200prm， 通气量 ： 2.0L/min/L。 0036 在以上条件下发酵， 所得到的粗酶酶活可达 6.0U/mL。摇瓶对照酶活为

17、 5.7U/mL. 0037 实施例 3 0038 产酶培养基 ( 以质量浓度计 ) ： 磷酸二氢钾 (0.10)， 磷酸氢二钾 (0.06)， 硫酸镁 (0.07)， 七水硫酸亚铁 (0.001)， 葡萄糖 (0.3)， 尿素 (1.0)， 几丁质粉粒 (1.0)。 0039 产酶条件 ： 接种量 5： ， 进行 5L 发酵罐发酵， pH ： 8.0， 温度 ： 36， 发酵时间 ： 72h， 转速 ： 500prm， 通气量 ： 2.0L/min/L。 0040 在以上条件下发酵， 所得到的粗酶酶活可达 5.4U/mL。摇瓶对照酶活为 5.3U/mL。 0041 序列表 0042 SEQ

18、ID NO ： 1 0043 1526 0044 DNA 0045 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 0046 agagtttgat cctggctcag cttgaacgct ggcggcatgc tttacacatg caagtcgaac 60 0047 ggtaacaggg acttcggtcc gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt 120 0048 gcctattagt gggggatagc ccggcgaaag ccggattaat accgcatacg ccctgagggg 180 00

19、49 gaaagtgggg gatcgcaaga cctcacgcta ttagagcggc cgatggctga ttagctagtt 240 0050 ggtagggtaa aggcctacca aggcgacgat cagtagcggg tctgagagga cgacccgcca 300 0051 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atcttggaca 360 0052 atgggcgcaa gcctgatcca gcaatgccgc gtgggtgaag aaggccttcg ggttgtaaag 420 00

20、53 cccttttgtc agggagcaaa tccttggagc taatatctcc cggggatgag agtacctgaa 480 0054 gaataaggac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt ccaagcgtta 540 0055 atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggtggcttgt taagagcgat gtgaaatccc 600 说 明 书 CN 101942401 B 5 4/4 页 6 0056 cgggctcaac ctgggaactg cattgctgac tggctcgc

21、ta gagtgcggca gaggggggtg 660 0057 gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccgat ggcgaaggca 720 0058 accccctggg ctgacactga cactcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780 0059 accctggtag tccacgccct aaacgatgtc tactagttgt tggggatttc gatccttagt 840 0060 aacgcagcta acgcgtgaag tagaccgcct ggggagta

22、cg gtcgcaagat taaaactcaa 900 0061 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga 960 0062 aaaaccttac ctggtcttga catgtacgga accctttaga gatagagggg tgccttcggg 1020 0063 agccgtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080 0064 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgcta

23、ccat tcagttgagc actttaagga 1140 0065 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200 0066 accagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaaccc gcgaggggga 1260 0067 gccaatctca taaaaccgat cgtagtccgg attgcactct gcaactcgag tgcatgaagt 1320 0068 cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg tc

24、gcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380 0069 acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt ctaccagaag tagctaggct aaccgcaagg 1440 0070 aggccggtta ccacggtagg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg 1500 0071 ggaacctgcg gctggatcac ctcctt 1526 说 明 书 CN 101942401 B 6 1/2 页 7 图 1 ： Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 的平板菌落 说 明 书 附 图 CN 101942401 B 7 2/2 页 8 图 2 ： Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 的透射电镜形态 说 明 书 附 图 CN 101942401 B 8