一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及其应用.pdf

1、10申请公布号CN102002535A43申请公布日20110406CN102002535ACN102002535A21申请号201010561134222申请日20101126C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601G01N21/6420060171申请人烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址264000山东省烟台市芝罘区新海阳街59号烟台出入境检验检疫局申请人中国检验检疫科学研究院72发明人耿金培赵文军粟智平鲁闽陈洪俊杨益娥朱水芳74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及

2、其应用57摘要本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及其应用。本发明提供的试剂包括由序列表的序列1、序列2、序列4和序列5所示DNA组成的特异引物。所述试剂还可包括序列3所示探针甲和序列6所示探针乙。马铃薯A病毒是我国重要的检疫性有害生物，本发明提供了两套PCR引物探针组合物，建立了双引物探针RTREALTIMEPCR检测PVA的方法。该方法采用实时荧光PCR技术，有效提高了检测的灵敏度；两套扩增效率一致的引物探针相互验证确认，有效提高了结果的准确性，在实际检测中具有较强的可操作性。本方法准确、灵敏、简便、快速，检出低限均可达05FG/L植物总RNA。51INTCL19中华人民共和国

3、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表4页附图3页CN102002546A1/1页21一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。2如权利要求1所述的试剂，其特征在于所述试剂由所述特异引物、特异探针甲和特异探针乙组成；所述特异探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。3如权利要求2所述的试剂，其特征在于所述特异探针甲为TAQMAN探针；所述特异探针乙为TAQMAN探针。4权利要求1至3中任一所述的试剂在制

4、备辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂盒中的应用。5一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂盒，包括权利要求1至3中任一所述的试剂。6权利要求1至3中任一所述的试剂在辅助鉴定马铃薯A病毒中的应用。7一种辅助鉴定马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为73BP且PCR产物乙为76BP，待测病毒为候选的马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组

5、成的引物对。8一种辅助鉴定马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。9

6、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待测病毒为马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或香石竹环斑病毒。10一种检测待测样本中是否含有马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤1提取待测样本的总RNA，反转录为CDNA；2以所述CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组

7、成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。权利要求书CN102002535ACN102002546A1/6页3一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及其应用技术领域0001本发明涉及一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及其应用。背景技术0002马铃薯A病毒POTATOVIRUSA，PVA，属于马铃薯Y病毒属POTYVIRUS成员，主要在日本、美国、欧洲各国发生，我国局部分布，正在采取控制措施。PVA是我国一种重要的进境检疫性植物病毒。0003马铃薯A病毒的自然寄主要为马铃薯，也可侵染其他茄科植物。PVA单独

8、侵染引起花叶或皱叶，对马铃薯影响较大，严重时可造成减产40以上程晔，陈炯，陈剑平，杭州郊区马铃薯A病毒分离物的基因组3末端序列测定及系统化分析J浙江农业学报，2002，1427175。若与其它病毒如马铃薯X、Y病毒和马铃薯M病毒等复合侵染，则加重症状和产量损失，危害更大HOOKERWJCOMPENDIUMOFPOTATODISEASEMSTPAULMNTHEAMERICANPHYTOPATHOLOGICALSOCIETY，1981。PVA能被多种蚜虫非持久性传播；另外，该病毒在马铃薯上系统侵染，能够进入薯块，薯块带毒率高，因此也能随种薯和组培苗传播。由于有蚜虫，该病毒在田间扩散容易，特别是马铃

9、薯和其他茄科作物在同一地区出现时，能加速该病毒的扩散。当种薯生产体系尚未完全建立，自留地比较普遍时，该病毒极易扩散。0004马铃薯具有很高的食用和经济价值，近年来，已上升为我国第四大粮食作物，对于维护我粮食安全具有重要意义。许多国家看好中国马铃薯市场，大量的马铃薯种薯输入或将要输入我国。引进的马铃薯种薯携带马铃薯A病毒的机率极大。为了维护我国马铃薯这一巨大产业健康发展、防止马铃薯A病毒随马铃薯种薯等进境物传入中国并尽量减少国际贸易摩擦，开发出快速、灵敏检测马铃薯A病毒的先进的技术，意义重大。0005目前，检测马铃薯A病毒的方法主要以酶联免疫吸附测定ELISA为主王秀芬，刘伟等，引进加拿大马铃薯

10、种薯中病毒的检测J植物检疫，2002，1611618；刘洪义，李明福等，黑龙江马铃薯病毒病的普查及鉴定J东北农业大学学报，2006，373307310；高海霞，邹明强等，流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒J微生物学报，483380384，也有少数采用RTPCR凝胶电泳技术的研究报道吴兴泉，谢联辉等，福建马铃薯A病毒的分子鉴定及检测技术J农业生物技术学报，2004，1219095；袁青，殷幼平等，二重RTPCR快速检测马铃薯病毒的方法J植物检疫，2005，193135138。ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性；PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易

11、于造成污染。未见采用实时荧光PCR检测PVA的研究报道。发明内容0006本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂及其应用。0007本发明提供的辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序说明书CN102002535ACN102002546A2/6页4列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。0008所述试剂可由所述特异引物、特异探针甲和特异探针乙组成；所述特异探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。0009所述特异探针甲可为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的

12、序列3所示。所述特异探针乙可为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。0010所述试剂可用于制备辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂盒。0011本发明还保护一种辅助鉴定马铃薯A病毒的试剂盒，它包括所述试剂。0012所述试剂可用于辅助鉴定马铃薯A病毒。0013本发明还保护一种辅助鉴定马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为73BP且PCR产物乙为76BP，待测病毒为候选的马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所

13、示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对。0014本发明还保护另一种辅助鉴定马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQ

14、MAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测病毒为候选的马铃薯A病毒。0015所述待测病毒具体可为马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或香石竹环斑病毒。0016本发明还保护一种检测待测样本中是否含有马铃薯A病毒的方法，包括如下步骤00171提取待测样本的总RNA，反转录为CDNA；00182以所述CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲

15、线乙判断待测样本中是否含有马铃薯A病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测样本含有马铃薯A病毒。0019所述TAQMAN探针5末端具体可连接有荧光报告染料FAM，3末端具体可连接有荧光淬灭染料TAMRA。说明书CN102002535ACN102002546A3/6页50020不同的方法，灵

16、敏度和准确性差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法灵敏度相差100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相差也在100倍以上。即使同样采用实时荧光PCR技术，由于引物的扩增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实际检测鉴定工作中，为了提高结果的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试验，不同方法检测灵敏度不一样，很难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增加了难度，特别是在检测目标含量极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检测灵敏度一样或非常接近，这个难题就迎刃而解。0021实时荧光PCRREALTIMEPCR检测技术是国际最近十余年发展起来的高新

17、检测技术，该技术将PCR扩增与荧光检测系统有机结合起来。与目前已报道的其它检测技术相比，该技术具有巨大的优越性，主要体现在A能实时观察PCR过程中待检测样品模板DNA或CDNA扩增情况，无需进行电泳、染色和紫外检测，大大简化了操作程序并缩短检测时间；B采用荧光信号放大功能，大大提高了灵敏度；C特异性引物与特异荧光探针双保险结构有效提高了检测的准确性；D全封闭的操作系统，减少了PCR产物对实验室环境的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。实时荧光PCR技术，是目前最准确、最灵敏的技术，其优越性使之在植物检疫中具有广阔的应用范围和前景。0022马铃薯A病毒POTATOVIRUSA，P

18、VA是我国重要的检疫性有害生物，本研究根据PVA中CP基因COATPROTEINGENE的保守序列，设计了两套引物探针组合物每套引物探针组合物由上游引物、下游引物和探针组成，建立了双引物探针RTREALTIMEPCR检测PVA的方法。0023与现有技术比较，本发明的优点如下1上述实时荧光PCR技术的优点在本发明得以全部体现，如准确、灵敏、简便、快速和能有效减少污染等；2两套引物探针相互验证，进一步有效提高了结果的准确性；3两套引物探针的扩增效率一致，因此对于同一个样品的两次验证实验，结果的能保证基本一致，从而降低了结果判断的难度，在实际检测工作、科研和解决重大的国际贸易争端中具有极强的可操作性

19、；4两套引物探针的扩增效率极高，检出低限均可达05FG/L植物总RNA。附图说明0024图1为特异性测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A为PVA，B为PVV，C为PVY，D为CRSV，E为CK1，F为CK2。0025图2为特异性测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A为PVA，B为PVV，C为PVY，D为CRSV，E为CK1，F为CK2。0026图3为灵敏度测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为5NG/L、500PG/L、50PG/L、5PG/L、500FG/L、

20、50FG/L、5FG/L、05FG/L、005FG/L、0005FG/L，K对应DEPC水。0027图4为为灵敏度测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为5NG/L、500PG/L、50PG/L、5PG/L、500FG/L、50FG/L、5FG/L、05FG/L、005FG/L、0005FG/L，K对应DEPC水。0028图5为试剂甲和试剂乙的扩增效率对比图；纵轴为RN，横轴为循环数；A为试剂甲，B为试剂乙。说明书CN102002535ACN102002546A4/6页6具体实施方式0029以下的实施例便于更好地

21、理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实时荧光PCR基因扩增仪为ABIPRISM7000美国ABI公司；核酸蛋白分析仪为BIOPHOTOMETER德国EPPENDORF公司；植物总RNA提取试剂盒商品名EZNATM，美国OMEGA公司产品，货号R286701购自北京双羸生物公司；反转录试剂盒购自大连宝生物公司TAKARA货号DRR037A、实时荧光PCR试剂盒定量PCRSUPERMIXUDG，货号C11730025购自美国INVITROGEN公司。以下实施例中的定量试验，均设

22、置三次重复实验，结果取平均值。实时荧光PCR的结果的判定标准为CT值40，为阳性；CT值40，为阴性。0030马铃薯A病毒POTATOVIRUSA，PVAATCC编号PVAS266；0031香石竹环斑病毒CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSVATCC编号PV21；0032马铃薯V病毒POTATOVVIRUS，PVVATCC编号PV754；0033马铃薯Y病毒POTATOVIRUSY，PVYATCC编号PV50；0034ATCC即美国标准菌种收藏所AMERICANTYPECULTURECOLLECTION，HTTP/WWWATCCORG/。0035实施例1、试剂的制备0036一、

23、引物和探针的设计0037根据美国NCBI核酸数据库中马铃薯A病毒基因组NC_004039中CP基因序列保守区，分别设计两条上游引物PVA1F和PVA2F、两条下游引物PVAIR和PVA2R和两条TAQMAM探针PVA1P和PVA2P。0038二、试剂的组成00391、试剂甲的组成0040试剂甲由PVA1F、PVA1R和PVA1P组成引物和探针由上海生工合成。0041PVA1F上游引物5CTCGCAGAGGCGTACATTGA3序列表的序列1；0042PVA1R下游引物5GGTTGCGTTGAAGACCATACC3序列表的序列2；0043PVA1P探针5FAMATGAGAAGTCGTGAGAAA

24、CCATACATGCCC3TAMARA；核苷酸序列为序列表的序列3，5端标记报告荧光染料FAM，3端标记淬灭荧光染料TAMRA。0044PVA1F和PYA1R的靶序列大小为73BP见序列表的序列7。00452、试剂乙的组成0046试剂乙由PVA2F、PVA2R和PVA2P组成引物和探针由上海生工合成。0047PVA2F上游引物5GCGCTGAAGAATTCGAACACT3序列表的序列4；0048PVA2R下游引物5GCCTTTCTGTGTCCTCTTCTGAA3序列表的序列5；0049PVA2P探针5FAMTGTGACATTTCCGTCCAGTCCAAACATG3TAMARA；核苷酸序列为序列

25、表的序列6，5端标记报告荧光染料FAM，3端标记淬灭荧光染料TAMRA。0050PVA2F和PVA2R的靶序列大小为76BP见序列表的序列8。0051实施例2、试剂的应用0052分别取感染四种病毒PVA、PVV、PVY和CRSV的马铃薯叶片，取健康马铃薯叶片作说明书CN102002535ACN102002546A5/6页7为对照、应用实施例1制备的试剂甲和试剂乙分别进行特异性测定、灵敏度测定，并进行试剂甲和试剂乙的扩增效率对比。0053一、试剂的特异性测定00541、总RNA提取及质量控制0055用植物总RNA提取试剂盒从感染每种病毒的叶片4种和健康叶片CK1中分别提取总RNA。用核酸蛋白分析

26、仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。00562、反转录合成CDNA0057用反转录试剂盒分别将步骤1从5种叶片中提取的总RNA进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的对照CK2。0058反应体系25L5LPRIMERSCRIPTTMBUFFER5，125LPRIMERSCRIPTTMENZYMEMIXI，125LOLIGODTPRIMER50M，125LRANDOM6MERS100M，2L总RNA，加DEPC水至25L。0059反应条件37、15MIN，85、5S。00603、试剂的特异性0061用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂

27、试剂甲或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0062试剂甲的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，PVA1F15M1L，PVA1R15M1L，PVA1P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0063试剂乙的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，PVA2F15M1L，PVA2R15M1L，PVA2P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0064试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABIPRISM7000的96孔板中进行；循环条件为50、2MIN；95、2MIN；95、15S，

28、60、30S，45个循环。0065采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图1。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图2。应用试剂甲只有在PVA中出现扩增曲线CT值21，判为阳性；应用试剂乙只有在PVA中出现扩增曲线CT值20。PVV、PVY、CRSV、CK1和CK2均未出现扩增信号，判为阴性。结果表明，试剂甲或试剂乙的特异性很好，结果与预计相符。0066二、试剂的灵敏度测定00671、总RNA提取和各个稀释液的制备0068用植物总RNA提取试剂盒从感染PVA的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度和纯度值。浓度值为50NG/L，纯度值为0D260/2802

29、14，OD260/230238。0069用DEPC水将提取的总RNA进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。各个稀释液中，RNA浓度分别为5NG/L、500PG/L、50PG/L、5PG/L、500FG/L、50FG/L、5FG/L、05FG/L、005FG/L、0005FG/L。00702、反转录合成CDNA0071用反转录试剂盒分别将各个稀释液进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的说明书CN102002535ACN102002546A6/6页8对照。0072反应体系25L5LPRIMERSCRIPTTMBUFFER5，125LPRIMERSCRIPTTMENZYMEMIXI，125

30、LOLIGODTPRIMER50M，125LRANDOM6MERS100M，2L稀释液，补充DEPC水至25L。0073反应条件37、15MIN，85、5S。00743、试剂的灵敏度0075用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂试剂甲或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0076试剂甲的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，PVA1F15M1L，PVA1R15M1L，PVA1P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0077试剂乙的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，PVA2F15M1L，PVA2R1

31、5M1L，PVA2P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0078试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABIPARISM7000的96孔板中进行；循环条件为50、2MIN；95、2MIN；95、15S，60、30S，45个循环。0079采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图3。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图4。应用试剂甲可以判为阳性的最低稀释度为05FG/L植物总RNACT值39；应用试剂乙可以判为阳性的最低稀释度为05FG/L植物总RNACT值39。结果表明，应用试剂甲或试剂乙检测的灵敏度可达108，即05FG/L植物总RNA。0080三、试剂甲和试剂乙的扩增

32、效率对比00811、总RNA提取0082用植物总RNA提取试剂盒从感染PVA的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度和纯度值。00832、反转录合成CDNA0084用反转录试剂盒将总RNA进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的对照。0085反应体系同步骤一的2。00863、试剂的灵敏度0087用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂试剂甲或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0088方法同步骤一的3。0089实时荧光PCR结果见图5。采用试剂甲的CT值18；采用试剂乙的CT值17。结果表明，试剂甲和试剂乙的扩增效率几乎完全一样。说明书CN102002535ACN102002546A1/4页90001序列表CN102002535ACN102002546A2/4页1000020003序列表CN102002535ACN102002546A3/4页110004序列表CN102002535ACN102002546A4/4页12序列表CN102002535ACN102002546A1/3页13图1图2说明书附图CN102002535ACN102002546A2/3页14图3图4说明书附图CN102002535ACN102002546A3/3页15图5说明书附图CN102002535A