一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102586158 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586158 A *CN102586158A* (21)申请号 201210064448.0 (22)申请日 2012.03.13 CGMCC No.5697 2012.01.09 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/26(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 天津工业生物技术研究所 地址 300308 天津市东丽区空港经济区西七 道 32 号 (72)发明人 宋江宁 李小曼 王辉林 马延和 (74)专

2、利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株用于碱性果胶酶的工程 菌及其应用。本发明提供的工程菌属于大肠埃 希氏菌 (Escherichia coli)， 命名为 BL21(DE3) PGL04， 保藏号为 CGMCC No.5697。本发明还保护 一种生产碱性果胶酶的方法， 包括如下步骤 ： (1) 将大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 接种至发酵培 养基， 得到 OD600nm 0.1-0.2 的发酵初始体系 ； (2) 将发酵初始体系进行如下发酵 ： 先 35-3

3、7 振荡培养 3-5 小时， 然后加入 IPTG 至终浓度为 50-100M， 25-30继续振荡培养 40-48 小时， 得 到碱性果胶酶。本发明提供工程菌可用于生产碱 性果胶酶， 进一步可用于麻类脱胶产业。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 大 肠 埃 希 氏 菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)PGL04， 它 的 保 藏 编 号 为 CGMCC No.5697。 2. 权利要求 1 所述大肠埃希氏菌

4、BL21(DE3)PGL04 在生产碱性果胶酶中的应用。 3. 一种生产碱性果胶酶的方法， 包括如下步骤 ： (1) 将权利要求 1 所述大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 接种至发酵培养基， 得到 OD600nm 0.1-0.2 的发酵初始体系 ； (2)将发酵初始体系进行如下发酵 ： 先35-37振荡培养3-5小时， 然后加入IPTG至终 浓度为 50-100M， 25-30继续振荡培养 40-48 小时， 得到碱性果胶酶。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养基制备方法如下 ： 取 10-15g 胰蛋白胨、 15-23g 酵母提取物、 5-10g 氯化

5、钠、 10-15g 甘油、 10-17mM 磷酸二氢钾和 65-75mM 磷酸氢二钾， 用水溶解并定容至 1L。 5. 如权利要求 3 或 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 以 种子液的方式接种至所述发酵培养基。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于 ： 所述种子液的制备方法如下 ： 将所述大肠埃 希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至种子培养基， 35-37振荡培养至OD600nm3-6， 即为种子液。 7. 如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述种子培养基的制备方法如下 ： 取 10-15g 胰蛋白胨、 5-8g 酵母提取物

6、和 5-10g 氯化钠， 用水溶解并定容至 1L。 8. 权利要求 3 至 7 中任一所述方法生产得到的碱性果胶酶。 9. 权利要求 8 所述碱性果胶酶在降解多聚半乳糖醛酸中的应用。 10. 权利要求 8 所述碱性果胶酶在以多聚半乳糖醛酸为底物生产不饱和多聚半乳糖醛 酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102586158 A 2 1/4 页 3 一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用。 背景技术 0002 果胶是植物细胞壁的重要组成成分， 包括原果胶， 果胶酸和果胶酯酸。 果胶物质的 存在可以增加植物细胞壁的坚硬度， 有

7、利于维持植物的特定外形结构， 但增加了对植物进 行深加工的工业操作的难度。 0003 果胶酶是指能够分解果胶质的一类酶， 普遍存在于自然界的高等植物和微生物 中， 是重要的工业酶制剂。 0004 碱性果胶酶 (EC ： 4.2.2.2) 是一类在碱性条件下， 以反式消去作用断开果胶质主 链， 产生不饱和的寡聚半乳糖醛酸的酶， 在纺织工业的麻类脱胶、 棉织品精炼等领域内有着 广泛的应用。 相比于传统的高碱、 高温处理手段， 使用碱性果胶酶不仅对果胶质有较好的去 除作用， 对天然纤维素纤维损伤较小， 而且可以减少材料消耗和环境负担， 为纺织工业开辟 了一条绿色清洁之路。 0005 国内对于碱性果胶

8、酶的的研究大多集中在野生产酶菌株的筛选以及发酵条件优 化等方面， 但野生菌的生产能力与工业应用的需求尚有一定的距离。利用工程菌生产碱性 果胶酶可以很好的填补这一空白。 近年来， 出现了用重组毕赤酵母表达碱性果胶酶的报道， 但这种技术发酵周期长、 能耗大。 因此构建发酵周期短、 操作简单的工程菌株成为碱性果胶 酶工业化应用的关键。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一株用于碱性果胶酶的工程菌及其应用。 0007 本发明提供的工程菌属于大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)， 命名为 BL21(DE3) PGL04， 已于 2012 年 1 月 9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委

9、员会普通微生物中心 ( 简 称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 )， 保藏号为 CGMCC No.5697。大肠埃 希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PGL04 CGMCC No.5697简称大肠埃希氏菌BL21(DE3) PGL04。 0008 所述大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 可用于生产碱性果胶酶。 0009 本发明还保护一种生产碱性果胶酶的方法， 包括如下步骤 ： 0010 (1) 将 大 肠 埃 希 氏 菌 BL21(DE3)PGL04 接 种 至 发 酵 培 养 基， 得 到 OD600nm 0.1-0.2(

10、如 0.1-0.15 或 0.15-0.2) 的发酵初始体系 ； 0011 (2) 将发酵初始体系进行如下发酵 ： 先 35-37 ( 如 35-36或 36-37 ) 振荡培 养3-5小时(如3-4小时或4-5小时)， 然后加入IPTG至终浓度为50-100M(如50-75M 或 75-100M)， 25-30 ( 如 25-28或 28-30 ) 继续振荡培养 40-48 小时 ( 如 40-45 小 时或 45-48 小时 )， 得到碱性果胶酶。 0012 所述发酵培养基制备方法如下 ： 取 10-15g( 如 10-12g 或 12-15g) 胰蛋白胨、 说 明 书 CN 102586

11、158 A 3 2/4 页 4 15-23g( 如 15-19g 或 19-23g) 酵母提取物、 5-10g( 如 5-7g 或 7-10g) 氯化钠、 10-15g( 如 10-12g 或 12-15g) 甘 油、 10-17mM( 如 10-14mM 或 14-17mM) 磷 酸 二 氢 钾 和 65-75mM( 如 65-70mM 或 70-75mM) 磷酸氢二钾， 用水溶解并定容至 1L。 0013 所述发酵培养基的 pH 可为 7.0-7.2( 如 7.0-7.1 或 7.1-7.2)。 0014 所述大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 可以以种子液的方式接种至所述发酵培养

12、 基。 0015 所述种子液的制备方法如下 ： 将大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 接种至种子培养 基， 35-37 ( 如 35-36或 36-37 ) 振荡培养至 OD600nm 3-6( 如 3-4.5 或 4.5-6)， 即为 种子液。 0016 所述种子培养基的制备方法如下 ： 取 10-15g( 如 10-13g 或 13-15g) 胰蛋白胨、 5-8g( 如 5-7g 或 7-8g) 酵母提取物和 5-10g( 如 5-7g 或 7-10g) 氯化钠， 用水溶解并定容至 1L。 0017 所述种子培养基的 pH 可为 7.0-7.2( 如 7.0-7.1 或 7.1-7

13、.2)。 0018 以上任一所述振荡培养可为 100-200r/min( 如 100-150r/min 或 150-200r/min) 的振荡培养。 0019 以上任一所述方法生产得到的碱性果胶酶均属于本发明的保护范围。 0020 所述碱性果胶酶可用于降解多聚半乳糖醛酸。 0021 所述碱性果胶酶可用于以多聚半乳糖醛酸为底物生产不饱和多聚半乳糖醛酸。 0022 所述碱性果胶酶为具有如下功能的物质 ： 在碱性环境 ( 如 pH9.4) 中， 将多聚半乳 糖醛酸转化为不饱和多聚半乳糖醛酸。 0023 本发明提供工程菌和方法可用于生产碱性果胶酶， 具备潜在工业化价值 ( 如麻类 脱胶、 生物制浆、

14、环境保护等行业 )， 为后续的工业化研究奠定了基础。 具体实施方式 0024 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0025 实施例 1、 工程菌的获得和保藏 0026 一、 工程菌的获得 0027 1、 提取土壤的全基因组 DNA。 0028 2、 根据碱性果胶酶相关基因序列， 设计简并引物。 0029 3、 以全基因组 DNA 为模板， 用步骤 2 设计的简并引物进行

15、 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增 产物。 0030 4、 将步骤 3 的 PCR 扩增产物测序， 发现一个新基因。 0031 5、 将新基因插入载体 pET28b 的 NcoI 和 XhoI 酶切位点之间， 得到重组质粒。 0032 6、 将重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 得到一株重组菌 ( 工程菌 )， 命名为 BL21(DE3)PGL04。 0033 二、 工程菌的保藏 说 明 书 CN 102586158 A 4 3/4 页 5 0034 BL21(DE3)PGL04 属于大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)。BL21(DE3)PGL04 已 于 2012

16、年 1 月 9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 )， 保藏号为 CGMCC No.5697。大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)PGL04 CGMCC No.5697简称大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04。 0035 实施例 2、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0036 一、 培养基的制备 0037 种子培养基(pH7.0) ： 取10g胰蛋白胨、 5g酵母提取物和5g氯化钠， 用水溶解并定 容至 1L ； 121灭菌 30min。 0038 发酵培养基(pH7.0

17、) ： 取10g胰蛋白胨、 15g酵母提取物、 5g氯化钠、 10g甘油、 10mM 磷酸二氢钾和 65mM 磷酸氢二钾， 用水溶解并定容至 1L ； 121灭菌 30min。 0039 二、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0040 1、 将大肠埃希氏菌 BL21(DE3)PGL04 接种至种子培养基， 35振荡培养 (100r/ min) 至 OD600nm 3， 即为种子液。 0041 2、 将步骤 1 的种子液接种至 40mL 发酵培养基 ( 采用 250mL 摇瓶 )， 得到 OD600nm 0.1 的发酵初始体系 ； 发酵过程如下 ( 共 43 小时 ) ： 先 35振荡培养 (100r

18、/min)3 小时， 然 后加入 IPTG 至终浓度为 50M 继续 25振荡培养 (100r/min)40 小时。 0042 3、 将完成步骤 2 的发酵体系离心 (12000r/min， 5min) 收集上清液。 0043 三、 酶活测定 0044 将步骤二得到的上清液用甘氨酸 -NaOH 缓冲液 (0.2mol/L， pH9.4) 稀释后进行酶 活测定， 具体方法如下 ： 0045 实验组 ： 在2ml溶液甲中加入20L待测溶液， 45反应15min， 加入3mL0.03mol/ L H3PO4水溶液 ( 终止液 )， 测定 235nm 的吸光度值 ； 0046 对照组 ： 在 2ml

19、溶液甲中依次加入 3mL 0.03mol/L H3PO4水溶液和 20L 待测溶 液， 测定 235nm 的吸光度值。 0047 溶液甲的配方 ： 含 0.2g/100ml 多聚半乳糖醛酸 ( 购自 Sigma-Aldrich 公司， 货号 81325-50G) 和 0.44mmol/L CaCl2的甘氨酸 -NaOH 缓冲液 (0.2mol/L， pH9.4)。 0048 碱性果胶酶一个标准酶活单位 (1U) 定义为 ： 在上述条件下， 1min 反应时间内使 PGA 产生 1mol 的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。 0049 碱性果胶酶酶活 (U/mL) 计算公式如下 ： 0050 005

20、1 OD235实验组 235nm 的吸光度值 - 对照组 235nm 的吸光度值 ； 0052 4600 为不饱和聚半乳糖醛酸在 235nm 处的摩尔吸光系数， 单位为 Lmol-1cm-1； 0053 t 为酶促反应时间 ( 在酶反应的线性范围内 )， 单位为 min， 本实验中为 15min ； 0054 b 为比色杯厚度， 单位为 cm， 本实验中为 1cm ； 0055 V0为体系总体积数， 单位为 mL， 本实验中为 5.02mL ； 0056 V1为酶液体积数， 单位为 mL， 本实验中为 0.02mL。 0057 步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为 600U/mL。 说 明

21、书 CN 102586158 A 5 4/4 页 6 0058 实施例 3、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0059 一、 培养基的制备 0060 种子培养基 (pH7.2) ： 取 15g 胰蛋白胨、 8g 酵母提取物和 10g 氯化钠， 用水溶解并 定容至 1L ； 121灭菌 30min。 0061 发酵培养基 (pH7.2) ： 取 15g 胰蛋白胨、 23g 酵母提取物、 10g 氯化钠、 15g 甘油、 17mM 磷酸二氢钾和 75mM 磷酸氢二钾， 用水溶解并定容至 1L ； 121灭菌 30min。 0062 二、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0063 1、 将大肠埃希氏菌 BL21

22、(DE3)PGL04 接种至种子培养基， 37振荡培养 (200r/ min) 至 OD600nm 6， 即为种子液。 0064 2、 将步骤 1 的种子液接种至 20mL 发酵培养基 ( 采用 250mL 摇瓶 )， 得到 OD600nm 0.2 的发酵初始体系 ； 发酵过程如下 ( 共 53 小时 ) ： 先 37振荡培养 (200r/min)5 小时， 然 后加入 IPTG 至终浓度为 100M 继续 30振荡培养 (200r/min)48 小时。 0065 3、 将完成步骤 2 的发酵体系离心 (12000r/min， 5min) 收集上清液。 0066 三、 酶活测定 0067 同实

23、施例 2 的步骤三。 0068 步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为 800U/mL。 0069 实施例 4、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0070 一、 培养基的制备 0071 种子培养基(pH7.1) ： 取13g胰蛋白胨、 7g酵母提取物和7g氯化钠， 用水溶解并定 容至 1L ； 121灭菌 30min。 0072 发酵培养基(pH7.1) ： 取12g胰蛋白胨、 19g酵母提取物、 7g氯化钠、 12g甘油、 14mM 磷酸二氢钾和 70mM 磷酸氢二钾， 用水溶解并定容至 1L ； 121灭菌 30min。 0073 二、 应用工程菌生产碱性果胶酶 0074 1、 将大肠埃希氏菌

24、BL21(DE3)PGL04 接种至种子培养基， 36振荡培养 (150r/ min) 至 OD600nm 4.5， 即为种子液。 0075 2、 将步骤 1 的种子液接种至 30mL 发酵培养基 ( 采用 250mL 摇瓶 )， 得到 OD600nm 0.15 的发酵初始体系 ； 发酵过程如下 ( 共 49 小时 ) ： 先 36振荡培养 (150r/min)4 小时， 然后加入 IPTG 至终浓度为 75M 继续 28振荡培养 (150r/min)45 小时。 0076 3、 将完成步骤 2 的发酵体系离心 (12000r/min， 5min) 收集上清液。 0077 三、 酶活测定 0078 同实施例 2 的步骤三。 0079 步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为 700U/mL。 说 明 书 CN 102586158 A 6