使用热稳定的RNA依赖的RNA聚合酶进行指数式扩增RNA的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102597265 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102597265 A *CN102597265A* (21)申请号 201080046921.1 (22)申请日 2010.10.21 09173697.5 2009.10.21 EP 09175558.7 2009.11.10 EP C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 里博克斯艾克斯有限公司 地址 德国拉德博伊尔迈斯纳大街 191 号 (72)发明人 雅克罗哈耶姆 (74)专利代理机构 上海智信专利代理有限公司 31002 代理人 邓琪 (54) 发明名称 使用热稳定的 RN

2、A 依赖的 RNA 聚合酶进行指 数式扩增 RNA 的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种在体外使用沙波病毒或诺瓦 克病毒的热稳定的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶进行指 数式扩增 RNA 的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.04.18 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/065904 2010.10.21 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/048193 EN 2011.04.28 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 12 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请

3、 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 12 页 附图 5 页 1/2 页 2 1. 一种在体外指数式扩增 RNA 的方法， 包括 ： (a)温育单链RNA和沙波病毒或诺瓦克病毒的RNA依赖的RNA聚合酶， 可选地， 存在RNA 合成的引发寡核苷酸， 其反应条件使得 RNA 依赖的 RNA 聚合酶聚合形成与单链 RNA 互补的 单链， 可选地， 通过延伸与所述单链 RNA 杂交的所述 RNA 合成的引发寡核苷酸以形成双链 RNA ； (b) 在最高 85的温度下温育步骤 (b) 中获得的反应混合物， 使得双链 RNA 的双链被 分开为单链 RNA ； (c) 重复步骤 (a) 和 (b)

4、n 次 ； (d) 执行最终的温育步骤 (a) 以形成最终的双链 RNA ； 以及可选地， (e) 回收最终的双链 RNA ； 其中， n 至少为 3 ； 单链RNA的序列和/或长度选择为使得步骤(b)形成的双链RNA在最高85的温度下 被分开为单链 RNA。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， n 5， 在每第三 - 第五个步骤 (c) 的循环 时， 在步骤 (b) 和步骤 (a) 之间进一步加入 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (b) 的温度为 65 -85。 4. 如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在

5、于， n 为 5-40。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， n 为 20。 6. 如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤 (a) 中的温育温度为 28 -85。 7.如权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述温度为50-75， 优选为60-65。 8.如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述沙波病毒的RNA依赖的RNA 聚合酶是沙波病毒菌株 pJG-Sap01(GenBank Acc.No.AY694184) 的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。 9. 如权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 所述 RNA 依赖的 RNA 聚合酶具有选自由 S

6、EQ ID NO ： 1， SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 组成的组中的氨基酸序列。 10. 如权利要求 1-7 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述诺瓦克病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶为诺瓦克病毒菌株 NuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBank Acc.No.AY741811) 的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。 11. 如权利要求 10 所述的方法， 其特征在于， 所述 RNA 依赖的 RNA 聚合酶具有选自由 SEQ ID NO ： 4， SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 组成的组中的氨基酸序列

7、。 12. 如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述单链 RNA 模板的长度为 15-30 核苷酸， 优选为 21-28 核苷酸， 更优选为 21-23 核苷酸。 13. 如权利要求 1-9 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述单链 RNA 模板的长度超过 30 核苷酸。 14. 如权利要求 11 所述的方法， 其特征在于， 所述单链 RNA 模板为 mRNA。 15. 如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤 (a) 中具有至少一个修饰 的和 / 或标记的核苷酸。 16. 如前述权利要求中任一项所述的方法， 其特征在于， 温育步骤 (a)， 和可选地步骤 权

8、利 要 求 书 CN 102597265 A 2 2/2 页 3 (d) 和 / 或分离步骤 (b) 在微波辐射下进行。 权 利 要 求 书 CN 102597265 A 3 1/8 页 4 使用热稳定的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶进行指数式扩增 RNA 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种在体外使用沙波病毒或诺瓦克病毒的热稳定的RNA依赖的RNA聚 合酶 (RdRp) 进行指数式扩增 RNA 的方法。 背景技术 0002 自从聚合酶链反应 (PCR ； 参考 EP 0 200 326B1) 出现以来， 现代 DNA 扩增技术发 展的一个重要突破是热稳定的 DNA 聚合酶， 例如 T

9、aq 聚合酶 ( 参见 US 4,889,818) 的使用。 0003 与通过 PCR 扩增 DNA 相比， 现有的 RNA 扩增方法具有多个缺陷 ： 使用 T7 聚合 酶进行 mRNA 扩增的方法 (SMARTTM mRNA Amplification Kit User Manual， Clontech Laboratories， Inc.， 28 April 2008 ； US 5,962,271， US 5,962,272) 包括复杂的和耗时的 酶催化步骤 ： 0004 1) 待扩增的 RNA 逆转录形成双链 cDNA 的步骤。这通常需要引物依赖的 RNA 依赖 的 DNA 聚合酶， 例

10、如来自于禽成髓细胞瘤病毒 (AMV) 或鼠科白血病病毒 (MuLV)。2) 所形成 的双链 cDNA 然后被作为模板通过 T7 聚合酶合成 RNA。该 T7 聚合酶是一种引物依赖的 DNA 依赖的 RNA 聚合酶并且需要引物序列内具有 T7 特定的启动子序列以引发聚合反应。 0005 采用 T7 聚合酶进行的 RNA 扩增以线性增长并通常在 37下进行。该 T7 聚合酶的 活性不能承受高于 50的温度。 0006 另一种用于 RNA 扩增的酶是 Q 复制酶 ( 参见 WO 02/092774A2)。Q 复制酶是 一种需要引物的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶， 该引物具有用于引发 RNA 聚合

11、反应的特定序列的 识别位点。这种方法仅实现线性的 RNA 扩增并在 37下进行。该 Q 复制酶的活性不能承 受高于 50的温度。 0007 而且， 使用来自于噬菌体Phi-6到Phi-14的聚合酶扩增RNA(参考WO01/46396A1) 需要具有特定的启动子序列。Phi-6 到 Phi-14 的酶是一种 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。而且在 这种情况下， 利用这些酶仅可以实现线性扩增， 在 37进行。该 Phi-6 到 Phi-14 的酶的活 性不能承受高于 50的温度。 0008 WO 2007/12329A2公开了一种使用杯状病毒科的(RNA依赖的RNA聚合酶)RdRp进 行制备和标记

12、 RNA 的方法。作者成功地在存在或不存在 RNA 合成的引发寡核苷酸 ( 长度少 于 10nt 的寡引物 ) 的情况下从单链 RNA(ssRNA) 模板从头进行 RNA 合成， 同样容易想到具 有重复的 RNA 合成和双链 RNA(dsRNA) 产物变性的循环。但是 WO 2007/12329A2 中并不涉 及 RNA 的指数式扩增， 且反应温度为 20 -40。 发明内容 0009 本发明所解决的技术问题就是通过新型的大规模的酶法合成 RNA 的方法实现指 数式扩增 RNA。该新型的方法使用热稳定的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶， 从而实现从单链 RNA 模 板指数式扩增 RNA。 说

13、明 书 CN 102597265 A 4 2/8 页 5 0010 上述技术问题的解决方案通过权利要求中限定的本发明的实施例来提供。 0011 发明人惊讶地发现 ： 通过使用沙波病毒或诺瓦克病毒RdRp进行指数式扩增RNA是 可行的， 该沙波病毒或诺瓦克病毒 RdRp 在高达 85的温度下是基本稳定和有效的。 0012 因此， 本发明提供一种在体外指数式扩增 RNA 的方法， 其步骤包括 ： 0013 (a) 温育单链 RNA(ssRNA) 和沙波病毒或诺瓦克病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RdRp)， 可选地， 存在 RNA 合成的引发寡核苷酸 ( 寡引物 )， 其反应条件使得 R

14、dRp 聚合 形成与 ssRNA 互补的链， 可选地， 通过延伸与所述 ssRNA 杂交的所述寡引物以形成双链 RNA(dsRNA) ； 0014 (b) 在最高 85， 优选 65 -85的温度下温育步骤 (a) 中获得的反应混合物， 使 得 dsRNA 的双链被分开为 ssRNA ； 0015 (c) 重复步骤 (a) 和 (b)n 次 ； 0016 (d) 执行最终的温育步骤 (a) 以形成最终的 dsRNA ； 以及可选地， 0017 (e) 回收最终的 dsRNA ； 0018 其中 0019 n 至少为 3， 优选为 5-40， 更优选为 20 ； 0020 ssRNA 的序列和

15、/ 或长度被选择为使得形成的 dsRNA 在步骤 (b) 中在最高 85， 优选为 65 -85的温度下被分开为 ssRNA。 0021 在扩增聚腺苷酸RNA(特别是mRNA)时要求具有RNA合成的引发寡核苷酸(寡-或 polyU 引物 )。相应地， 扩增聚鸟苷酸和聚尿苷酸 RNA 分别需要寡 C(oligo C 或 polyC) 和 寡 A( 或 polyA) 引物。聚胞苷酸模板 RNA 合成可以通过寡 G( 或 polyG) 引物引发或者使用 分别比 ATP， UTP 和 CTP 过量 ( 优选地， 2x， 3x， 4x 或 5x 更多 ) 的 GTP 从头开始启动 ( 即不 存在 RNA

16、 合成的引发寡核苷酸 )。 0022 虽然不是必然的， 沙波病毒 RdRp 可能在反复加热的步骤中丧失部分活性， 特别是 温度高于 80时。因此， 如果 n 5， 在步骤 (c) 的每第三到第五个循环时， 可在步骤 (b) 和步骤 (a) 之间进一步加入 RdRp。 0023 优选地， 沙波病毒 RdRp 是沙波病毒菌株 pJG-Sap01(GenBank Acc.No.AY694184) 的 RdRp。 本 发 明 所 使 用 的 诺 瓦 克 病 毒 RdRp 优 选 为 诺 瓦 克 病 毒 菌 株 NuCV/NL/ Dresden174/1997/GE(GenBank Acc.No.AY7

17、41811) 的 RdRp。本发明所使用的沙波病毒或诺 瓦克病毒 RdRp 可以通过现有技术 ( 参见 WO 2007/12329A2) 已知的重组表达的方法进行制 备。在本文中， 应该理解， 所使用的酶具有促进重组表达和 / 或纯化的 “标签” 。一个优选的 标签是组氨酸 - 标签 His-tag， 该标签可位于各重组酶的 C 末端或 N 末端。 0024 优选地， 沙波病毒 RdRp 具有根据 SEQ ID NO ： 1， SEQ ID NO ： 2 或 SEQ ID NO ： 3 的 氨基酸序列。 0025 SEQ ID NO ： 1 ： 0026 MKDEFQWKGLPVVKSGLDV

18、GGMPTGTRYHRSPAWPEEQPGETHAPAPFGAGDKRYTFSQTEMLVNGLKP YTEPTAGVPPQLLSRAVTHVRSYIETIIGTHRSPVLTYHQACELLERTTSCGPFVQGLKGDYWDEEQQQYTGVLANH LEQAWDKANKGIAPRNAYKLALKDELRPIEKNKAGKRRLLWGCDAAT TLIATAAFKAVATRLQVVTPMTPVAVGIN MDSVQMQVMNDSLKGGVLYCLDYSKWDSTQNPAVTAASLAILERFAEPHPIVSCAIEALSSPAEGYVNDIKFVTRGG LPSGMPFTSVVNSIN

19、HMIYVAAAILQAYESHNVPYTGNVFQVETVHTYGDDCMYSVCPATASIFHAVLANLTSYGLK 说 明 书 CN 102597265 A 5 3/8 页 6 PTAADKSDAIKPTNTPVFLKRTFTQTPHGVRALLDITSITRQFYWLKANRTSDPSSPPAFDRQARSAQLENALAYAS QHGPVVFDTVRQIAIKTAQGEGLVLVNTNYDQALATYNAWFIGGTVPDPVGHTEGTHKIVFEME 0027 SEQ ID NO ： 2 ： 0028 MKDEFQWKGLPVVKSGLDVGGMPTGTRYHRSPAWPEE

20、QPGETHAPAPFGAGDKRYTFSQTEMLVNGLKP YTEPTAGVPPQLLSRAVTHVRSYIETIIGTHRSPVLTYHQACELLERTTSCGPFVQGLKGDYWDEEQQQYTGVLANH LEQAWDKANKGIAPRNAYKLALKDELRPIEKNKAGKRRLLWGCDAATTLIATAAFKAVATRLQVVTPMTPVAVGINM DSVQMQVMNDSLKGGVLYCLDYSKWDSTQNPAVTAASLAILERFAEPHPIVSCAIEALSSPAEGYVNDIKFVTRGGL PSGMPFTSVVNSINHMIYVAAAILQAYESHNVP

21、YTGNVFQVETVHTYGDDCMYSVCPATASIFHAVLANLTSYGLKP TAADKSDAIKPTNTPVFLKRTFTQTPHGVRALLDITSITRQFYWLKANRTSDPSSPPAFDRQARSAQLENALAYASQ HGPVVFDTVRQIAIKTAQGEGLVLVNTNYDQALATYNAWFIGGTVPDPVGHTEGTHKIVFEMEHHHHHH 0029 SEQ ID NO ： 3 ： 0030 MKHHHHHHDEFQWKGLPVVKSGLDVGGMPTGTRYHRSPAWPEEQPGETHA 0031 PAPFGAGDKRYTFSQTEMLVNGLKP

22、YTEPTAGVPPQLLSRAVTHVRSYIE 0032 TIIGTHRSPVLTYHQACELLERTT SCGPFVQGLKGDYWDEEQQQYTGVLA 0033 NHLEQAWDKANKGIAPRNAYKLALKDELRPIEKNKAGKRRLLWGCDAATT 0034 LIATAAFKAVATRLQWTPMTPVAVGINMDSVQMQVMNDSLKGGVLYCLD 0035 YSKWDSTQNPAVTAASLAILERFAEPHPIVSCAIEALSSPAEGYVNDIKF 0036 VTRGGLPSGMPFTSVVNSINHMIYVAAAILQAYESHNVPYTGNVF

23、QVETV 0037 HTYGDDCMYSVCPATASIFHAVLANLTSYGLKPTAADKSDAIKPTNTPVF 0038 LKRTFTQTPHGVRALLDITSITRQFYWLKANRTSDPSSPPAFDRQARSAQ 0039 LENALAYASQHGPVVFDTVRQIAIKTAQGEGLVLVNTNYDQALATYNAWF 0040 IGGTVPDPVGHTEGTHKIVFEME 0041 优选地， 诺瓦克病毒 RdRp 具有根据 SEQ ID NO ： 4， SEQ ID NO ： 5 或 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列。 0042 SEQ ID NO ： 4

24、 ： 0043 MGGDSKGTYCGAPILGPGSAPKLSTKTKFWRSSTTPLPPGTYEPAYLGGK 0044 DPRVKGGPSLQQVMRDQLKPFTEPRGKPPKPSVLEAAKKTIINVLEQTID 0045 PPEKWSFTQACASLDKTTSSGHPHHMRKNDCWNGESFTGKLADQASKANL 0046 MFEGGKNMTPVYTGALKDELVKTDKIYGKIKKRLLWGSDLATMIRCARAF 0047 GGLMDELKAHCVTLPIRVGMNMNEDGPIIFERHSRYKYHYDADYSRWDST 0048 QQRAVLAAALEI

25、MVKFSSEPHLAQVVAEDLLSPSVVDVGDFKISINEGLP 0049 SGVPCTSQWNSIAHWLLTLCALSEVTNLSPDIIQANSLFSFYGDDEIVST 0050 DIKLDPEKLTAKLKEYGLKPTRPDKTEGPLVISEDLNGLTFLRRTVTRDP 0051 AGWFGKLEQSSILRQMYWTRGPNHEDPSETMIPHSQRPIQLMSLLGEAAL 0052 HGPAFYSKISKLVIAELKEGGMDFYVPRQEPMFRWMRFSDLSTWEGDRNL 0053 APSFVNEDGVEVDKLAAALE 0054 SEQ ID

26、 NO ： 5 ： 0055 MGGDSKGTYCGAPILGPGSAPKLSTKTKFWRSSTTPLPPGTYEPAYLGGK 0056 DPRVKGGPSLQQVMRDQLKPFTEPRGKPPKPSVLEAAKKTIINVLEQTID 说 明 书 CN 102597265 A 6 4/8 页 7 0057 PPEKWSFTQACASLDKTTSSGHPHHMRKNDCWNGESFTGKLADQASKANL 0058 MFEGGKNMTPVYTGALKDELVKTDKIYGKIKKRLLWGSDLATMIRCARAF 0059 GGLMDELKAHCVTLPIRVGMNMNEDGPIIF

27、ERHSRYKYHYDADYSRWDST 0060 QQRAVLAAALEIMVKFSSEPHLAQVVAEDLLSPSVVDVGDFKISINEGLP 0061 SGVPCTSQWNSIAHWLLTLCALSEVTNLSPDIIQANSLFSFYGDDEIVST 0062 DIKLDPEKLTAKLKEYGLKPTRPDKTEGPLVISEDLNGLTFLRRTVTRDP 0063 AGWFGKLEQSSILRQMYWTRGPNHEDPSETMIPHSQRPIQLMSLLGEAAL 0064 HGPAFYSKISKLVIAELKEGGMDFYVPRQEPMFRWMRFSDLSTWEGDRNL

28、 0065 APSFVNEDGVEVDKLAAALEHHHHHH 0066 SEQ ID NO ： 6 ： 0067 MHHHHHHGGDSKGTYCGAPILGPGSAPKLSTKTKFWRSSTTPLPPGTYEPAYLGG 0068 KDPRVKGGPSLQQVMRDQLKPFTEPRGKPPKPSVLEAAKKTIINVLEQTID 0069 PPEKWSFTQACASLDKTTSSGHPHHMRKNDCWNGESFTGKLADQASKANL 0070 MFEGGKNMTPVYTGALKDELVKTDKIYGKIKKRLLWGSDLATMIRCARAF 0071 GGLMDELKAHC

29、VTLPIRVGMNMNEDGPIIFERHSRYKYHYDADYSRWDST 0072 QQRAVLAAALEIMVKFSSEPHLAQVVAEDLLSPSVVDVGDFKISINEGLP 0073 SGVPCTSQWNSIAHWLLTLCALSEVTNLSPDIIQANSLFSFYGDDEIVST 0074 DIKLDPEKLTAKLKEYGLKPTRPDKTEGPLVISEDLNGLTFLRRTVTRDP 0075 AGWFGKLEQSSILRQMYWTRGPNHEDPSETMIPHSQRPIQLMSLLGEAAL 0076 HGPAFYSKISKLVIAELKEGGMDFYVPRQEP

30、MFRWMRFSDLSTWEGDRNL 0077 APSFVNEDGVEVDKLAAALE 0078 本发明的方法适合于扩增所有种类和长度的 RNA。该方法特别有利于为通过反义 技术或 RNA 干扰的基因沉默应用提供短链 RNA 分子。 0079 因此， 本发明的方法所使用的ssRNA可具有较短的长度， 例如8-45个核苷酸， 优选 为 15-30 个核苷酸， 更优选为 21-28 个核苷酸， 更优选为 21-23 个核苷酸。后者长度的 RNA 分子对于 siRNA 的应用特别适用。如果扩增短链 ssRNA 模板， 本发明的方法可以不使用引 物或用于引发 RNA 合成的短寡核苷酸 ( 寡引物

31、)， 例如 5-10 个核苷酸。 0080 为了从头开始引发 RNA 合成 ( 即不存在引物时 )， 优选模板在其 3末端包括至少 1 个 C 核苷酸， 更优选为 1， 2， 3， 4 或 5 个 C 核苷酸， 特别是 1-3 个 C 核苷酸。 0081 可选地， 本发明的方法还用于提供更长的 RNA 分子， 即 ssRNA 模板具有超过 30 或 45 个核苷酸。本发明方法的一个优选实施例就是使用了 mRNA 模板。 0082 可选地存在的寡引物可以选自 WO 2007/12329A2 公开的引物。因此， 通过使用本 发明的方法， 可以通过选择合适的特定序列的 RNA 合成的引发寡核苷酸来选

32、择 ssRNA 模板 的特定序列。其他的可能包括通过使用 poly(U)RNA 合成的引发寡核苷酸从总细胞 RNA 扩 增总 mRNA。 0083 根据本发明， 术语 “引物” ，“寡引物” 和 “RNA 合成的引发寡核苷酸” 可交替使用并指 代在杂交条件下可以与目标 ssRNA 分子杂交的短的单链 RNA 或 DNA 寡核苷酸， 使得沙波病 毒或诺瓦克病毒 RdRp 可以分别在 RNA 聚合反应条件下延伸所述引物或 RNA- 合成的寡核苷 酸。与其他 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 ( 例如诸如 Q 型的复制酶的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 ) 说 明 书 CN 102597265 A

33、7 5/8 页 8 不同， 本发明的杯状病毒的 RNA 聚合酶不需要具有特定识别序列的引物用于聚合反应以引 发 RNA 合成。因此， 此处的 “引物” ，“寡引物” 和 “RNA 合成的引发寡核苷酸” 是通常不具有 这种识别序列的引物， 特别的， RNA 聚合酶的引物。进一步地， 本发明所使用的杯状病毒 RNA 聚合酶与通常的 DNA 依赖的 RNA 聚合酶 ( 例如 T7RNA 聚合酶 ) 不同， 因为它们不需要在模 板上具有特定的启动子序列。 0084 进一步地， 本发明的方法用于提供修饰的 RNA 分子， 特别是在 siRNA 的应用中。因 此， 步骤(a)中可以如上限定的那样包括至少一

34、个标记的和/或修饰的核苷酸， 例如标记的 和 / 或修饰的 rNTPs 或 NTPs( 例如 2 - 或 3 - 脱氧 - 修饰的核苷酸 )。 0085 本发明方法的化学修饰的RNA产品与未修饰的dsRNA类似物相比优选具有更高的 稳定性。 0086 特别是出于这个目的， 通过 RdRp 活性被引入到互补链中的至少一个被修饰的核 糖核苷三磷酸的化学修饰可以是在核糖， 磷酸和 / 或碱基上的化学修饰。对于具有高稳定 性的分子， 特别是对于 RNA 降解酶， 特别优选为主链 ( 即核糖和 / 或磷酸基 ) 上的修饰。 0087 核糖修饰的核糖核苷三磷酸的优选例子是一种类似物， 其中， 2 -OH

35、被如下基团 取代 ： H， OR， R， 卤素， SH， SR， NH2， NHR， NR2或 CN， 其中 R 为 C1-C6烷基， 烯基或炔基， 卤素为 F， CI， Br 或 I。在本发明中， 术语 “修饰的核糖核苷三磷酸” 或 “修饰的核糖核苷酸” 还包括 2 - 或 3 - 脱氧衍生物， 也被举例称为 “脱氧核苷酸” 。 0088 在 2位具有修饰的核糖的这种核糖核苷酸类似物的例子包括 2 -O- 甲基 - 胞 苷 -5 - 三磷酸， 2 - 氨基 -2 - 脱氧 - 尿苷， 2 - 叠氮基 -2 - 脱氧 - 尿苷 -5 - 三 磷酸， 2 - 氟 -2 - 脱氧 - 鸟苷 -5

36、- 三磷酸和 2 -O- 甲基 -5- 甲基 - 尿苷 -5 - 三 磷酸。为了进一步了解通过使用本发明的方法提供化学修饰的 RNA 的详情可参考国际专利 申请 PCT/EP2009/057119( 公开号为 WO 2009/150156A)。 0089 根据本发明， 不仅可以加热变性产生的 dsRNA 而不需要在每次扩增循环中额外加 入RdRp ： 沙波病毒和诺瓦克病毒RdRp不仅能够承受例如85的高温， 而且这些酶在这么高 温的条件下是有效的。因此， 温育步骤 (a) 可以在例如 28-85的很广的温度范围内进行。 步骤 (a) 中的例如 50-75 ( 例如 60-65 ) 的高温特别有

37、利于扩增具有次级结构的 RNA 模板。 0090 根据本发明的优选实施例， 可以使用微波辐射进行温育步骤 ( 步骤 (a) 和可选的 步骤 (d) 和 / 或分离步骤 (b)。因此， 根据本发明的方法的各步骤中的反应复合物被暴露 于有效的和足够的微波辐射剂量下以达到并维持在此所限定的反应条件。 0091 术语 “微波能量的有效剂量” 是指根据本发明的方法的各个步骤中为了达到和维 持所需的温度所需要的微波能量的剂量。 特定模板的微波能量的具体剂量可以由本领域的 技术人员使用常规的实验并根据特别的所需要的温度决定。对于聚合反应的步骤 ( 步骤 (a) 和可选的 (d)， 为了达到和维持所需的反应温

38、度 ( 例如 28-65 ) 的微波能量可以比 分离步骤 (b) 的温度 ( 例如高达 85 ) 要低。在此使用的术语 “微波能量” “微波辐射” 或 “利用微波辐射” 或者简单的 “微波” 表示相同的含义， 指的是包括波长为约 0.3-30cm 的电 磁波部分， 对应频率为 1-100 千兆赫， 该频率介于无线电和电磁波的红外线区段之间。被有 机体吸收的电磁能的剂量由组织， 细胞和生物分子的介电性能决定。 0092 用于本发明的用途的微波能量的产生并不是关键的， 可以通过现有技术中已知的 说 明 书 CN 102597265 A 8 6/8 页 9 任何方式产生。 例如， 根据本发明的对反应

39、复合物进行微波辐射的合适的工具是微波炉， 该 微波炉可以购自多个供应商并且经常形成多数生物实验室的标准设备的一部分。 该微波炉 通常具有的最大功率为约500W-1000W。 即使是最小的微波炉也可以为本发明提供足够量的 微波辐射， 相应地， 最好在输出功率可调的微波炉上使用最低的功率设定。因此， 根据本发 明公开的方法的优选实施例， 复合物被频率为约 1500MHz-3500MHz， 功率为约 50-1000W 的 微波辐射。 0093 根据本发明的另一个实施例， 低功率设定被用于将所施加的功率从时间上分成更 长的时间间隔， 并最小化局部吸收的能量以防产生分子损伤。 在特别优选的实施例中， 微

40、波 功率通过带有 “休息” 间隔的一系列间隔被施加到样品上， 在该休息间隔并不对样品施加微 波功率。功率施加间隔和休息间隔通常分别在 1-60 秒的范围内， 其中的优选的功率施加间 隔为15-60秒而休息间隔为0.5-5秒。 更优选的， 每隔1-2秒的休息间隔施加功率约45秒。 0094 但是， 特别是根据单链聚核苷酸模板的长度， 辐射步骤可以在 1s-5min( 更优选为 3s-120s)的微波能量的单次应用(间隔)中进行。 后者的短时间段特别有利于长度较短的 模板， 例如用于制备短 dsRNA( 例如 siRNA) 的模板。 附图说明 0095 附图示出了 ： 0096 图 1 示出了在不

41、同温度下通过 RNA 依赖的 RNA 聚合酶在单链模板 RNA 上进行 RNA 合成的产品的非变性 20聚丙烯酰胺凝胶电泳照片。(A) 在 30下反应 2h(120min) 的 RNA 合成的产品。(B) 在 60下反应 2h(120min) 的 RNA 合成的产品。(C) 在 85下反应 2h(120min) 的 RNA 合成的产品。预期的 dsRNA 产品的长度为 24bp。RNA 标记 ： 17bp， 21bp 和 25bp 的 dsRNA。 0097 图2示出了在不同种类和不同量的ssRNA模板上通过沙波病毒RdRp指数扩增RNA 的产品的非变性 20聚丙烯酰胺凝胶电泳照片。扩增反应进

42、行 10 个循环 (30下聚合而 85下变性 )。(A) 在每个反应中使用数量不断减少的模板 A(23nt) 或模板 B(23nt) 分析 扩增反应。(B) 在每个反应中使用数量不断减少的模板 C(25nt) 分析扩增反应。图中示出 了每个反应的 dsRNA 产品的量。 0098 图 3 示出了通过沙波病毒 RdRp 指数扩增单链 RNA 所得到的双链 RNA 产品的离子 交换柱层析的洗脱图。(A)， (B)， (C) 由模板 C(25nt) 生成的 dsRNA 的洗脱图。图中示出了 ssRNA 模板的起始量和 dsRNA 产品的最终量。(D) 是洗脱图 (A)， (B)， (C) 的叠加。

43、具体实施方式 0099 本发明通过下面的非限制性的例子进行阐述。 0100 例 1 ： 沙波病毒和诺瓦克病毒 RdRp 是热稳定的且在 85有效 0101 在任意序列的单链 RNA 模板 (24nt) 上使用下列病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RdRp) 进行 RNA 合成 ： 沙波病毒， 沙波病毒属， 杯状病毒科 ； 诺瓦克病毒， 诺瓦克病毒属， 杯 状病毒科 ； 猫杯状病毒 (FCV)， 水疱疹病毒属， 杯状病毒科 ； 兔出血症病毒 (RHDV)， 兔病毒 属， 杯状病毒科 ； 鼠诺瓦克病毒 (MNV)， 诺瓦克病毒属， 杯状病毒科 ； 脊髓灰质炎病毒， 肠病 毒属， 小核糖核酸

44、病毒科和丙型肝炎病毒， 肝炎病毒属， 黄病毒科。反应混合物包括 1.5g 说 明 书 CN 102597265 A 9 7/8 页 10 模板， 7.5M RdRp， 0.4mM 的 rATP， 0.4mM 的 rCTP， 0.4mM 的 rUTP， 和 2mM rGTP， 10l 反应 缓冲液 (HEPES 250mM， MnCl225mM， DTT 5mM， pH 7.6)， 以及不含有核糖核酸酶 - 脱氧核糖核 酸酶的水(RNAse-DNAse free water)补足至总体积为50l。 反应在30， 60或85下 进行 120min(2h)。产品通过非变性 20聚丙烯酰胺凝胶电泳直观

45、观察 ( 图 1A， 图 1B 和图 1C)。 0102 杯状病毒科的所有 RdRp 在 30均不依赖引物进行 RNA 合成 ( 图 1A)。沙波病毒 和诺瓦克病毒 RdRp 在 60基本保持有效 ( 图 1B)。水疱疹病毒和兔病毒 RdRp 在此温度下 只能获得很微弱的产品带。沙波病毒 RdRp 在 85产生很强的 24bp 的产品带 ( 图 1C)。诺 瓦克病毒 RdRp 在 85同样能够获得产品带。 0103 例 2 ： 通过沙波病毒 RdRp 指数式扩增单链 RNA 0104 在单链 RNA 模板上使用沙波病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RdRp) 进行 RNA 合成。 被称

46、为 A(23nt)， B(23nt) 和 C(25nt) 的三种不同的模板所使用的量各不相同。反应混合物 中含有不同量的各种模板(模板A ： 48ng， 4.8ng， 0.48ng ； 模板B ： 55ng， 5.5ng， 0.55ng ； 模板 C ： 40ng， 4.0ng， 0.40ng)。 7.5M RdRp， 1.2mM的rATP， 1.2mM的rCTP， 1.2mM的rUTP， 和6mM rGTP， 30l 反应缓冲液 (HEPES 250mM， MnCl225mM， DTT 5mM， pH 7.6)， 以及不含有核糖核酸 酶 - 脱氧核糖核酸酶的水 (RNAse-DNAse fr

47、ee water) 补足至总体积为 150l。扩增反应 连续进行 10 个循环， 每个循环包括在 30温育 15min， 然后在 85变性 5min。产品通过非 变性 20聚丙烯酰胺凝胶电泳直观观察 ( 图 2A 和图 2B)。 0105 反应生成的 dsRNA 的量分别在图 2A 和图 2B 中示出。合成的 dsRNA 的量在多功能 酶标仪 (TECAN Infinite 200) 上通过使用 RiboGreen 荧光染料 (Invitrogen 公司 ) 进行 测定。 0106 所得到的产品的结果如下列表 1 所示 ： 0107 表 1 ： 合成的 dsRNA 的量 0108 0109 说

48、 明 书 CN 102597265 A 10 8/8 页 11 0110 考虑到现有技术中的 RNA 扩增方法的缺陷 ( 参见上面的背景技术所述 )， 即使与 PCR 方法相比， 根据本发明的 RNA 扩增反应也是高度有效的 ： 其中， PCR 方法通常在 40 次 循环后生成可接受量的 DNA 产品， 本发明的 RNA 扩增方法仅在 10 个循环后就实现了超过 10000 倍的扩增。 0111 例 3 ： 通过沙波病毒 RdRp 指数式扩增 ssRNA 生成的 dsRNA 产品的色谱分析 0112 利用例 2 中的 ssRNA 模板 C 进行的扩增反应通过 DNAPak PA100(Dion

49、ex 公司 ) 离 子交换柱进行分析。 三个反应得到基本相同的洗脱图(图3A， 3B和3D)， 正如叠加的洗脱图 ( 图 3D) 所示。 说 明 书 CN 102597265 A 11 1/12 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102597265 A 12 2/12 页 13 0003 序 列 表 CN 102597265 A 13 3/12 页 14 0004 序 列 表 CN 102597265 A 14 4/12 页 15 0005 序 列 表 CN 102597265 A 15 5/12 页 16 0006 序 列 表 CN 102597265 A 16 6/12 页 17 0007 序 列 表 CN 102597265 A 17 7/12 页 18 0008 序 列 表 CN 102597265 A 18 8/12 页 19 0009 序 列 表 CN 102597265 A 19 9/12 页 20 0010 序 列 表 CN 102597265 A 20 10/12 页 21 0011 序 列 表 CN 102597265 A 21 11/12 页 22 0012 序 列 表 CN 102597265 A 22 12/12 页 23 序 列 表 CN 10259