甘蓝TT16基因家族及其应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102586274 B (45)授权公告日 2013.04.24 CN 102586274 B *CN102586274B* (21)申请号 201210018474.X (22)申请日 2012.01.19 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路 2 号 (72)发明人 柴友荣 马丽娟 闫楠 雷波 谌利 吕俊 李加纳 马赑 周清元 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 CN 1

2、840710 A,2006.10.04, 全文 . WO 2008/101342 A1,2008.08.28, 全文 . 黄华磊等 . 甘蓝型油菜透明种皮 12（TT12） 基因家族反义抑制植物表达载体的构建 .中国 农学通报 .2007, 第 23 卷 ( 第 5 期 ),43-48. Zhang jiefu et al.Map-based cloning and characterization of a gene controlling hairiness and seed coat color traits in Brassica rapa.Plant Mol Biol .2008,

3、第 69 卷 553-563. (54) 发明名称 甘蓝 TT16 基因家族及其应用 (57) 摘要 本发明公开了甘蓝 TT16 基因家族， 包括 BoTT16-1 基因 ( 全长 cDNA 序列如 SEQ IDNo.8 所 示 )、 BoTT16-2 基因 ( 全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.10 所示 ) 和 BoTT16-3 基因 ( 全长 cDNA 序列 如 SEQ ID No.12 所示 ) 三个成员， 该基因家族可 应用于芸薹属作物种子大小发育和种皮色素积累 等种子性状的分子育种。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李影 权利要求书 1 页 说明书 19

4、 页 序列表 17 页 附图 11 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书19页 序列表17页 附图11页 (10)授权公告号 CN 102586274 B CN 102586274 B *CN102586274B* 1/1 页 2 1.甘蓝TT16基因家族， 其特征在于 ： 包括以下3个成员 ： BoTT16-1基因、 BoTT16-2基因 和 BoTT16-3 基因 ； 所述 BoTT16-1 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.8 所示， BoTT16-2 基 因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示， BoTT16-3

5、基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12 所示。 2.根据权利要求1所述的甘蓝TT16基因家族， 其特征在于 ： 所述BoTT16-1基因的基因 组序列如 SEQ ID No.7 所示， BoTT16-2 基因的基因组序列如 SEQ ID No.9 所示， BoTT16-3 基因的基因组序列如 SEQ ID No.11 所示。 权 利 要 求 书 CN 102586274 B 1/19 页 3 甘蓝 TT16 基因家族及其应用 0001 本申请是申请号为 201010281905.2， 申请日为 2010-09-15， 发明创造名称为 “甘 蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基

6、因家族及其应用” 的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及基因工程技术领域， 特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本 物种白菜 (Brassica rapa) 和甘蓝 (Brassica oleracea)TT16(TRANSPARENT TESTA 16， 透 明种皮 16 ； 又称 ABS， ARABIDOPSIS BSISTER ； 或 AGL32， AGAMOUS-LIKE 32) 基因家族及其应 用。 背景技术 0003 十字花科 (Brassicaceae) 的芸薹属 (Brassica) 包括很多油料作物、 蔬菜和观赏 植物品种， 为人类提供营养价值丰富的

7、食用油、 蔬菜和观赏植物， 并为畜牧业提供饲料， 具 有重要的经济价值。在芸薹属物种中， 异源四倍体物种甘蓝型油菜是由 2 个二倍体物种白 菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物， 在全世界 广泛种植， 栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、 蔬菜和观赏作物。对 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的 遗传进化关系提供理论基础， 并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。 0004 籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、 皮壳 率低、 粗纤维含量低、 含油量高、 饼粕蛋白含量高等优点， 与

8、黑籽品系相比， 饼粕的经济价值 和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型， 但自然界 中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。 已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等 方式而创造， 存在黄籽率和黄籽度不高， 表型不稳定， 易受环境影响而变异， 选育效率低， 育 种周期长， 负相关性状难以克服等缺点， 远远不能满足生产要求。因此， 获得稳定遗传的甘 蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来， 全世界众多研究者对该性 状进行了广泛研究， 但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚， 更没有通过转 基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。 0005 类黄酮物

9、质是广泛存在于植物界的次生代谢物质， 是植物组织中红色、 蓝色和紫 色等花青素苷色素的呈色物质。拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 等植物种皮色素的主 要成分为原花青素 (proanthocyanidin， PA) 单体的聚合物， 其是经公共苯丙烷途径 - 类 黄酮途径 - 原花青素途径合成的。目前的研究表明， 类黄酮生物合成的调控是由转录因 子的协同作用来完成的， 而这些转录因子表达的时空特性受到精密调控。已知 WD40、 MYB、 bHLH、 MADS-box、 WRKY和bZIP转录因子都参与了类黄酮途径的调控， 其中MADS-box(TT16)、 WRKY(TTG2)

10、和bZIP(TT1)转录因子在此途径中的作用还没有彻底明确。 芸薹属和拟南芥同 属十字花科， 具有较近的亲缘关系。拟南芥 TT16(AtTT16) 基因编码 MADS-box 转录因子， 研 究发现其对于 BAN 基因的表达和原花青素在内种皮中的积累是必需的。拟南芥 tt16 突变 体表现为透明种皮即黄籽性状， 且内种皮细胞变得不规则， 推测该基因可能还参与调控内 说 明 书 CN 102586274 B 2/19 页 4 种皮细胞分化和发育， 但具体作用和机制尚不清楚。因此， 在芸薹属中对 TT16 基因进行同 源克隆和功能鉴定， 是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。 0006 芸薹属和拟南

11、芥起源于同一祖先， 约在17001800万年前发生分离， 芸薹族植物 发生了基因组水平的三倍化， 即芸薹属基本种 ： 白菜 (AA 组， 529Mbp)、 甘蓝 (CC 组， 696Mbp) 和黑芥 (BB 组， 632Mbp) 等的基因组约相当于拟南芥基因组 (157Mbp) 的 3 倍， 而甘蓝型油 菜 (AACC 组， 1132Mbp) 的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和， 约相当于拟南芥基因 组的6倍， 也就是说， 在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷 贝， 而在甘蓝型油菜中可能有 6 个拷贝。目前对 TT16 基因的研究报道较少， 而 TT16 基因在 甘

12、蓝型油菜、 白菜、 甘蓝等芸薹属物种中的成员数、 蛋白特征、 进化关系、 表达的组织特异性 及与黄籽性状的关系等都未见报道。 发明内容 0007 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因家族。 0008 为达到上述目的， 本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术， 分别克隆了甘蓝型 油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因家族成员的全长 cDNA 和对应的基因组序列， 并进 行了系统分析。结果显示 ： 0009 所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3个成员 ： BrTT16-1基因、 BrTT16-2基 因和 BrTT16-3 基

13、因 ； 所述 BrTT16-1 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.2 所示， BrTT16-2 基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示， BrTT16-3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6 所示 ； 0010 所述甘蓝TT16(BoTT16)基因家族包括以下3个成员 ： BoTT16-1基因、 BoTT16-2基 因和BoTT16-3基因 ； 所述BoTT16-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示， BoTT16-2基 因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.10 所示， BoTT16-3 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ I

14、DNo.12 所示 ； 0011 所述甘蓝型油菜 TT16(BnTT16) 基因家族包括以下 6 个成员 ： BnTT16-1 基因、 BnTT16-2 基因、 BnTT16-3 基因、 BnTT16-4 基因、 BnTT16-5 基因和 BnTT16-6 基因 ； 所述 BnTT16-1 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.14 所示， BnTT16-2 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ IDNo.16 所示， BnTT16-3 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.18 所示， BnTT16-4 基因 的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.20 所示，

15、 BnTT16-5 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.22 所示， BnTT16-6 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No.24 所示。 0012 进一步， 所述 BrTT16-1 基因的基因组序列如 SEQ ID No.1 所示， BrTT16-2 基因的 基因组序列如 SEQ ID No.3 所示， BrTT16-3 基因的基因组序列如 SEQ ID No.5 所示 ； 0013 所述 BoTT16-1 基因的基因组序列如 SEQ ID No.7 所示， BoTT16-2 基因的基因组 序列如 SEQ ID No.9 所示， BoTT16-3 基因的基因组序列如

16、 SEQ ID No.11 所示 ； 0014 所述 BnTT16-1 基因的基因组序列如 SEQ ID No.13 所示， BnTT16-2 基因的基因组 序列如 SEQ ID No.15 所示， BnTT16-3 基因的基因组序列如 SEQ ID No.17 所示， BnTT16-4 基因的基因组序列如 SEQ ID No.19 所示， BnTT16-5 基因的基因组序列如 SEQ ID No.21 所 示， BnTT16-6 基因的基因组序列如 SEQ ID No.23 所示。 说 明 书 CN 102586274 B 3/19 页 5 0015 上述 3 个物种的 12 条 TT16

17、基因与 AtTT16 基因具有较高的同源性， 基因组序列一 致性为 67.1 70.3， 编码区序列一致性为 82.9 87.0， 编码蛋白的氨基酸序列的一 致性和相似性分别为 73.0 78.2和 78.2 85.7， 核酸水平和氨基酸水平的序列比 对、 系统发生聚类等方面都表明， 它们是 AtTT16 基因的垂直同源基因。这 3 个物种的 12 条 TT16 基因之间也具有很高的同源性， 基因组序列一致性为 69.4 100.0， 编码区序列一 致性为 85.2 100.0， 编码蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分别为 75.1 100和 80.4 100； 其中， 甘蓝型油菜的 BnTT

18、16-1、 BnTT16-4、 BnTT16-6 基因分别来源于白菜的 BrTT16-1、 BrTT16-2、 BrTT16-3 基因， 而甘蓝型油菜的 BnTT16-2、 BnTT16-3、 BnTT16-5 基因 分别来源于甘蓝的 BoTT16-1、 BoTT16-2、 BoTT16-3 基因。BnTT16、 BrTT16、 BoTT16 基因家族 保持了与 AtTT16 基因类似的器官特异性， 主要在生殖器官中表达， 以花和发育中的种子表 达最高， 并随着种子的发育进程而逐渐下降。此外， TT16 基因在甘蓝型油菜和白菜的黑籽 与黄籽材料中的表达存在着较明显的差异， 而在甘蓝的黑籽与黄籽

19、材料中无明显差异， 说 明甘蓝型油菜和白菜的黄籽性状与 TT16 基因表达下调有关， 而甘蓝的黄籽性状与 TT16 基 因几乎没有关系。 0016 基于上述结果， 利用本发明的 BnTT16、 BrTT16、 BoTT16 基因家族中的任一种或多 种基因或基因截短片段， 可以构建TT16基因重组表达载体和转化体， 用于TT16基因的正义 表达、 反义抑制、 RNA 干扰等。 0017 本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因 家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。 0018 进一步， 所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因家族在甘蓝型油菜

20、 黄籽性状的分子育种中的应用。 0019 为达到上述目的， 本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因家 族特异保守保守区段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No.14中第353966位碱基所示)为 RNA干扰片段， 以基于pFGC5941改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架， 将BTT16I 分别以反义和正义方式同时插入 pFGC5941M 的 CaMV35S 启动子和 OCS 终止子之间形成反向 重复序列， 构建了芸薹属 TT16 基因家族 RNA 干扰载体 pFGC5941M-BTT16I， 并通过农杆菌转 化法转化了甘蓝型油菜典型黑籽品种中双 10

21、 号， 所得阳性转基因植株的性状调查发现， 通 过 RNA 干扰沉默 BnTT16 基因家族后， 转基因植株的背景性状正常， 转基因种子明显变小且 种皮色素明显减少， 多数呈黄褐色和黄棕色， 与非转基因种子的典型黑籽形成鲜明对比。 说 明在甘蓝型油菜等植物中， TT16 基因同时调控种子大小发育、 种皮色素积累等性状的形成， 可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种， 尤其是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种， 利 于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料， 也可以超量表达后用于增加种子的大小， 提高种子 千粒重。 0020 本发明的有益效果在于 ： 本发明提供了 TT16 基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白 菜

22、和甘蓝中的成员数、 各成员的全长 cDNA 序列和基因组序列、 编码蛋白特征、 进化关系、 表 达的组织特异性等， 并确认了 TT16 基因家族同时参与种子大小的发育和种皮色素的积累， 由此本发明提供了 TT16 基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分 子育种中的应用， 应用前景好。 说 明 书 CN 102586274 B 4/19 页 6 附图说明 0021 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述， 其中 ： 0022 图 1 为 BnTT16(A)、 BrTT16(B)、 BoTT16(C) 基因家族 5 cDNA 末

23、端的扩增。 0023 图 2 为 BnTT16(A)、 BrTT16(B)、 BoTT16(C) 基因家族 3 cDNA 末端的扩增。 0024 图 3 为 BnTT16(A)、 BrTT16(B)、 BoTT16(C) 基因家族成员全长 cDNA 的扩增， 其 中 1 采用引物组合 FBT16-1+RBT16-2， 2 采用引物组合 FBT16-3+RBT16-4， 3 采用引物组合 FBT16-5+RBT16-6。 0025 图 4 为 BnTT16(A)、 BrTT16(B)、 BoTT16(C) 基因家族成员基因组 DNA 的扩增， 其 中 1 采用引物组合 FBT16-1+RBT16

24、-2， 2 采用引物组合 FBT16-3+RBT16-4， 3 采用引物组合 FBT16-5+RBT16-6。 0026 图 5 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族成员及 AtTT16 基因 mRNA 的序列比对。 0027 图 6 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 家族蛋白及 AtTT16 蛋白的氨基酸序列比对。 0028 图 7 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族成员与 AtTT16 基因 mRNA 的聚类分析。 0029 图 8 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 家族蛋白与 AtTT16 蛋白的聚类分析。 0

25、030 图 9 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族成员的 Southern 杂交鉴定， 其中 M 为地 高辛标记的分子量标准。 0031 图 10 为 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族总体和成员的器官特异性表达检测。 0032 图 11 为白菜、 甘蓝、 甘蓝型油菜的黑籽、 黄籽材料主要生殖器官中 TT16 基因家族 总体和成员的表达。 0033 图 12 为 RNA 干扰片段 BTT16I 的 PCR 扩增。 0034 图 13 为 RNA 干扰载体 pFGC5941M-BTT16I 的结构图。 0035 图 14 为 RNA 干 扰 载 体 p

26、FGC5941M-BTT16I 构 建 中 的 酶 切 和 PCR 鉴 定，其 中 A 为 Swa I+Aat II 双 酶 切 pMD19-T-BTT16I， M 为 DNA marker， CK 代 表 酶 切 前 的 pMD19-T-BTT16I ； B 为 Swa I+AatII 双酶切 pFGC5941M， M 为 DNA marker， CK 代表酶切前的 pFGC5941M ； C 为 pFGC5941M-BTT16IA 的克隆子菌液 PCR 检测 ； D 为 BamH I+Xba I 双酶切 pMD19-T-BTT16I， M 为 DNA marker， CK 代表酶切前的 p

27、MD19-T-BTT16I ； E 为 BamH I+Xba I 双酶切 pFGC5941M-BTT16IA ； M 为 DNA marker， CK 代表酶切前的 pFGC5941M-BTT16IA ； F 为 pFGC5941M-BTT16I 的克隆子菌液 PCR 检测， M 为 DNA marker。 0036 图 15 为再生植株的 Basta 复检鉴定， 其中 CK 为非转基因植株， 1-3 为再生植株。 0037 图 16 为再生植株的 PCR 检测结果， 其中 M 为 DNA marker， CK 为阳性对照， 1 为阴 性对照， 2-15 为再生植株。 0038 图 17 为转

28、基因种子 ( 左 ) 和非转基因种子 ( 右 ) 的比较。 具体实施方式 0039 以下将参照附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆实验指南 ( 第三版， J. 萨姆布鲁克 等著， 黄培堂等译， 科学出版社， 2002 年 ) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0040 优选实施例采用的植物材料 ： 白菜材料均来自于白菜型油菜亚种 (B.rapa ssp. 说 明 书 CN 102586274 B 5/19 页 7 oleifera)， 包括黑籽系 09L597 和黄籽系 09L600 ； 甘蓝材料均来

29、自于羽衣甘蓝变种 (B.oleracea var.acephala)， 包括黑籽系 09L598 和黄籽系 09L599 ； 甘蓝型油菜材料包括 黑籽系 5B 和籽色近等基因系 ( 黑籽系 09L588、 黄籽系 09L587)， 均由重庆市油菜工程技术 研究中心选育和大田常规种植， 并经过了 10 代以上的单花序套袋自交 ； 甘蓝型油菜黑籽品 种中双 10 号由中国农业科学院油菜作物所选育， 种子由重庆市油菜工程技术研究中心提 供。 0041 优选实施例采用的试剂 ： Easy-Taq DNA 聚合酶 5U/l， 附 10PCR Buffer( 含 Mg2+) 购自北京全式金生物技术有限公司

30、 ； LA Taq DNA 聚合酶 5U/l， 附 10LA PCR Buffer II( 含 Mg2+)、 -HindIII DNA marker 等购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； 限制 性内切酶 DraI、 EcoRI、 EcoRV、 HindIII、 尼龙膜、 地高辛标记的 DNA marker 等购自立陶宛 MBI Fermentas 公司 ； pMD19-T 载体购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， MS(Murashige and Skoog medium) 培养基购自荷兰 Duchefa 公司， 结冷胶购自浙江中肯生物科技有限公司， 其 它分子、 生化和植物组织培

31、养试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司和上海稼丰园 艺用品有限公司 ； 改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M是在pFGC5941的基础上改进而 成， 改进之处是采用来自甘蓝型油菜的 BnPAP2 基因第 2 内含子 (BnPAP2I2) 替换 pFGC5941 上过长的 PhChsA 间隔区， 并在间隔区与启动子间增加一个 AatII 切点。 0042 优选实施例采用的试剂盒 ： 小量植物组织 RNA 抽提试剂盒 (W7021) 购自上海华舜 生物工程有限公司， 小量胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自 Omego 公司， pMD19-T 载体连 接试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公

32、司， GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司， PCR DIGProbe Synthesis Kit、 DIG Easy Hyb、 DIG Wash and Block Buffer Set、 DIG Nucleic AcidDetection Kit 均购自德国 Roche 公司， RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司。 0043 一、 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 TT16 基因家族的克隆 0044 1、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝基因组总 DNA 的提取 0045 取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、 白菜09L5

33、97和甘蓝09L598的嫩叶， 采用 十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB) 法提取基因组总 DNA， 采用电泳法和分光光度法评价核酸样 品的质量和浓度。1.0琼脂糖凝胶电泳结果显示， 提取的 3 个物种的基因组总 DNA 完整性 好， 平均分子量均大于 -HindIII DNA Marker 的 23kb 条带， RNA 消化比较完全， 经分光光 度法检测纯度较高， 可以直接用于 PCR 扩增及 Southern 杂交。 0046 2、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝各器官总 RNA 的提取 0047 取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜 5B、 白菜 09L597 和甘蓝 09L598 的蕾 (Bu)、

34、 花(Fl)以及4个发育阶段的种子甘蓝型油菜和甘蓝取开花后15天(15D)、 30天(30D)、 45 天 (45D) 和 55 天 (55D) 的种子 ； 白菜取开花后 10 天 (10D)、 25 天 (25D)、 40 天 (40D) 和 45 天 (45D) 的种子 ； 以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜 09L587 和 09L588、 白菜 09L597 和 09L600、 甘蓝 09L598 和 09L599 的根 (Ro)、 下胚轴 (Hy)、 子叶 (Co)、 茎 (St)、 叶 (Le)、 蕾、 花、 荚果皮 (SP) 以及 4 个发育阶段的种子 ( 甘蓝型油菜和甘蓝取 1

35、5D、 30D、 45D 和 55D 的种 子 ； 白菜取 10D、 25D、 40D 和 45D 的种子 ) 共 12 个器官 ； 采用小量植物总 RNA 抽提试剂盒提 取各器官总 RNA， 采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0琼脂糖凝胶 电泳结果显示， 获得的总 RNA 特征条带清晰， 且无明显 RNA 降解和 DNA 污染， 经分光光度法 说 明 书 CN 102586274 B 6/19 页 8 检测纯度较高， 能够满足 RACE 操作的基本要求。 0048 3、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 RACE 第一链 cDNA 的获得 0049 分别取甘蓝型油菜 5B、 白菜

36、09L597 和甘蓝 09L598 的蕾、 花和 4 个发育阶段的种 子的总 RNA 混合成总量为 5g 的 RNA 样品， 采用 GeneRacer Kit 按其说明书进行一系列的 RACE 操作， 最终反转录获得在 3 端和 5 端同时锚定有人工接头序列的第一链 cDNA， PCR 放大后进行 1.0琼脂糖凝胶电泳检测， 结果显示， 三个物种的第一链 cDNA 呈现出大小在 200bp 10kb 的拖带， 重心区域在 500bp 4kb， 最核心区在 1.5kb 左右， 说明反转录比较 完全， 得到了较高质量的总 cDNA， 可用于克隆甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 TT16 基因家族完整 的

37、cDNA 末端。 0050 4、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 TT16 基因家族 5 cDNA 末端的克隆 0051 根据 AtTT16 基因序列多重比对的结果， 设计了对应于两个最保守点的反向引物 R TT16-50(5 -ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3 ) 和 RBT16RT(5 -gctcgtgtggaggaatgga gg-3 )。分别以白菜、 甘蓝、 甘蓝型油菜第一链 cDNA 为模板， 用 GeneRacer Kit 提供的引物 5 P(5 -cgactggagcacgaggacactga-3 ) 与 RTT16-50 配对， 进行 5 cDNA 末端

38、的 RACE 一 扩。50l 标准 TaqPCR 扩增体系为 ： 10PCR Buffer 5.0l， 25mmol/L 的 MgCl2 3.0l， 10mmol/L 的 dNTPs1.0l， 10mol/L 的正向引物 1.0l， 10mol/L 的反向引物 1.0l， 5U/l 的 Taq 酶 0.5l， 模板 0.5l， 加双蒸水至总体积为 50l。PCR 扩增循环参数为 ： 94预变性 2 分钟 ； 再 94变性 1 分钟， 52退火 1 分钟， 72延伸 1 分钟， 共 30 个循环 ； 最后 72延伸 10 分钟。 0052 以一扩产物为模板， 用 GeneRacer Kit 提供

39、的引物 5 NP(5 -ggacactgacatggactg aaggagta-3 ) 与 RBT16RT 配对， 进行 5 cDNA 末端的 RACE 巢扩， PCR 扩增体系与一扩相同 但模板改为 0.1l， PCR 扩增循环参数为 ： 94预变性 2 分钟 ； 再 94变性 1 分钟， 58退 火 1 分钟， 72延伸 1 分钟， 共 25 个循环 ； 最后 72延伸 10 分钟。PCR 产物进行 1.0琼脂 糖凝胶电泳检测 ( 图 1)， 采用小量胶回收试剂盒回收目标片段， 与 pMD19-T 载体连接， 再转 化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 用含有氨苄青霉素 (Amp)、 IPTG

40、 和 X-gal 的 LB 平板培养至 蓝白斑清晰， 挑取白斑单菌落， 用含有 Amp 的 LB 液体培养基增菌培养后， 取菌液进行 PCR 检 测， 结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性， 各挑选 10 个具有代表性的阳性克隆子委托 上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。测序结果表明 ： BrTT16 基因家族的 5 cDNA 末 端介于 429 681bp 之间， BoTT16 基因家族的 5 cDNA 末端介于 448 658bp 之间， BnTT16 基因家族的 5 cDNA 末端介于 526 649bp 之间。NCBI BLASTn 表明， 这些 5 cDNA 末端与 AtTT16/

41、ABS mRNA(AJ318098) 具有很高的一致性， 表明它们的确为芸薹属 TT16 基因家族的 5 cDNA 末端。 0053 5、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 TT16 基因家族 3 cDNA 末端的克隆 0054 根据 AtTT16 基因序列多重比对的结果， 设计了对应于两个最保守点的正向引物 FTT16-30(5 -tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3 ) 和 FTT16-3N(5 -ctcacatcggtctc atcgtcttctc-3 )。 分别以白菜、 甘蓝、 甘蓝型油菜第一链cDNA为模板， 用GeneRacer Kit提 供的引物 3 P(

42、5 -gctgtcaacgatacgctacgtaacg-3 ) 与 FTT16-30 配对， 进行 3 cDNA 末端 的 RACE 一扩。PCR 扩增体系和扩增循环参数与 5 cDNA 末端的 RACE 一扩相同。 0055 以一扩产物为模板， 用 GeneRacer Kit 提供的引物 3 N 说 明 书 CN 102586274 B 7/19 页 9 P(5 -cgctacgtaacggcatgacagtg-3 ) 与 FTT16-3N 配对， 进行 3 cDNA 末端的 RACE 巢扩， PCR 扩增体系和扩增循环参数与 5 cDNA 末端的 RACE 巢扩相同。PCR 产物如前法所

43、述进行 电泳检测 ( 图 2)、 胶回收、 pMD19-T 载体克隆、 转化大肠杆菌感受态细胞、 阳性克隆子筛选、 菌液 PCR 鉴定和测序。测序结果表明 ： BrTT16 基因家族的 3 cDNA 末端介于 778 853bp 之间， BoTT16 基因家族的 3 cDNA 末端介于 733 936bp 之间， BnTT16 基因家族的 3 cDNA 末端介于 687 820bp 之间 均不包括 poly(A)。NCBI BLASTn 表明， 这些 3 cDNA 末端与 AtTT16/ABS mRNA基因具有很高的一致性， 表明它们的确为芸薹属TT16基因家族的3 cDNA 末端。 0056

44、 6、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 TT16 基因家族成员全长 cDNA 的克隆 0057 根据 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族 5 和 3 cDNA 末端的测序结果， 设计了 3 条 正向引物和3条反向引物(表1)， 得到3对引物组合 ： FBT16-1+RBT16-2、 FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16-6 ； 分别以白菜、 甘蓝、 甘蓝型油菜第一链 cDNA 为模板， 采用上述引物组合 和 50l 标准 Taq PCR 扩增体系， 扩增 BnTT16、 BrTT16、 BoTT16 基因家族各成员的全长 cDNA， PCR 扩增循环参数为

45、 ： 94预变性 2 分钟， 再 94变性 1 分钟、 54 57退火 1 分钟、 72延伸2分钟， 共35个循环， 最后72延伸10分钟 ； 再如前法所述进行电泳检测(图3)、 胶回收、 pMD19-T 载体克隆、 转化大肠杆菌感受态细胞、 阳性克隆子筛选、 菌液 PCR 鉴定和测 序。 0058 表 1 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族成员全长 cDNA 的扩增引物 0059 0060 结果 ： 以白菜第一链总 cDNA 为模板， 引物组合分别为 FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16-6， 各扩增得到 1

46、 条长度分别为 1060bp、 1242bp、 1123bp 的全长 cDNA， 分别命名为 BrTT16-1mRNA、 BrTT16-2mRNA 和 BrTT16-3mRNA。 0061 以 甘 蓝 第 一 链 总 cDNA 为 模 板，引 物 组 合 分 别 为 FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16-6， 各扩增得到 1 条长度分别为 1087bp、 1028bp、 1134bp 的全长 cDNA， 分别命名为 BoTT16-1mRNA、 BoTT16-2mRNA 和 BoTT16-3mRNA。 0062 以甘蓝型油菜第一链总

47、cDNA为模板， 引物组合为FBT16-1+RBT16-2， 扩增得到2条 长度分别为 1060bp 和 1084bp 的全长 cDNA， 分别命名为 BnTT16-1mRNA 和 BnTT16-2mRNA ； 引 物组合为 FBT16-3+RBT16-4， 扩增得到 2 条长度分别为 1214bp 和 1243bp 的全长 cDNA， 分别 命名为 BnTT16-3mRNA 和 BnTT16-4mRNA ； 引物组合为 FBT16-5+RBT16-6， 扩增得到 2 条长度 分别为 1128bp 和 1123bp 的全长 cDNA， 分别命名为 BnTT16-5mRNA 和 BnTT16-6

48、mRNA。 0063 Vector NTI Advance 9.0多重比对表明， 所得的BnTT16、 BrTT16、 BoTT16基因家族 的全长cDNA均有相应的RACE末端克隆子序列与之对应， 说明它们均是可转录表达的基因。 说 明 书 CN 102586274 B 8/19 页 10 多重比对还表明， 3 个物种中 RACE 末端所指示的各独立基因均已获得了对应的全长 cDNA。 0064 7、 甘蓝型油菜、 白菜和甘蓝 TT16 基因家族成员基因组 DNA 的克隆 0065 根 据 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基 因 家 族 成 员 全 长 cDNA 的 序 列 多

49、 重 比 对 结 果， 设 计 检 测 各 成 员 的 特 异 引 物 组 合 ： FBT16-1S+RBT16-12S、 FBT16-2S+RBT16-12S、 FBT16-34S+RBT16-3S、FBT16-34S+RBT16-4S、FBT16-56S+RBT16-5S、 FBT16-56S+RBT16-6S( 表 2) ； 根据 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族 RACE 末端和全长 cDNA 的克隆结果， 分别以白菜 09L597、 甘蓝 09L598、 甘蓝型油菜 5B 的基因组总 DNA 为模板， 采用 上述全长cDNA的扩增引物组合和50l标准Taq PCR扩增体系进行相同PCR， 扩增BnTT16、 BrTT16、 BoTT16基因家族各成员的基因组DNA， 再如前法所述进行电泳检测(图4)、 胶回收、 pMD19-T 载体克隆、 转化大肠杆菌感受态细胞、 阳性克隆子筛选、 菌液 PCR 鉴定和特异引物 鉴定 ( 用上述特异引物组合进行梯度 PCR)， 最后测序。 0066 表 2 检测 BrTT16、 BoTT16、 BnTT16 基因家族成员的特异引物 0067 0068 结果 ： 以白菜基因组总 DNA 为模板， 扩增引物组合为 FBT16-1+RBT16-2， 特异引 物