一种分离培养海马神经细胞的方法及其专用培养液.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410066560.7 (22)申请日 2014.02.21 CGMCC No.4900 2011.05.25 C12N 5/0793(2010.01) (73)专利权人 刘洛贤 地址 325000 浙江省温州市鹿城区新田园四 组团 4 栋 1402 室 (72)发明人 刘洛贤 WO 2009/127566 A1,2009.12.22, CN 102065710 A,2011.05.18, CN 102304482 A,2012.01.04, CN 102533654 B,2014.01.29, (54) 发明名称 一种分离培养海马

2、神经细胞的方法及其专用 培养液 (57) 摘要 本发明属于细胞生物学领域， 涉及一种神经 元分离和培养方法及试剂。本发明的目的在于针 对现有技术存在的问题， 改进当前海马神经元体 外分离和培养的方法， 解决了海马神经元原代培 养的增殖性和活性无法保持的问题。本发明建立 了一套比较成熟的体外培养海马神经元的方法， 本发明得到的神经细胞数量充足， 生长状态较好， 能够从哺乳动物的海马组织中分离出高活性、 高 数量的海马神经细胞， 符合原代海马细胞培养的 要求， 可满足神经科学研究中细胞生物学实验的 需求。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵鹏 (19)中华人

3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 CN 103789268 B 2016.04.27 CN 103789268 B 1.一种海马神经元的分离和原代培养方法包括以下步骤： (1)漂洗： 取离体哺乳动物的海马组织， 置冰浴的漂洗液中， 去除红细胞、 被膜及结缔组 织， 用漂洗液冲洗25次； 所述漂洗液， 经过如下步骤得到： 2g海藻糖、 3g葡萄糖和10mL双抗 溶于100mLD-Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.4MPa大气压下溶入氢气4 6小时， 氢气终浓度达到为0.5mmol/L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用

4、； 所述双抗是 100青霉素-链霉素溶液： 青霉素含量为10000U/mL， 链霉素含量为10mg/mL； 所述D-Hank s 液经过如下步骤得到： NaCl8.0g， KCl0.4g， Na2HPO412H2O0.12g， KH2PO40.06g， NaHCO3 0.35g； 依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀， 加三蒸水定容至1000mL， 调整pH值至 7.27.4， 分装， 高压灭菌， 分装， 4保存备用； (2)消化： 将步骤(1)漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块， 用5倍组织体积的消化液37 作用510分钟， 组织成粥糜状， 用细胞种植液终止消化， 轻轻吹打至组织块1

5、0次以分散 细胞； 所述消化液， 经过如下步骤得： 1.0g胰蛋白酶和0.1gEDTA溶于100mLD-Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.22 m滤膜过滤除菌， 0.4MPa大气压下溶入氢气46小 时， 氢气终浓度达到为0.5mmol/L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用； 所述D-Hank s液， 制备方法同步骤(1)； 所述细胞种植液， 经过如下步骤得到： DMEM/F12培养基加入胎牛血清、 活性发酵滤液和双抗， 使胎牛血清终浓度为10、 活性发酵滤液终浓度为0.2， 双抗终浓 度为1， 用0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用； 所述

6、双抗， 制备方法同步骤(1)； 所述 活性发酵滤液经过如下步骤得到： 长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， 该菌 株已于2011年05月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCCNo.4900； 长双歧杆菌LJM002采用改良MRS培养基培养， 培养基配方为： 以重量计， 取蛋白胨10g， 牛肉膏10g， 酵母膏5g， 葡萄糖20g， 乙酸钠5g， K2HPO42g， MgSO47H2O0.5g， MnSO44H2O0.2g， 低聚果糖3g， 柠檬酸二铵2g， 吐温-801mL， 蒸馏水1L， 加热溶解校正pH值 至6.5，

7、 115高压灭菌15-20分钟； 将长双歧杆菌LJM002接种于冷却至402的步骤 改良MRS培养基中， 菌种接种量为0.20.5， 352厌氧培养24小时， 用分光光度计测定 上述培养液A580nm值为1.2时， 将上述培养液在转数50008500rpm下离心10分钟后， 取上清 液， 0.22 m滤膜过滤除菌， 即得到活性发酵液滤液， 4保存备用； (3)制备细胞悬液： 收集步骤(2)消化后初次细胞悬液， 经200目细胞筛过滤后， 800 1000rpm4离心510分钟， 弃去上清液， 加入细胞种植液， 重悬细胞， 制成510510105 个/mL的单细胞悬液； 所述细胞种植液， 制备方法

8、同步骤(2)； (4)接种、 培养： 将步骤(3)细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中， 置于37、 5CO2恒温培养箱中， 种植后2472小时换成细胞维持液， 之后每隔两天用细胞 维持液换液， 每次更换的量为原体积的1/2； 所述细胞维持液， 经过如下步骤得到： Neurobasal培养基加入B27和谷氨酰胺， 使B27终浓度为2， 谷氨酰胺终浓度1， 用0.22 m 滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103789268 B 2 一种分离培养海马神经细胞的方法及其专用培养液 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 涉及一种海马神经细胞分

9、离与原代培养方法及试剂。 背景技术 0002 海马(hippocampal)是中枢神经系统的重要组成部分， 作为神经元高度集中的区 域， 具有中枢神经系统的典型特性， 在学习、 记忆、 情绪反应及自主神经功能等方面发挥重 要作用。 神经元细胞培养模型是研究神经元发育分化、 神经再生、 神经疾病的发生机制等重 要的实验模型， 体外培养海马神经元已成为研究阿尔茨海默病、 帕金森病等神经退行性疾 病的重要技术手段。 原代培养(primaryculture)是指从活体细胞获得细胞、 组织或器官， 在体外条件下进行的第一次培养。 神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分 组织， 如海马组织、 大

10、脑皮层、 小脑、 下丘脑、 海马、 脊髓和神经丛从机体直接取出， 再接种培 养的方法。 目前国内、 外有关神经元培养的方法较多， 但在原代培养中神经元的纯度和产量 方面还存在一些急待解决的问题。 由于神经元是一种高度分化的细胞， 动物出生后很少分 裂， 相对于其它细胞而言， 神经元在体外更难以存活和生长。 因此， 体外培养神经元要求的 培养方法和营养条件均较为特殊。 0003 目前， 导致难以获得足够数量和活力的原代海马神经元的因素有以下几方面： (1) 海马神经组织分离过程中， 多数人用D-hank s或hank s作为漂洗液， 离体哺乳动物海马组 织中去除红细胞、 被膜及结缔组织等杂质，

11、分离过程时间较长， 有时候需要2小时以上， 在漂 洗液中时间会更长， 海马神经元即已部分死亡， 从而出现假阴性的培养结果。 实验上无法开 展海马神经元的常规培养， 主要可能是因为没有合适的用于海马组织标本的神经元培养用 漂洗液解剖液之故。 在组织分离过程中， 即使冰浴， 神经元依然进行着很大程度代谢， hank s液的无糖环境对神经元分离很不利， 在hank s液中添加DMEM或者高糖来供给大脑的 代谢， 但葡萄糖浓度太高， 易增加细菌污染的机会； 添加DMEM培养液会碱性化， 不利于神经 元细胞存活。 中国专利CN102978162A “一种神经元分离和培养方法及试剂” 、 中国专利 CN1

12、02994452A “一种高效分离和培养神经元的方法” 和中国专利CN102994451A “一种神经元 分离和培养的改进型方法” ， 取脑组织放入盛有1PBS的培养皿中， 所采用清洗液均为PBS 液， DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑， 来供给大脑的代谢， 考虑到 了神经元能量代谢需要， 但未添加任何抗菌物质， 葡萄糖浓度太高， 就容易增加细胞污染的 机会。 (2)采用大剂量胰蛋白酶消化后， 海马神经细胞势必受到相当程度的生比和机械损 害； 细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏， 对于这类具有立体结构用以维持细胞增 殖及自我更新的细胞来说， 很难迅速恢复细胞状

13、态， 往往伴随着大范围的细胞死亡 凋亡， 细胞 “老化” 严重， 细胞活力将明显减弱， 组织中不能获得大量活细胞； (3)细胞种植液对原 代培养海马神经元至关重要， 细胞种植液不同于接下来的细胞维持液， 需要给予神经细胞 特殊的生长因子， 这样才能保证获得足够数量和活力的海马神经元。 发明内容 说明书 1/7 页 3 CN 103789268 B 3 0004 本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足， 本发明提供了一种哺乳动物的海马 神经元体外原代培养的方法， 目的是建立一种简单易行、 高纯度的海马神经元体外原代培 养的方法及试剂， 满足神经科学研究的需求。 0005 本发明提供的技术方案之一

14、为： 0006 本发明的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， 已于2011年05月25日在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其简称为CGMCC(地址： 北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 邮编100101)保藏， 分类命名为长双歧杆菌 (Bifidobacteriumlongum)， 保藏编号为CGMCCNo.4900。 0007 本发明的长双歧杆菌LJM002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。 0008 本发明的长双歧杆菌LJM002菌株具有下述微生物学特征： 0009 (1)菌落形态： 长双歧杆菌LJM002菌株在平板上

15、菌落呈灰白色或乳白色， 不透明、 有光泽、 表面光滑、 凸起、 质地软、 边缘整齐， 直径11.5mm。 0010 (2)个体形态： G+无芽孢杆菌， 杆状。 0011 (3)生理生化特征： D-核糖(+)； L-阿拉伯糖(+)； 乳糖(+)； 纤维二糖(-)； 松三糖 (+)； 棉籽糖(+)； 山梨醇(-)； 淀粉(-)； 葡萄糖酸钠(-)； 木糖(+)； 甘露糖(-)； 果糖(+)； 半乳 糖(+)； 蔗糖(+)； 麦芽糖(+)； 海藻糖(-)； 密二糖(+)； 甘露醇(+)； 菊糖(-)； 水杨素(-)； F6PPK 酶(+)； 对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)； 硝酸盐还原(-)

16、； 触酶(-)； 靛基质反应 (-)。 0012 厌氧下生长良好， 有氧环境中不生长。 最适生长温度3741； 最低生长温度25 28； 最高4345； 生长最适pH6.57.0； 在pH4.55.0或8.08.5不生长。 0013 所述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， CGMCCNo.4900应用于海马 神经元的细胞种植液中。 0014 我们实验过程中意外发现： 长双歧杆菌LJM002菌株的活性发酵滤液既能提供营养 成分， 又可促进神经元生长， 获取神经元的数量可以满足实验的需要。 0015 本发明提供的技术方案之二为： 海马神经元的分离、 原代培养方法

17、， 包括以下步 骤： 0016 1.漂洗： 取离体哺乳动物的海马组织， 置冰浴的漂洗液中， 去除红细胞、 被膜及结 缔组织， 用漂洗液冲洗25次； 0017 2.消化： 将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块， 用5倍组织体积的消化液 37作用510分钟， 组织成粥糜状， 用细胞种植液终止消化， 轻轻吹打至组织块10次以分 散细胞。 0018 3.制备细胞悬液： 收集步骤2消化后初次细胞悬液， 经200目细胞筛过滤后， 800 1000rpm4离心510分钟， 弃去上清液， 加入细胞种植液， 重悬细胞， 制成510510105 个 mL的单细胞悬液； 0019 4.接种、 培养： 将步骤

18、3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶 中， 置于37、 5CO2恒温培养箱中， 种植后2472小时换成细胞维持液， 之后每隔两天用 细胞维持液换液， 每次更换的量为原体积的1 2。 0020 试剂购买： 0021 DMEM F12神经基础培养基、 Neurobasal培养基和B27购于Gibco公司； 多聚赖氨酸、 说明书 2/7 页 4 CN 103789268 B 4 胎牛血清(FBS)、 海藻糖和L-谷氨酰胺购于美国Sigma公司； 青链霉素混合液(双抗)， 购于美 国HyClone公司。 0022 试剂的配置： 0023 (1)所述的D-Hank s液， 经过如下步骤得到

19、： NaC18.0g， KC10 .4g， Na2HPO4 12H2O0.12g， KH2PO40.06g， NaHCO30.35g； 依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀， 加三 蒸水定容至1000mL， 调整pH值至7.27.4， 分装， 高压灭菌， 分装， 4保存备用。 0024 (2)所述的漂洗液， 经过如下步骤得到： 2g海藻糖、 3g葡萄糖和10mL双抗溶于 100mLD-Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.4MPa大气压下溶入氢气46小 时， 氢气终浓度达到为0.5mmol L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用。 0025 (3)所

20、述的消化液， 经过如下步骤得到： 1.0g胰蛋白酶和0.1gEDTA溶于100mLD- Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.22 m滤膜过滤除菌， 0.4MPa大气压下溶 入氢气46小时， 氢气终浓度达到为0.5mmol L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用。 0026 (4)所述的活性发酵滤液， 经过如下步骤得到： 0027 长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， 该菌株已于2011年05月25日保 存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNo.4900； 0028 长双歧杆菌LJM002采

21、用改良MRS培养基培养， 培养基配方为： 以重量计， 取蛋白 胨10g， 牛肉膏10g， 酵母膏5g， 葡萄糖20g， 乙酸钠5g， K2HPO42g， MgSO47H2O0.5g， MnSO4 4H2O0.2g， 低聚果糖3g， 柠檬酸二铵2g， 吐温-801mL， 蒸馏水1L， 加热溶解校正pH值至6.5， 115高压灭菌15-20分钟。 0029 将长双歧杆菌LJM002接种于冷却至402的步骤改良MRS培养基中， 菌种接 种量为0.20.5， 352厌氧培养24小时， 用分光光度计测定上述培养液A580nm值为1.2 时， 将上述培养液在转数50008500rpm下离心10分钟后， 取

22、上清液， 0.22 m滤膜过滤除菌， 即得到活性发酵液滤液， 4保存备用。 0030 (5)所述的多聚赖氨酸， 经过如下步骤得到： 10mg多聚赖氨酸溶于10mL三蒸水中， 混匀， 加三蒸水定容至100mL， 0.22 m微孔滤膜过滤除菌， 分装， 冰冻备用。 0031 (6)所述的细胞种植液， 经过如下步骤得到： DMEM F12培养基加入胎牛血清、 活性 发酵滤液和双抗， 使胎牛血清终浓度为10、 活性发酵滤液终浓度为0.2， 双抗终浓度为 1， 用0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用。 0032 (7)所述的细胞维持液， 经过如下步骤得到： Neurobasal培养基加入B27

23、和谷氨酰 胺， 使B27终浓度为2， 谷氨酰胺终浓度1， 用0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用。 0033 (8)所述的双抗， 为青霉素-链霉素溶液(100)， 青霉素含量为10000U mL， 链霉素 含量为10mg mL。 1双抗： 青霉素含量为100U mL， 链霉素含量为0.1mg mL。 0034 本发明具有以下优点及效果： 0035 1.漂洗步骤中， 海马组织浸润在氢气环境下， 最大化减少组织的分离操作对海马 神经细胞的损伤， 而且， 氢气具有极强的生物学活性， 最大限度保护海马神经细胞不受伤 害， 可提高了原代海马神经细胞的存活率和生物活性。 0036 2.漂洗液含有

24、海藻糖， 替换常规使用的蔗糖， 蔗糖粘度较大， 不利于组织分离操 作。 海藻糖对生物体具有神奇的保护作用， 在细胞表面能形成独特的保护膜， 有效地保护神 经细胞， 维持生命体的生命过程和生物特征， 而自然界中如蔗糖、 葡萄糖等其它糖类， 均不 说明书 3/7 页 5 CN 103789268 B 5 具备这一功能。 0037 3.消化步骤中， 采用了富含氢气的消化液， 使得胰蛋白酶与所消化组织充分接触 和作用， 气体搅拌均匀， 胰蛋白酶消化效率大大提高， 胰蛋白酶使用剂量和经历的时间有所 缩短(从原来的1020分钟缩短到不超过10分钟)， 同时又增加了海马神经元生理呼吸， 氢 气本身又是健康因

25、子， 使海马神经元细胞更多地保持了原有的生物活性。 短时间、 低浓度胰 酶即达到必要的消化效果， 对神经元损伤更小， 也提高了神经元的体外存活率。 0038 总之， 本发明建立了一套比较成熟的原代培养海马神经元的方法， 即在氢气环境 下漂洗和酶消化， 漂洗液含有保护功能的海藻糖， 低浓度、 短时间的酶分离细胞和含活性发 酵滤液的特殊种植培养基； 本发明得到的神经细胞数量充足， 生长状态较好， 能够从哺乳动 物的海马组织中分离出高活性、 高数量的海马神经细胞， 符合海马细胞神经元原代培养的 要求。 具体实施方式 0039 以下结合具体实施例， 实验材料取新生SD大鼠的海马组织， 对本发明进行详细

26、说 明。 0040 实施例1 0041 本发明的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， 已于2011年05月25日在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其简称为CGMCC(地址： 北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 邮编100101)保藏， 分类命名为双歧杆菌 (Bifidobacterium)， 保藏编号为CGMCCNo.4900。 0042 本发明的长双歧杆菌LJM002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。 0043 本发明的长双歧杆菌LJM002菌株具有下述微生物学特征： 0044 (1)菌落形态： 长双歧杆菌LJM002菌

27、株在平板上菌落呈灰白色或乳白色， 不透明、 有光泽、 表面光滑、 凸起、 质地软、 边缘整齐， 直径1-1.5mm。 0045 (2)个体形态： G+无芽孢杆菌， 杆状。 0046 (3)生理生化特征： D-核糖(+)； L-阿拉伯糖(+)； 乳糖(+)； 纤维二糖(-)； 松三糖 (+)； 棉籽糖(+)； 山梨醇(-)； 淀粉(-)； 葡萄糖酸钠(-)； 木糖(+)； 甘露糖(-)； 果糖(+)； 半乳 糖(+)； 蔗糖(+)； 麦芽糖(+)； 海藻糖(-)； 密二糖(+)； 甘露醇(+)； 菊糖(-)； 水杨素(-)； F6PPK 酶(+)； 对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)； 硝酸

28、盐还原(-)； 触酶(-)； 靛基质反应 (-)。 0047 厌氧下生长良好， 有氧环境中不生长。 最适生长温度37-41； 最低生长温度25-28 ； 最高43-45； 生长最适pH6.5-7.0； 在pH4.5-5.0或8.0-8.5不生长。 0048 所述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， CGMCCNo.4900应用于海马 神经元的细胞种植液中。 0049 我们实验过程中意外发现： 长双歧杆菌LJM002菌株的活性发酵滤液既能提供营养 成分， 又可促进神经元生长， 获取神经元的数量可以满足实验的需要。 0050 实施例2 0051 试剂购买： 005

29、2 DMEM F12神经基础培养基、 Neurobasal培养基和B27购于Gibco公司； 多聚赖氨酸、 说明书 4/7 页 6 CN 103789268 B 6 胎牛血清(FBS)、 海藻糖和L-谷氨酰胺购于美国Sigma公司； 青链霉素混合液(双抗)， 购于美 国HyClone公司。 0053 试剂的配置： 0054 (1)所述的D-Hank s液， 经过如下步骤得到： NaC18.0g， KC10 .4g， Na2HPO4 12H2O0.12g， KH2PO40.06g， NaHCO30.35g； 依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀， 加三 蒸水定容至1000mL， 调整pH值

30、至7.27.4， 分装， 高压灭菌， 分装， 4保存备用。 0055 (2)所述的漂洗液， 经过如下步骤得到： 2g海藻糖、 3g葡萄糖和10mL双抗溶于 100mLD-Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.4MPa大气压下溶入氢气46小 时， 氢气终浓度达到为0.5mmol L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用。 0056 (3)所述的消化液， 经过如下步骤得到： 1.0g胰蛋白酶和0.1gEDTA溶于100mLD- Hank s液中， 混匀， 加D-Hank s液定容至1000mL， 0.22 m滤膜过滤除菌， 0.4MPa大气压下溶 入氢气46小时

31、， 氢气终浓度达到为0.5mmol L， 射线消毒灭菌， 分装， 4保存备用。 0057 (4)所述的活性发酵滤液， 经过如下步骤得到： 0058 长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LJM002， 该菌株已于2011年05月25日保 存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNo.4900； 0059 长双歧杆菌LJM002采用改良MRS培养基培养， 培养基配方为： 以重量计， 取蛋白 胨10g， 牛肉膏10g， 酵母膏5g， 葡萄糖20g， 乙酸钠5g， K2HPO42g， MgSO47H2O0.5g， MnSO4 4H2O0.2g， 低聚果糖

32、3g， 柠檬酸二铵2g， 吐温-801mL， 蒸馏水1L， 加热溶解校正pH值至6.5， 115高压灭菌15-20分钟。 0060 将长双歧杆菌LJM002接种于冷却至402的步骤改良MRS培养基中， 菌种接 种量为0.20.5， 352厌氧培养24小时， 用分光光度计测定上述培养液A580nm值为1.2 时， 将上述培养液在转数50008500rpm下离心10分钟后， 取上清液， 0.22 m滤膜过滤除菌， 即得到活性发酵液滤液， 4保存备用。 0061 (5)所述的多聚赖氨酸， 经过如下步骤得到： 10mg多聚赖氨酸溶于10mL三蒸水中， 混匀， 加三蒸水定容至100mL， 0.22 m微

33、孔滤膜过滤除菌， 分装， 冰冻备用。 0062 (6)所述的细胞种植液， 经过如下步骤得到： DMEM F12培养基加入胎牛血清、 活性 发酵滤液和双抗， 使胎牛血清终浓度为10、 活性发酵滤液终浓度为0.2， 双抗终浓度为 1， 用0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用。 0063 (7)所述的细胞维持液， 经过如下步骤得到： Neurobasal培养基加入B27和谷氨酰 胺， 使B27终浓度为2， 谷氨酰胺终浓度1， 用0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， 4保存备用。 0064 (8)所述的双抗， 为青霉素-链霉素溶液(100)， 青霉素含量为10000U mL， 链霉素 含量为1

34、0mg mL。 1双抗： 青霉素含量为100U mL， 链霉素含量为0.1mg/mL。 0065 实施例3 0066 以SD大鼠海马神经元的分离、 原代培养方法包括以下步骤： 0067 以实施例1和实施例2所准备的试剂和配置试剂。 0068 (1)漂洗： 取离体哺乳动物的海马组织， 置冰浴的漂洗液中， 去除红细胞、 被膜及结 缔组织， 用漂洗液冲洗25次； 0069 (2)消化： 将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块， 用5倍组织体积的消化液 37作用510分钟， 组织成粥糜状， 用细胞种植液终止消化， 轻轻吹打至组织块10次以分 说明书 5/7 页 7 CN 103789268 B

35、7 散细胞。 0070 (3)制备细胞悬液： 收集步骤2消化后初次细胞悬液， 经200目细胞筛过滤后， 800 1000rpm4离心510分钟， 弃去上清液， 加入细胞种植液， 重悬细胞， 制成510510105 个 mL的单细胞悬液； 0071 (4)接种、 培养： 将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶 中， 置于37、 5CO2恒温培养箱中， 种植后2472小时换成细胞维持液， 之后每隔两天用 细胞维持液换液， 每次更换的量为原体积的1 2。 0072 (5)镜检判定： 神经细胞种植后12小时后， 倒置显微镜观察， 显示： 大部分细胞贴 壁， 形态呈圆形， 其中少数神经

36、细胞外观为长梭型， 并开始伸出12个突起。 第2天更换细胞 维持液， 培养24小时后， 细胞形态多样， 如梭形、 三角形、 椎体形或不规则形， 伸出突起的神 经细胞逐渐增多长短不一。 培养第72小时， 神经元胞体增大， 饱满； 3天后神经元形状已很典 型： 胞体饱满， 多呈梭形、 锥形， 少数呈多边形， 胞浆丰富， 核大， 核仁隐约可见， 突起明显增 长， 背景中仍然可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫。 0073 在培养第35天， 进行显微镜镜检， 培养细胞出现体积变大、 且大部分细胞出现典 型的神经元形态， 没有杂细胞增殖， 则说明培养成功。 0074 本发明方法建立的海马神经元原代培

37、养细胞可存活59天， 能够满足开展神经元 细胞功能研究的需要。 0075 (6)细胞纯化如果观测到有杂细胞存在， 则进行细胞纯化处理。 如果细胞培养48 72小时， 观察到有杂细胞存在， 每孔加入阿糖胞苷(浓度为210 g mL)1mL， 再加入与阿糖 胞苷溶液等体积的步骤(3)配制的细胞种植液， 使阿糖胞苷终浓度为15 g mL， 2448小 时后， 用步骤(4)配制的细胞维持液完全换液。 0076 实施例4 0077 1.细胞活力试验 0078 表1培养的海马神经元的细胞活力 0079 0080 注： *表示P0.01表示差异极显著。 0081 本发明细胞种植液(含活性发酵滤液)组的细胞活

38、力效果为最好。 0082 2.神经细胞存活率试验 0083 本发明实施例3对神经细胞的存活起明显的促进作用， 培养4天时神经元存活率， 与DMEM F12+20小牛血清组(存活率58)、 NeurobasalMedium+2B27组(存活率62) 说明书 6/7 页 8 CN 103789268 B 8 相比， 本发明实施例3组神经细胞存活率为77， 本发明明显促进神经细胞的存活， 差异极 显著(p0.01)。 0084 结论： 体外原代培养极为 “娇气” 的神经元并不困难， 通过本发明方案培养的海马 神经元较为大量， 存活率高， 形态佳且体外生存力强， 体外培养前三天的神经元的存活率远 高于文献报道的50， 可作为神经科学研究。 说明书 7/7 页 9 CN 103789268 B 9