一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510125457.X (22)申请日 2015.03.23 CCTCC NO: M2015020 2015.01.07 C12N 1/14(2006.01) C12P 7/58(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 廖祥儒 冯圆圆 李韵雅 张永 蔡宇杰 管政兵 樊涛 (54) 发明名称 一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转 化方法 (57) 摘要 本发明提供一株用于转化乳糖废水制备乳糖 酸的密

2、孔菌， 其分类命名为密孔菌 (Pycnoporus sp.)SYBC-L10， 已保藏于中国典型培养物保藏 中心， 地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2015020。 用 密 孔 菌 (Pycnoporus sanguineus)SYBC-L10 微生物作为菌种， 以乳糖 废水为转化底物， 添加氮源、 无机盐及诱导剂组成 发酵培养基， 微生物转化制备乳糖酸。在发酵过 程中通过添加琥珀酸缓冲液， 使得发酵过程中 pH 保持恒定， 提高乳糖废水的转化率， 优化条件下转 化率达到 85以上。对于乳糖酸的研究， 我国在 此方面的研究尚属空白。本发明转化的乳糖废水 中， 根据

3、高效液相色谱法检测其中的乳糖含量为 25左右。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 105400699 A 2016.03.16 CN 105400699 A 1/1 页 2 1.一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法， 其特征在于利用分类命名为密 孔菌(Pycnoporus sp.)SYBC-L10， 保藏编号CCTCC NO ： M 2015020的密孔菌转化乳糖废水 制备乳糖酸， 工艺为 ： (1) 菌种 ： 采用 CCTCC NO ： M 2015020 为出发菌株 ； (2)

4、 菌种保藏 ： 所用菌株在保藏培养基上保藏， 3-6 个月转接一次 ； 保藏培养基 ： PDA 培养基 ； (3) 种子培养 ： 从保藏培养基转入种子培养基需活化 1 次， 每次 30下培养 4d ； (4)微生物转化 ： 将CCTCC NO ： M 2015020菌株添加到发酵培养基中， 利用微生物产的 纤维二糖脱氢酶和漆酶将乳糖转化为乳糖酸 ； 发酵培养基的组分以 g/L 计为 ： 碳源 20-50， 有机氮源 6-10， 无机氮源 4-10， 磷酸二氢 钾 1， 硫酸镁 0.3， 氯化钙 0.08， 七水硫酸锌 0.005， 四水硫酸锰 0.0015， 六水氯化钴 0.0015 七水硫酸

5、铁 0.005 ； 所述的碳源为乳糖废水中乳糖， 所述的氮源为有机氮源黄豆粉， 无机氮源为磷酸氢二 铵 ； 转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为 3 -5 W/V， 种子液以 10的接种量， 接入 添加不同氮源以及无机盐组成的发酵培养基中， 250mL 三角瓶装液量为 50mL ； 在 28-30， 200-220rmp 的条件下培养 7d， 得到含乳糖酸的发酵液 ； (5) 在发酵过程中通过添加琥珀酸缓冲液， 使得发酵过程中 pH4.5-5.0 保持恒定， 以此 提高乳糖废水的转化率。 2.根据权利要求 1 所述一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法， 其特 征 在于转化底物乳糖在发酵培

6、养基中的浓度为 3 -5 W/V， 在 28-30， 200-220rpm 的条件 下培养 7d。 权 利 要 求 书 CN 105400699 A 2 1/3 页 3 一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法 技术领域 0001 本发明涉及乳糖酸的制备方法， 具体涉及一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的 方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 乳糖酸(lactobionic acid)是第三代果酸， 其集延缓衰老、 保湿、 抗氧化和促进机 体更新等多种功效于一身。 是目前最好的果酸代用品。 由于其本身存在于有机体中， 乳糖酸 不存在刺激性问题， 具有优异的抗氧化能力， 可防止细胞和

7、离体器官受到自由基的伤害 ； 乳 糖酸还可避免细胞膜因氧化而受到的破坏， 具有极佳的保水性， 是化妆品中的重要组分。 乳 糖酸是器官移植缓冲液中的重要组分， 和金属螯合后的产物可降低由于离子催化产生的羟 基对组织的损伤。乳糖酸还可增加大环内酯类抗生素的溶解度， 如红霉素的乳糖酸水溶液 的溶解度比红霉素高出 50-100 倍 ； 乳糖酸的钙盐的溶解度较高， 可用来补充钙的吸收， 也 可用来做葡萄糖酸钙的过饱和溶液。 乳糖酸有较强的甜味， 可以降低酸味， 可作为食品的添 加剂使用。乳糖酸因其和水的高亲和性还可作为洗涤剂的组分。在化妆品中加入乳糖酸， 可抗氧化， 抗衰老， 高保湿等功效。乳糖酸的 C

8、AS 登录号 ： 96-82-2。 0003 目前乳糖酸的制备方法有化学催化合成法以及微生物转化法。 微生物转化法又包 括细菌转化法， 真菌转化法。 化学催化合成法有许多不利的因素， 例如产生多种副产物和化 学污染物， 而形成的众多副产物又使分离， 纯化步骤变得复杂化。 微生物转化法具有很大的 优势， 高效， 低成本， 转化率高， 副产物少等优点， 但是有些已报道的产乳糖酸的细菌不是安 全菌株， 难于用于食品等行业的生产。 发明内容 0004 本发明的目的是提供利用真菌将乳糖转化为乳糖酸的方法。 具体内容涉及利用密 孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法。本发明采用的微生物菌种能够将乳糖转化为乳糖

9、酸， 转化率高、 副产物少， 通过发酵取得了显著效果。 0005 本发明的技术方案 ； 一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的菌株， 其分类命名为 密孔菌 (Pycnoporus sp.)， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号 CCTCC NO ： M 2015020。 0006 一种用所述菌株转化乳糖废水制备乳糖酸的方法， 以 CCTCC NO ： M 2015020 为出 发菌株， 以乳糖废水中的乳糖为转化底物， 采用碳源、 氮源及无机盐组成发酵培养基， 转化 制备乳糖酸， 其工艺为 ： 0007 (1) 菌株 ： 采用 CCTCC NO ： M 201502

10、0 为出发菌株 ； 0008 (2) 菌株保藏 ： 所用菌种保藏培养基上保存， 3-6 个月转接一次 ； 保藏培养基 ： PDA 培养基 ； 0009 (3) 种子培养 ： 从保藏培养基转入种子培养基活化 1 次， 30下， 200rmp 摇瓶培养 2d ； 说 明 书 CN 105400699 A 3 2/3 页 4 0010 种子培养基的组分以 g/L 计为 ： 葡萄糖 20， 新鲜土豆 200， 以蒸馏水配制， pH 自然 ； 0011 (4)微生物转化 ： 将CCTCC NO ： M 2015020菌株添加到发酵培养基中， 利用微生物 产的脱氢酶、 漆酶将乳糖废水中的乳糖转化为乳糖酸

11、； 0012 发酵培养基组分以 g/L 计为 ： 碳源 20-50， 有机氮源 6-10， 无机氮源 4-10， 磷酸 二氢钾 1， 硫酸镁 0.3， 氯化钙 0.08， 七水硫酸锌 0.005， 四水硫酸锰 0.0015， 六水氯化钴 0.0015 0013 七水硫酸铁 0.005。 0014 所述碳源为乳糖废水中乳糖， 以 10 v/v 添加， 所述氮源为 ： 黄豆粉和磷酸氢二 铵 ； 0015 (5) 在发酵过程中需要加入弱酸调节 pH， 优选的是琥珀酸缓冲液。通过添加酸类 物质琥珀酸， 使得发酵过程中 pH4.5-4.8 保持恒定， 以此提高乳糖的转化率。 0016 所述真菌转化乳糖废

12、水制备乳糖酸的方法， 转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度 优选为 3 -5， 在 30， 200rmp 的条件下培养 7d。 0017 乳糖酸应理解为乳糖酸及其盐类， 如乳糖酸钙。 0018 检测乳糖酸的方法如下 ： 0019 取发酵液离心， 上清液经微孔滤膜过滤 (0.22m)， 滤液经 HPLC 分析。HPLC 条件 ： 高效液相色谱仪日立 chromaster ； 色谱柱 ： BIO-RAD Aminex HPX-87H(7.8300) ； 流动相 为0.005M H2SO4； 检测器 ： 紫外检测器， 210nm， 柱温 ： 50， 流速 ： 0.4mL/min， 进样量 ： 10L，

13、乳糖酸标样浓度 ： 1。 0020 本发明的有益效果 ： 本发明提供了一种利用真菌转化制备乳糖酸的方法， 表明密 孔菌 (Pycnoporus sp.)SYBC L10 在加入的乳糖废水为 20 v/v( 乳糖废水中乳糖浓度为 25 ) 时培养 7d 转化率能达到 60， 加入的乳糖废水为 40 v/v 时培养 9d， 转化率达到 45。 0021 生物材料样品保藏 ： 密孔菌 (Pycnoporus sp.)SYBC L10 已保藏于中国典型培养 物保藏中心， 地址为中国武汉武汉大学， 简称 CCTCC， 保藏日期 ： 2015 年 1 月 7 号， 保藏编号 CCTCC NO ： M 20

14、15020。 具体实施方式 0022 通过实验， 得到了影响发酵转化乳糖酸产率的主要因素 ： 0023 实施例 1. 培养基配制过程中加入乳糖对乳糖产量的影响 0024 按说明书所述的发酵条件， 培养基中加入乳糖废水， 发酵液中的乳糖的终浓度 为 5。通过对对乳糖产乳糖酸的检测， 发酵 7d( 纤维二糖脱氢酶在第七天达到稳定期 ) 发现乳糖酸的产量仅为 1.3g/L。又通过乳糖添加时间对乳糖酸产量的影响发现， 乳糖对 pycnoporus sp.SYBC L10 发酵产乳糖酸有抑制作用。故应在发酵一定的时间添加乳糖废 水。 0025 实施例 2. 乳糖添加时间对乳糖酸产量的影响 0026 按说

15、明书所述的发酵条件， 通过对pycnoporus sp.SYBC L10在不同发酵时间产乳 糖酸的检测， 因乳糖对密孔菌产纤维二糖脱氢酶有一定的抑制作用， 经检测 CDH 的酶活， 发 现菌体在第 4d 开始产酶， 第 7 天达到稳定期， 所以从第三天开始加入乳糖废水 ( 乳糖含量 说 明 书 CN 105400699 A 4 3/3 页 5 为 25 )， 使发酵液中的乳糖的终浓度为 5， 发酵到第 10 天停止。 0027 表 1、 乳糖添加时间对转化乳糖酸的影响 0028 0029 实施例 3 底物浓度对转化率的影响 0030 起始 pH4.5， 温度 30， 200rmp， 发酵 5

16、天后加入乳糖废水， 发酵液中的乳糖含量 为 5， pycnoporus sp.SYBC L10 培养到第 10 天停止发酵， 乳糖转化为乳糖酸的转化率为 71.6。 0031 起始 pH4.5， 温度 30， 200rmp， 发酵 5 天后加入乳糖废水， 发酵液中的乳糖含量 为10， pycnoporus sp.SYBC L10培养到第10天停止发酵， 乳糖转化为乳糖酸的转化率为 58。 0032 起始 pH4.5， 温度 30， 200rmp， 发酵 5 天后加入乳糖废水， 发酵液中的乳糖含量 为15， pycnoporus sp.SYBC L10培养到第10天停止发酵， 乳糖转化为乳糖酸的转化率为 42。 0033 起始 pH4.5， 温度 30， 200rmp， 发酵 5 天后加入乳糖废水， 发酵液中的乳糖含量 为20， pycnoporus sp.SYBC L10培养到第10天停止发酵， 乳糖转化为乳糖酸的转化率为 30。 0034 表 2 底物浓度对转化率的影响 0035 说 明 书 CN 105400699 A 5