来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201480025823.8 (22)申请日 2014.03.07 61/774982 2013.03.08 US C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (71)申请人 凯克应用生命科学研究生院 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 I.I. 托尔斯托鲁科夫 J.M. 克雷格 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 李志强 李炳爱 (54) 发明名称 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子 (57) 摘要 根据本发明， 描述了用于生产蛋白质的分离 核酸、 表达方法、 宿主

2、细胞、 表达载体和 DNA 构建 体， 以及使用所述表达方法生产的蛋白质。 更特别 地， 描述了从巴斯德毕赤酵母分离的核酸， 其中所 述核酸具有启动子活性。本发明还涉及使用巴斯 德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、 宿主 细胞、 表达载体和 DNA 构建体， 以及使用所述表达 方法生产的蛋白质。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.11.06 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2014/022135 2014.03.07 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2014/138703 EN 2014.09.12 (51)Int.Cl. (19)中华人

3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书20页 序列表8页 附图9页 CN 105358694 A 2016.02.24 CN 105358694 A 1/3 页 2 1. 一种分离核酸， 其中所述分离核酸的序列包含与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列， 其中所述分离核酸包 含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。 2. 权利要求 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 95% 同一性或与其片段具有至少

4、95% 同一性。 3. 权利要求 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 98% 同一性或与其片段具有至少 98% 同一性。 4. 权利要求 1 的分离核酸序列， 其中所述分离核酸的序列为选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列或其片段。 5.权利要求 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸与异源编码序列操作性连接。 6.权利要求 5 的分离核酸， 其中所述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生长 因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。 7.权利要求

5、6 的分离核酸， 其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 8.权利要求 7 的分离核酸， 其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、 淀粉酶、 葡聚糖酶、 蛋白 酶、 纤维素酶和木聚糖酶。 9.权利要求 7 的分离核酸， 其中所述蛋白质为植酸酶。 10.权利要求 7 的分离核酸， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 11.包含权利要求 1 的分离核酸的表达载体。 12.包含权利要求 11 的表达载体的宿主细胞。 13.包含权利要求 1 的分离核酸的宿主细胞。 14.权利要求 12 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。 15.权利要求 14 的宿主细胞， 其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。 16.包

6、含权利要求 1 的分离核酸的 DNA 构建体。 17.生产蛋白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的异源 编码序列操作性连接的权利要求 1 的分离核酸的第一表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述 培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 18.权利要求 17 的方法， 其中所述蛋白质选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生长因子、 细胞因 子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。 19.权利要求 18 的方法， 其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 20.权利要求 19 的方法， 其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、 淀粉酶、 葡聚糖酶、 纤维素 酶、 蛋白酶和木聚糖酶。 21.权

7、利要求 19 的方法， 其中所述蛋白质为植酸酶。 22.权利要求 19 的方法， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 23.权利要求 17 的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒与第二表达盒组合表达。 24. 权利要求 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它 AOX1 或 AOX2 启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码 蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 25.权利要求 24 的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒、 第二表达盒和第三表达盒 表达

8、。 权 利 要 求 书 CN 105358694 A 2 2/3 页 3 26. 权利要求25的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 27. 权利要求23的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 28.根据权利要求 17 的方法生产的分离蛋白

9、质。 29.权利要求 12 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 30.权利要求 29 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。 31.包含权利要求16的DNA构建体的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 32.权利要求 31 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。 33.权利要求 17 的方法， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 34.权利要求 33 的方法， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物种和 假丝酵母属物种。 35. 权利要求 25 的方法， 其中所述

10、第三表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它 AOX1 或 AOX2 启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码 蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 36.生产一种或多种蛋白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养包含第一表达盒、 第 二表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述一个或多个额外表达盒 的每个包含与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接的权利要求 1 的分离核 酸， 其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。 37.权利要求 17

11、 的方法， 其中所述方法进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯 化蛋白质的步骤。 38.权利要求 36 的方法， 其中所述方法进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯 化所述一种或多种蛋白质的一种或多种的步骤。 39. 权利要求1的分离核酸， 其中所述分离核酸由SEQ ID NO. 1-2中的任一个或其片 段组成。 40. 由 SEQ ID NO. 1-2 中的任一个或其片段组成的分离核酸。 41.权利要求 12 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物 种、 酵母属 (Saccharomyces) 物种、 裂殖酵母属物种、 有孢圆酵母属物种、 假丝酵母属物种、 耶氏

12、酵母属物种和克鲁维酵母属物种。 42.权利要求 5 的分离核酸， 其中所述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生 长因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。 43.生产蛋白质或多肽的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质 的异源编码序列操作性连接的权利要求 1 的分离核酸的第一表达盒的宿主细胞的步骤， 其 中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 44. 权利要求 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ 权 利 要 求 书 CN 105358694 A 3 3/3 页 4

13、ID NO:4 的序列或任何其它启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源 编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 45. 权利要求 25 的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 权 利 要 求 书 CN 105358694 A 4 1/20 页 5 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子 0001 与相关申请的交叉引用 本申请要求于

14、2013 年 3 月 8 日提交的美国临时申请序列号 61/774,982 的权益， 该临 时申请通过引用结合到本文中。 0002 公开内容领域 本发明涉及用于生产蛋白质的分离核酸、 表达方法、 宿主细胞、 表达载体和 DNA 构建 体， 并且涉及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地， 本发明涉及从巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)分离的核酸， 其中所述核酸具有启动子活性。 本发明还涉及用于使用巴 斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、 宿主细胞、 表达载体和 DNA 构建体， 并涉及使 用所述表达方法生产的蛋白质。 0003 背景和发明概述 酵母表达系统可用于有效地生产蛋

15、白质， 例如酶、 激素和疫苗蛋白质， 部分上是因为一 些酵母迅速生长至高细胞密度， 在简单和廉价的培养基中生长， 并且为真核生物， 因此可以 以与哺乳动物中天然蛋白质相似的方式修饰蛋白质。 此外， 用合适的信号序列， 表达的蛋白 质可被分泌入培养基中以方便分离和纯化。一些酵母表达系统还为食品和制药工业所接 受， 因为其对于药物和食物产品的生产是安全的， 不像真菌和细菌表达系统， 它们可能在一 些情况下是不安全的， 例如对于人食品制造。 0004 因此， 开发或改善可用于表达高水平蛋白质以增加产率、 减少蛋白质分离和纯化 费用以及降低人和动物健康产品和食物产品的成本的酵母表达系统， 对多种工业例

16、如食品 和动物饲料工业、 人和动物健康工业等是有益的。 0005 已经开发了多种类型的酵母表达系统， 包括使用编码同源或异源蛋白质的核酸在 酵母启动子控制下的诱导性或组成型蛋白质表达。启动子为连接编码蛋白质的核酸的 5 末端的调节元件， 并且可与宿主细胞(例如， 酵母宿主细胞)中的多种调节因子相互作用以 控制 RNA 从 DNA 转录。启动子还可控制 RNA 从 DNA 转录的时机。例如， 在酵母的巴斯德毕 赤酵母中已经鉴定出 AOX1 启动子， 并通常用于酵母表达系统中， 因为其为紧密调节的强启 动子。 0006 由于酵母表达系统对包括人类制药工业以及人食品和动物饲料工业在内的多种 工业的重

17、要性， 酵母表达系统的改善为许多研究和开发的焦点。 因此， 本发明人从巴斯德毕 赤酵母中鉴定了对用于蛋白质在酵母中表达特别有效的启动子。 本文所述启动子可用在例 如用于蛋白质组成型表达的表达系统中。 0007 在本发明一个说明性实施方案中， 提供了一种分离核酸， 其中所述分离核酸的序 列包含例如与选自本文所述的 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90%、 95% 或 98% 同一性， 或与其片段具有至少 90%、 95% 或 98% 同一性的序列， 其中所述分离核酸包含组 成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中， 提供包含这些启动子序列的表达载 体、

18、宿主细胞和 DNA 构建体。 0008 在另一个实施方案中， 提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包 括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的任何上述启动子 说 明 书 CN 105358694 A 5 2/20 页 6 序列的第一表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 在另一个说明性实施方案中， 提供根据该方法生产的分离蛋白质。 0009 下列条款清单中描述的所有实施方案也被考虑为按照本发明使用。 对于下列条款 中所述的所有实施方案， 认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。 0010 1. 一种分离核酸， 其中所述分离

19、核酸的序列包含与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列， 其中所述分离核 酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。 0011 2. 条款 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 95% 同一性， 或与其片段具有至少 95% 同一性。 0012 3. 条款 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 98% 同一性， 或与其片段具有至少 98% 同一性。 0013

20、 4. 条款 1 的分离核酸序列， 其中所述分离核酸的序列为选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列或其片段。 0014 5. 条款 1-4 中任一项的分离核酸， 其中所述分离核酸与异源编码序列操作性连 接。 0015 6. 条款 5 的分离核酸， 其中所述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生 长因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。 0016 7. 条款 6 的分离核酸， 其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 0017 8. 条款 7 的分离核酸， 其中所述蛋白质选自植酸酶、 甘露聚糖酶、 半乳糖苷酶、 淀 粉酶、 葡聚

21、糖酶、 蛋白酶、 纤维素酶和木聚糖酶。 0018 9. 条款 8 的分离核酸， 其中所述蛋白质为植酸酶。 0019 10. 条款 8 的分离核酸， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 0020 11. 包含条款 1-10 中任一项的分离核酸的表达载体。 0021 12. 包含条款 11 的表达载体的宿主细胞。 0022 13. 包含条款 1-10 中任一项的分离核酸的宿主细胞。 0023 14. 条款 12 或 13 中任一项的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为毕赤酵母属 (Pichia) 物种。 0024 15. 条款 14 的宿主细胞， 其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。 0025 16. 包

22、含条款 1-10 中任一项的分离核酸的 DNA 构建体。 0026 17. 生产蛋白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的 异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细胞的步 骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 0027 18. 条款 17 的方法， 其中所述蛋白质选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生长因子、 细胞因 子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。 0028 19. 条款 18 的方法， 其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 0029 20. 条款 19 的方法， 其中所述蛋白质选自植酸酶、 甘露聚糖酶、

23、半乳糖苷酶、 淀粉 酶、 葡聚糖酶、 纤维素酶、 蛋白酶和木聚糖酶。 0030 21. 条款 20 的方法， 其中所述蛋白质为植酸酶。 0031 22. 条款 20 的方法， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 说 明 书 CN 105358694 A 6 3/20 页 7 0032 23. 条款 17-22 中任一项的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒与第二表达盒 组合表达。 0033 24. 条款 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它 AOX1 或 AOX2 启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码 蛋白

24、质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0034 25. 条款 24 的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒、 第二表达盒和第三表达盒 表达。 0035 26. 条款25的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 0036 27. 条款23的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性

25、或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 0037 28. 根据条款 17-27 中任一项的方法生产的分离蛋白质。 0038 29. 条款 12 或 13 中任一项的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 0039 30. 条款 29 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属 (Hansenula) 物种、 毕赤酵母属物种和假丝酵母属 (Candida) 物种。 0040 31. 包含条款 16 的 DNA 构建体的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵 母。 0041 32. 条款 31 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊

26、酵母属物种、 毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。 0042 33. 条款 17-27 中任一项的方法， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 0043 34. 条款 33 的方法， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物种和 假丝酵母属物种。 0044 35. 条款 25 的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它 AOX1 或 AOX2 启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质 的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0045 36. 生产一种或多种蛋

27、白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养包含第一表达 盒、 第二表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述一个或多个额外 表达盒的每个包含与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任 一项的分离核酸， 其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。 0046 37. 条款 17 的方法， 进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的 步骤。 0047 38. 条款 36 的方法， 进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种 或多种蛋白质的一种或多种的步骤。 0048 39. 条款 1-38 中任一项的分离核酸、 宿主细胞、 表达载体、

28、 分离蛋白质、 DNA 构建 体或方法， 其中所述分离核酸由 SEQ ID NO. 1-2 中的任一个或其片段组成。 0049 40. 由 SEQ ID NO. 1-2 中的任一个或其片段组成的分离核酸。 0050 41. 条款12或13的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母 说 明 书 CN 105358694 A 7 4/20 页 8 属物种、 酵母属 (Saccharomyces) 物种、 裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces) 物种、 有孢圆 酵母属 (Torulaspora) 物种、 假丝酵母属物种、 耶氏酵母属 (Yarrowia) 物种和克鲁

29、维酵母 属 (Kluveromyces) 物种。 0051 42. 条款 5 的分离核酸， 其中所述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生 长因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。 0052 43. 生产蛋白质或多肽的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋 白质的异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细 胞的步骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 0053 44. 条款 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的

30、序列或任何其它启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源 编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0054 45. 条款 25 的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0055 附图简述 图 1 显示 Chr1-0469 启动子的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 1)。 0056 图 2 显示 UPP 启动子的核苷酸序列 (S

31、EQ ID NO: 2)。 0057 图 3 显示 AoX1 启动子序列的核苷酸序列 (SEQ ID NO:3)。 0058 图4显示AOX1启动子ATG起始密码子上游1000bp的基因组序列(SEQ ID NO:4)。 0059 图 5 显示在复制板上各种转化体的 GFP 表达水平。 0060 图 6 显示在各种条件下 pUPP、 TEF2、 Chr1-0469、 GAP、 AOX1 和 DAS 启动子的相对启 动子活性。 0061 图7显示报告载体图谱。 使用类似的载体， 其具有和-半乳糖苷酶ORF两者， 以及具有或没有分泌信号 ( 交配因子 )。 0062 图8显示用于通过PCR自巴斯德

32、毕赤酵母基因组DNA分离Chr1-0469启动子(SEQ ID NO: 1)和UPP启动子(SEQ ID NO: 2)的正向引物的核苷酸序列。 将相应的DNA片段 这些 PCR 反应的产物引入具有 - 半乳糖苷酶 ORF 的报告载体中 ( 图 7)。 0063 图 9 ( 子图 A C) 显示来自具有指示的启动子 - 报告构建体的分离转化体的 - 半乳糖苷酶的表达水平。 0064 图 10 显示大肠杆菌 appA2 植酸酶在巴斯德毕赤酵母中的活性。 0065 说明性实施方案的详述 在本发明一个说明性实施方案中， 提供一种分离核酸， 其中所述分离核酸的序列包含 例如与选自本文所述的 SEQ ID

33、 NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90%、 95% 或 98% 同一 性或与其片段具有至少 90%、 95% 或 98% 同一性的序列， 其中所述核酸包含组成型巴斯德毕 赤酵母启动子序列。 在另一个实施方案中， 所述分离核酸的序列为选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列或其片段的序列。在其它实施方案中， 提供包含这些启动子序列的表达载 体、 宿主细胞和 DNA 构建体。 0066 上述启动子已经从目前被归类为巴斯德毕赤酵母酵母菌株的酵母菌株 ( 即， NRRL Y11430) 中分离出。然而， 该分类在某些时候可能更改为Komagataella物种 (

34、 例如， 说 明 书 CN 105358694 A 8 5/20 页 9 Komagataellaphaffii)。 0067 在另一个实施方案中， 提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包 括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的任何上述启动子 序列的第一表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 在另一个说明性实施方案中， 提供根据该方法生产的分离蛋白质。 0068 下列条款清单中描述的所有实施方案均考虑为按照本发明使用。 对于下列条款中 所述的所有实施方案， 认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。下列条款清单 中描述的任

35、何实施方案还考虑为与本申请的发明概述部分或本申请的说明性实施方案的 详述部分所描述的任何实施方案一起使用。 0069 1. 一种分离核酸， 其中所述分离核酸的序列包含与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列， 其中所述分离核 酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。 0070 2. 条款 1 的分离核酸， 其中所述分离核酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 95% 同一性或与其片段具有至少 95% 同一性。 0071 3. 条款 1 的分离核酸， 其中所述分离核

36、酸的序列与选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的序列具有至少 98% 同一性或与其片段具有至少 98% 同一性。 0072 4. 条款 1 的分离核酸序列， 其中所述分离核酸的序列为选自 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 或其片段的序列。 0073 5. 条款 1-4 中任一项的分离核酸， 其中所述分离核酸与异源编码序列操作性连 接。 0074 6. 条款 5 的分离核酸， 其中所述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生 长因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。 0075 7. 条款 6 的分离核酸， 其中

37、所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 0076 8. 条款 7 的分离核酸， 其中所述蛋白质选自植酸酶、 甘露聚糖酶、 半乳糖苷酶、 淀 粉酶、 葡聚糖酶、 蛋白酶、 纤维素酶和木聚糖酶。 0077 9. 条款 8 的分离核酸， 其中所述蛋白质为植酸酶。 0078 10. 条款 8 的分离核酸， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 0079 11. 包含条款 1-10 中任一项的分离核酸的表达载体。 0080 12. 包含条款 11 的表达载体的宿主细胞。 0081 13. 包含条款 1-10 中任一项的分离核酸的宿主细胞。 0082 14. 条款 12 或 13 中任一项的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为

38、毕赤酵母属物种。 0083 15. 条款 14 的宿主细胞， 其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。 0084 16. 包含条款 1-10 中任一项的分离核酸的 DNA 构建体。 0085 17. 生产蛋白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的 异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细胞的步 骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 0086 18. 条款 17 的方法， 其中所述蛋白质选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生长因子、 细胞因 子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。 0087 19. 条款 18 的方

39、法， 其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。 说 明 书 CN 105358694 A 9 6/20 页 10 0088 20. 条款 19 的方法， 其中所述蛋白质选自植酸酶、 甘露聚糖酶、 半乳糖苷酶、 淀粉 酶、 葡聚糖酶、 纤维素酶、 蛋白酶和木聚糖酶。 0089 21. 条款 20 的方法， 其中所述蛋白质为植酸酶。 0090 22. 条款 20 的方法， 其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。 0091 23. 条款 17-22 中任一项的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒与第二表达盒 组合表达。 0092 24. 条款 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID N

40、O:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它 AOX1 或 AOX2 启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码 蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0093 25. 条款 24 的方法， 其中所述蛋白质使用第一表达盒、 第二表达盒和第三表达盒 表达。 0094 26. 条款25的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 0095 27. 条款23的

41、方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 的序列具有至少 90% 同一性或与其片段具有至少 90% 同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。 0096 28. 根据条款 17-27 中任一项的方法生产的分离蛋白质。 0097 29. 条款 12 或 13 中任一项的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 0098 30. 条款 29 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。 0099 31. 包含条款 16 的 DNA 构建体的宿主细胞， 其中所述宿主细胞为甲基营养

42、型酵 母。 0100 32. 条款 31 的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。 0101 33. 条款 17-27 中任一项的方法， 其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。 0102 34. 条款 33 的方法， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母属物种和 假丝酵母属物种。 0103 35. 条款 25 的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异 源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ I

43、D NO:4 具有启动子活性。 0104 36. 生产一种或多种蛋白质的方法， 所述方法包括在培养基中培养包含第一表达 盒、 第二表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤， 其中所述一个或多个额外 表达盒的每个包含与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任 一项的分离核酸， 其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。 0105 37. 条款 17 的方法， 进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的 步骤。 0106 38. 条款 36 的方法， 进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种 或多种蛋白质的一种或多种的步骤。 说 明 书

44、CN 105358694 A 10 7/20 页 11 0107 39. 条款 1-38 中任一项的分离核酸、 宿主细胞、 表达载体、 分离蛋白质、 DNA 构建 体或方法， 其中所述分离核酸由 SEQ ID NO. 1-2 中的任一个或其片段组成。 0108 40. 由 SEQ ID NO. 1-2 中的任一个或其片段组成的分离核酸。 0109 41. 条款12或13的宿主细胞， 其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、 毕赤酵母 属物种、 酵母属物种、 裂殖酵母属物种、 有孢圆酵母属物种、 假丝酵母属物种、 耶氏酵母属物 种和克鲁维酵母属物种。 0110 42. 条款 5 的分离核酸， 其中所

45、述异源编码序列编码选自毒素、 抗体、 激素、 酶、 生 长因子、 细胞因子、 结构蛋白、 免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。 0111 43. 生产蛋白质或多肽的方法， 所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋 白质的异源编码序列操作性连接的条款 1-4 中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细 胞的步骤， 其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 0112 44. 条款 23 的方法， 其中所述第二表达盒包含 ： 与具有包含 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源 编码序列， 其中 SEQ I

46、D NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0113 45. 条款 25 的方法， 其中所述第三表达盒包含 ： 与具有 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的序列或任何其它启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源编码序列， 其中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 具有启动子活性。 0114 短语 “由组成” 意指 SEQ ID NO. 所指定的序列除 SEQ ID NO. 所对应的那些 核苷酸序列外不包含额外的核苷酸序列。 0115 本领域技术人员已知的任何酵母表达系统均可根据本发明使用。例如， 美国专 利 号 6,451,572、 6

47、,841,370、 6,974,690、 7,320,876、 7,078,035、 7,138,260 和 PCT 公 布 号 WO 2007/112739 中描述了多种酵母表达系统， 这些文件均通过引用结合到本文中。在 任何本文所述的实施方案中， 可使用这些酵母表达系统中的任一个。或者， 可使用任何 适合蛋白质表达的酵母物种或酵母表达系统， 包括酵母物种， 例如酵母属物种 ( 例如， 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 克鲁维酵母属物种 ( 例如乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、 有孢圆酵母属物种、 耶氏酵母属物种 ( 例如， 解脂

48、耶氏酵母 (Yarrowia lipolitica)、 裂殖酵母属物种 ( 例如， 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。在另一个实施方案中， 可使用甲基营养型酵母物种， 例如毕赤酵母属物种 ( 例如， 巴斯德毕赤酵母或甲醇毕赤酵母 (Pichia methanolica)、 汉逊酵母属物种 ( 例如， 多形汉 逊酵母(Hansenula polymorpha)、 球拟酵母属(Torulopsis)物种、Komagataella物种、 假 丝酵母属物种 ( 例如， 博伊丁假丝酵母 (Candida boidinii) 和Karwinskia物种。在一个 实施方案

49、中， 蛋白质可在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中表达。甲基营养型酵母能够利 用甲醇作为单一碳源产生维持细胞功能所需的能源。 甲基营养型酵母包含编码用于甲醇利 用的酶的基因， 例如编码醇氧化酶的基因。这些宿主细胞的任一种可为与本文所述启动子 异源的宿主细胞菌株 ( 即， 宿主细胞通常不天然包含本文所述启动子 )。 0116 酵母表达系统可用于胞内生产充足量的蛋白质， 或从酵母细胞分泌以使该蛋白质 可方便地从培养基中分离或纯化。如本文所使用的， 术语 “表达” 意指核酸在宿主细胞中的 转录和 / 或翻译。酵母表达系统可包括但不限于用于表达蛋白质的酵母宿主细胞和表达载 体 ( 例如， DNA 构建体 )。所述表达载体可包含本文所述的启动子， 并且如本领域已知的， 启 说 明 书 CN 105358694 A 11 8/20 页 12 动子与表达载体异源 ( 即， 该组合不天然存在 )。在一个实施方案中， 蛋白质分泌入培养基 受掺入表达载体中的并且能够指导所表达蛋白质分泌出酵母细胞外的信号肽 ( 例如， 酵母 - 因子信号肽、 酵母 KILM1 信号肽、 酵母 PHO1 信号肽或酵母