一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵母为表达载体的酶的生产方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410414251.4 (22)申请日 2014.08.21 C12N 9/08(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 15/81(2006.01) (71)申请人 哈尔滨达济仁科技开发有限公司 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区香滨 路 4 号中北春城三期 60 栋 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵母 为表达载体的酶的生产方法 (57) 摘要 本发明公开了一种采用生物技术利用毕赤酵 母和酿酒酵母为表达载体的酶的生产方法。所述 的步骤是 ： 1

2、. 克隆基因 : 从天然的产木质素过氧 化物酶、 产猛过氧化物酶、 产漆酶的天然菌株中克 隆过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶基因 ； 2. 获 得构建表达载体的启动子， 重组序列， 信号肤， 转 录终止子序列和抗性基因序列 ； 3. 分别构建含这 三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵 母表达载体 ； 4. 通过电转化方法将以上构建的毕 赤酵母表达载体转化毕赤酵母 ； 5. 分别发酵以上 构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重 组混合木质素过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页

3、CN 105400746 A 2016.03.16 CN 105400746 A 1/1 页 2 1. 一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵母为表达载体的酶的生产方法， 其特征在 于 ： 所述的方法包括如下步骤 ： （1） 克隆基因 : 从天然的产木质素过氧化物酶、 产猛过氧化物酶、 产漆酶的天然菌株中 克隆过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶基因 ； （2） 获得构建表达载体的启动子， 重组序列， 信号肤， 转录终止子序列和抗性基因序 列 ； （3） 分别构建含这三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体 , 载体 上的启动子是磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列 , 载体上其它元件还有

4、6418 抗性基因 和氨节青霉素抗性基因序列 , 引导载体重组于毕赤酵母基因组或酿酒酵母基因组的同源 序列 , 大肠杆菌复制起点 ； （4） 通过电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母， 将以上构建的酿 酒酵母表达载体转化酿酒酵母 , 分别筛选高表达木质素过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶 的重组子作为工程菌 ； （5） 分别发酵以上构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素 过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶。 权 利 要 求 书 CN 105400746 A 2 1/2 页 3 一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵母为表达载体的 酶的生产方法 技术领域 0001 本发明

5、涉及一种生物技术方法， 特别涉及一种采用生物技术利用毕赤酵母和 酿酒酵母为表达载体的酶的生产方法， 属于生物技术技术领域。 背景技术 0002 木质素过氧化物酶 (Lignin Peroxidase, LiP), 猛过氧化物酶 (Manganese Peroxidase,MnP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。 植物资源不断再生， 十分丰富。植物的基本成分是纤维素、 半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有 用的成分是纤维素， 次之是半纤维素。前者基本成分是葡萄糖 , 而后者的基本成分是戊糖。 这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、

6、分 子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。它形成纤维支架， 具有强 化木质纤维的作用。纤维素分子之间被木质素镶嵌， 被镶嵌着的纤维素不能被水解。要利 用纤维素， 必须先将木质素水解。 木质素过氧化物酶， 猛过氧化物酶和漆酶具有共同水解木 质素的功能。木质素降解酶不仅应用于植物原料的生产乙醇和生产沼气行业， 还广泛应用 于造纸行业和环境保护等行业。有些天然的微生物具有表达木质素过氧化物酶， 猛过氧化 物酶和漆酶的能力， 目前工业生产上是以天然的产菌株进行发酵生产这三种酶。但是， 由 于天然的产酶菌株的生长缓慢或 ( 和 ) 营养要求高， 使生产成本较高。当前有研究用工程 菌分别

7、生产这三种酶， 由于是分别用一个菌株生产其中的一种酶， 那么生产三种酶则需要 三道工序， 使其生产成本过高。毕赤酵母 (Pichia pastoris) 和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌， 但各具有特征。 毕赤酵母的主要特征是分 泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点， 酿酒酵母具有兼性需氧的特性， 适合于在 厌氧或需氧环境。 发明内容 0003 本发明采用创新性的科学原理， 提出了一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵 母为表达载体的酶的生产方法。 0004 本发明解决其技术问题采用的技术方案是 ： 所述的步骤是 ： （1） 克隆

8、基因 : 从天然的产木质素过氧化物酶、 产猛过氧化物酶、 产漆酶的天然菌株中 克隆过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶基因 ； （2） 获得构建表达载体的启动子， 重组序列， 信号肤， 转录终止子序列和抗性基因序 列 ； （3） 分别构建含这三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体 , 载体 上的启动子是磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列 , 载体上其它元件还有 6418 抗性基因 和氨节青霉素抗性基因序列 , 引导载体重组于毕赤酵母基因组或酿酒酵母基因组的同源 序列 , 大肠杆菌复制起点 ； 说 明 书 CN 105400746 A 3 2/2 页 4 （4） 通过电转化方法将以上构建

9、的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母， 将以上构建的酿 酒酵母表达载体转化酿酒酵母 , 分别筛选高表达木质素过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶 的重组子作为工程菌 ； （5） 分别发酵以上构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧 化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶。 0005 本发明的优点是 : 本发明节省了原材料、 能耗和人力资源， 提高了酶的产量。 具体实施方式 0006 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚明了， 下面通过具体实施例来描述 本发明。但是应该理解， 这些描述只是示例性的， 而并非要限制本发明的范围。此外， 在以 下说明中， 省略了对公知结构和技术的描述， 以避免不

10、必要地混淆本发明的概念。 0007 一种采用生物技术利用毕赤酵母和酿酒酵母为表达载体的酶的生产方法。 0008 本发明解决其技术问题采用的技术方案是 ： 所述的步骤是 ： （1） 克隆基因 : 从天然的产木质素过氧化物酶、 产猛过氧化物酶、 产漆酶的天然菌株中 克隆过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶基因 ； （2） 获得构建表达载体的启动子， 重组序列， 信号肤， 转录终止子序列和抗性基因序 列 ； （3） 分别构建含这三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体 , 载体 上的启动子是磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列 , 载体上其它元件还有 6418 抗性基因 和氨节青霉素抗性基因序列

11、 , 引导载体重组于毕赤酵母基因组或酿酒酵母基因组的同源 序列 , 大肠杆菌复制起点 ； （4） 通过电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母， 将以上构建的酿 酒酵母表达载体转化酿酒酵母 , 分别筛选高表达木质素过氧化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶 的重组子作为工程菌 ； （5） 分别发酵以上构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧 化物酶、 猛过氧化物酶和漆酶。 0009 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的 技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说 明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这 些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内， 本发明要求保护范围由所附的权利要求书 及其等效物界定。 说 明 书 CN 105400746 A 4