低分子量肝素及其用途.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101495517 B (45)授权公告日 2012.10.10 CN 101495517 B *CN101495517B* (21)申请号 200780028096.0 (22)申请日 2007.05.24 60/809,136 2006.05.25 US 60/849,578 2006.10.04 US 60/849,628 2006.10.05 US C08B 37/10(2006.01) A61K 31/727(2006.01) (73)专利权人 莫曼塔医药品有限公司 地址 美国马萨诸塞州 (72)发明人 马利克孙达拉姆 加内什文卡塔拉曼 帕特丽夏奥利弗 姚一

2、鸣 扎伊纳布西拉布海马穆瓦拉 伊恩菲尔 齐意伟 扎卡里施赖弗 伊尚卡皮拉 努尔西贝尔居那伊 达妮埃拉贝卡蒂 刘翠华 科琳娜鲍尔 李颖 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权代理有限 公司 72003 代理人 高龙鑫 吴小瑛 EP 0244236 A2,1987.11.04, WO 2004/033503 A1,2004.04.22, 说明书 1-44 页 . US 2003/0203385 A1,2003.10.30, 说明书 1-35 页 . US 5849721 A,1998.12.15, US 6608042 B2,2003.08.19,说明书1-14栏 第 2 段 . WO 01/02

3、443 A1,2001.01.11, WO 98/55515 A1,1998.12.10, WO 02/08295 A1,2002.01.31, 说明书 1-18 页 . US 6075013 A,2000.06.13, 说明书 1-19 栏 第 3 段 . (54) 发明名称 低分子量肝素及其用途 (57) 摘要 本发明提供了具有改进性质 ( 例如提供临床 优势的性质) 的低分子量肝素(LMWH) 制剂。 本发 明还提供了制备和使用此类制剂的方法， 以及在 此类 LMWH 制剂的生产过程中， 分析起始原料、 加 工、 中间产物和终产物的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶

4、段日 2009.01.23 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2007/069626 2007.05.24 (87)PCT申请的公布数据 WO2007/140231 EN 2007.12.06 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 许喆 权利要求书 3 页 说明书 65 页 附图 17 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 3 页 说明书 65 页 附图 17 页 1/3 页 2 1. 一种低分子量肝素组合物， 其包括 ： 具有以下结构的寡糖链 ： 和具有以下结构的寡糖链 ： 其中， R 是 H 或 SO3Na ； R1是 SO3Na 或

5、COCH3； n 2 50 ； 并且 所述组合物具有以下特征 ： (a)n 的平均值为 9 16， (b) 经测量 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S为 5 15 摩尔。 (c) 重均分子量为 5500 8500Da， (d) 抗 Xa 活性为 120 380IU/mg， (e) 抗 Xa 与抗 IIa 的比值为 2 1 至 1 1， 和 (f) 所述比值 (e) 在 60 分钟时期内变化不超过 1.5。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中所述组合物具有 100 250IU/mg 的抗 IIa 活性。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述组合物的重均分子量为

6、5700 7900Da。 4.如权利要求3所述的组合物， 其中所述组合物中链总数的1535在非还原末端 具有 4， 5 未硫酸酯化糖醛酸。 5. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 60的链在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺。 6. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 80的链在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺。 7. 如权利要求 3 所述的组合物， 其具有少于 1000ng/mg 的肝素酶 ； 少于 1 w/w 的甲 醇 ； 少于 1 w/w 的乙醇 ； 和少于 2000ppm 的游离硫酸盐。 8. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为

7、 170 330IU/mg。 9. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 10. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述组合物中链总数的 15 35在非还 原末端具有 4， 5 未硫酸酯化糖醛酸。 11. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 60的链在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺。 12. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 80的链在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺。 权 利 要 求 书 CN 101495517 B 2 2/3 页 3 13. 如权利要求 10 所述的组合物， 其具有少于

8、 1000ng/mg 的肝素酶 ； 少于 1 w/w 的甲 醇 ； 少于 1 w/w 的乙醇 ； 和少于 2000ppm 的游离硫酸盐。 14. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为 170 330IU/mg。 15. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 16. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 60的链在还原末端具 有 N- 乙酰化己糖胺。 17. 如权利要求 16 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 80的链在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺。 18. 如权利要求 16 所述的组合物，

9、 其具有少于 1000ng/mg 的肝素酶 ； 少于 1 w/w 的甲 醇 ； 少于 1 w/w 的乙醇 ； 和少于 2000ppm 的游离硫酸盐。 19. 如权利要求 16 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为 170 330IU/mg。 20. 如权利要求 16 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 21. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述组合物中至少 80的链在还原末端具 有 N- 乙酰化己糖胺。 22. 如权利要求 21 所述的组合物， 其具有少于 1000ng/mg 的肝素酶 ； 少于 1 w/w 的甲 醇 ； 少于 1 w/w

10、的乙醇 ； 和少于 2000ppm 的游离硫酸盐。 23. 如权利要求 21 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为 170 330IU/mg。 24. 如权利要求 21 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 25. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其具有少于 1000ng/mg 的肝素酶 ； 少于 1 w/w 的甲醇 ； 少于 1 w/w 的乙醇 ； 和少于 2000ppm 的游离硫酸盐。 26. 如权利要求 25 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为 170 330IU/mg。 27. 如权利要求 25 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活

11、性为 130 190IU/mg。 28. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述抗 Xa 活性为 170 330IU/mg。 29. 如权利要求 28 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 30. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述抗 IIa 活性为 130 190IU/mg。 31. 药物组合物， 其含有权利要求 1-30 中任一项所述的组合物和药学上可接受的载 体。 32. 如权利要求 31 所述的药物组合物， 其中所述组合物是冻干的。 33. 如权利要求 31 所述的药物组合物， 其中所述组合物是液体。 34.权利要求1-30中任

12、一项所述的组合物或权利要求31-33中任一项所述的药物组合 物的应用， 其用于制备治疗患血栓性疾病或具有患血栓性疾病风险的受试者的药剂。 35. 如权利要求 34 所述的应用， 其中所述疾病为急性冠状动脉综合征。 36. 如权利要求 34 所述的应用， 其中所述疾病为心肌梗死。 37. 如权利要求 36 所述的应用， 其中所述疾病为 ST 段抬高心肌梗死或非 ST 段抬高心 肌梗死。 38. 如权利要求 34 所述的应用， 其中所述疾病与外科手术的介入相关。 39. 如权利要求 38 所述的应用， 其中所述外科手术的介入选自由血管成形术、 经皮冠 状动脉介入治疗和支架置入组成的组。 40. 如

13、权利要求 38 所述的应用， 其中所述受试者可以是接受了外科手术、 具有接受外 权 利 要 求 书 CN 101495517 B 3 3/3 页 4 科手术的可能或正从外科手术中恢复。 41. 如权利要求 40 所述的应用， 其中所述受试者具有接受冠状动脉旁路移植手术的可 能。 42. 如权利要求 34 所述的应用， 其中所述疾病是稳定型或不稳定型心绞痛。 43. 如权利要求 34 所述的应用， 其中可以使用凝血试验监测所述组合物的活性。 44. 如权利要求 43 所述的应用， 其中所述凝血试验是活化凝血时间或活化部分凝血活 酶时间。 45. 如权利要求 34-44 中任一项所述的应用， 其中

14、可以利用硫酸鱼精蛋白中和所述组 合物的部分或全部抗 Xa 活性或抗 IIa 活性。 46. 如权利要求 45 所述的应用， 其中在冠状动脉旁路移植之前中和所述组合物。 47.如权利要求34所述的应用， 其中权利要求1-30中的任一项所述的组合物或权利要 求 31-33 中的任一项所述的药物组合物被多次浓注， 用于维持所需受试者的目标活化部分 凝血活酶时间。 48. 如权利要求 45 所述的应用， 其中可以在外科手术介入之前、 期间或之后中的一个 或多个时间监测所述组合物的抗 Xa 活性或抗 IIa 活性。 49. 如权利要求 48 所述的应用， 其中所述外科手术介入为冠状动脉旁路移植。 50.

15、 制备权利要求 1-30 中任一项所述的组合物的方法， 其包括 ： (1) 使用极性有机溶剂、 极性非有机溶剂和盐对普通肝素样品进行第一次沉淀以获得 第一上清液 ； (2) 使用极性有机溶剂和极性非有机溶剂对所述第一上清液进行第二次沉淀以获得沉 淀物 ； (3) 将所述沉淀物溶解， 并使用在未硫酸酯化糖醛酸连接位点切割的酶来切割溶解的 沉淀物 ； (4)使用盐和极性有机溶剂沉淀所述经切割的制备物以形成平均链长为814个二糖 的固体 ； (5) 将来自所述固体的物质进行大小筛选以提供平均链长为 9 16 个二糖的制备物， 从而制备所述组合物。 51. 制备权利要求 1-30 中任一项所述的组合物

16、的方法， 其包括 ： 提供平均链长为 8 14 个二糖的前体组合物 ； 和 加工所述前体组合物以获得平均链长为 9 16 个二糖的组合物。 52. 制备权利要求 1-30 中任一项所述的组合物的方法， 其包括 ： (1) 使用极性有机溶剂、 极性非有机溶剂和钠盐对普通肝素样品进行第一次沉淀以获 得第一上清液 ； 和 (2) 使用极性有机溶剂和极性非有机溶剂对所述第一上清液进行第二次沉淀以获得沉 淀物 ； 从而制备组合物。 权 利 要 求 书 CN 101495517 B 4 1/65 页 5 低分子量肝素及其用途 0001 本申请要求于 2006 年 5 月 25 日递交的美国临时申请第 60

17、/809,136 号、 于 2006 年 10 月 4 日递交的美国临时申请第 60/849,578 号和于 2006 年 10 月 5 日递交的美国临时 申请第 60/849,628 号的优先权， 其内容并入本文作为参考。 背景技术 0002 凝血是参与维持哺乳动物正常止血的生理途径。在血管受伤的情况下， 凝血途径 受到激发而形成血液凝块， 阻止血液损失。 血管受伤发生后， 血小板立即开始在受伤部位凝 集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外， 受伤血管通过血管收缩来减少流经此区域的血 流， 而血纤维蛋白则开始凝集形成覆盖破裂区域的不溶性网络或凝块。 0003 当凝血途径倾向于过量凝结的不平衡状

18、态时， 其结果是血栓趋势的形成， 通常表 现为心脏病发作、 中风、 深静脉血栓和急性冠状动脉综合征， 例如心肌梗死和不稳定型心绞 痛。 此外， 血栓可以引发栓塞， 并造成肺栓塞或包括中风或短暂性缺血发作在内的脑血管栓 塞。目前与凝血途径中的不平衡相关的病变的治疗方法存在很多风险， 必须进行谨慎的控 制。 0004 肝素和低分子量肝素 (LMWH)、 复合物、 从内源分离的硫酸酯化多糖是止血的强效 调节剂。 广泛用作临床抗凝血剂的肝素是由肥大细胞产生的高度硫酸酯化的肝素样葡胺聚 糖(HLGAG)， 并且是最初的生物聚合物药物之一和少数的糖类药物之一。 肝素及其衍生的分 子是用于多种临床表现的强效

19、抗凝血剂， 特别是用于血栓栓塞性疾病， 包括预防和治疗深 静脉血栓和肺栓塞、 动脉血栓形成和急性冠状动脉综合征 ( 例如心肌梗死和不稳定型心绞 痛 )。肝素和 LMWH 与凝血级联中的多个组分发生相互作用以抑制血液凝结过程。肝素主要 通过两个机制发挥其作用， 这两个机制均涉及抗凝血酶 III(AT-III) 与所述聚合物中包含 的特异性五糖序列 HNAC/S， 6SGHNS， 3S， 6SI2SHNS， 6S的结合。首先， AT-III 与五糖结合引发蛋白质构 象变化， 介导所述蛋白质对 Xa 因子的抑 制。第二步， 凝血酶 (IIa 因子 ) 也在紧接五糖 / AT-III 结合位点的位置与

20、肝素结合。AT-III、 凝血酶和肝素间三元复合物的形成导致凝血 酶的失活。与肝素的抗 Xa 活性仅需要 AT-III 五糖结合位点不同， 肝素的抗 IIa 活性在需 要负责抗 Xa 活性的五糖单元以有效形成 AT-III、 凝血酶和肝素间三元复合物之外， 还具有 位点依赖性。肝素还介导内皮细胞释放组织因子途径抑制物 (TFPI)。肝素辅助因子 TFPI 是直接结合并抑制 X 因子的丝氨酸蛋白酶。TFPI 是一种强效抗血栓形成剂， 特别是在与肝 素共同施用的情况下。 0005 尽管肝素对于多种临床表现都非常有效， 并具有用于多个其它方面的潜力， 但 肝素疗法与多种不同副作用相关。在过去 65

21、年中， 抗凝血是普通肝素 (unfractionated heparin， UFH) 的主要临床应用。由于其不稳定的静脉内药物动力学并缺乏皮下生物利用 度， 现已将UFH以静脉注射施用。 此外， UFH作为抗凝血剂的应用也受到多种副作用的妨碍， 这些副作用与结合到 UFH 的非特异性血浆蛋白相关。 0006 这导致人们对低分子量肝素 (LMWH) 的产生和利用进行研发以使其作为 UFH 有效 替代物。LMWH 提供了更可预见的药理学活性， 降低的副作用和比 UFH 更高的生物利用度。 说 明 书 CN 101495517 B 5 2/65 页 6 由于商购 LMWH 制剂未经鱼精蛋白完全中和，

22、 可能发生具有严重不良作用的意外反应。使用 2mg 鱼精蛋白 /100IU 抗 Xa 活性的 LMWH 仅能将依诺肝素 (enoxaparin) 和其它 LMWH 的 抗 Xa 活性中和至约 40的程度。使用 2mg 鱼精蛋白 /100IU 抗 Xa 活性的 LMWH 仅能将 抗 IIa 活性中和至约 60的程度。( 另一方面， 使用 2mg 硫酸鱼精蛋白 /100IU 抗 Xa 活 性的 UFH 可几乎完全中和 ( 90 )UFH 的抗 Xa 和抗 IIa 活性 )。 0007 这些通常从猪肠粘膜分离的多糖药物制剂在长度和组成方面各不相同。因此， 仅 有一部分的制剂具有抗凝血活性。在最好的情

23、况下， 肝素或 LMWH 的药物制剂中的大部分多 糖链失活， 在最差的情况下， 这些链非特异性地与血浆蛋白质相互作用从而产生与肝素疗 法相关的副作用。因此， 开发保留了 UFH 的抗凝血活性和其它所需活性， 但具有较少副作用 的新型LMWH非常重要。 主要由于其链较短和分散性较低， LMWH显示出显著减少的非特异性 血浆蛋白结合性。然而， 目前临床使用的所有 LMWH 同样具有低于 UFH 的抗 IIa 活性。因为 这一活性的降低， 需要较大剂量 ( 与 UFH 相比 ) 的 LMWH 以达到类似的抗 Xa 和抗 IIa 活性， 并且用于检测 UFH 活性、 活化部分凝血活 酶时间 (aPTT

24、) 或活化凝血时间 (ACT) 的标准试 验也不能使用， 因为这些试验主要依赖于抗 IIa 活性以获得读数。最广泛用于监测 LMWH 水 平的试验是抗Xa活性试验， 其依赖于具有足够抗凝血酶III(ATIII)的样品， 而实际情况不 总是如此。此试验非常昂贵 ( 远超过 $100.00)， 而且因为通常必须将样品送到外面的实验 室进行分析， 此试验并不是常规试验或易于实施。因此， 迄今为止 LMWH 的用途仍主要限制 于血栓形成的预防而非治疗， 而且可施用 LMWH 的患者群也受到限制 ： 小儿科患者， 经 RFI、 尿素、 肌氨酸、 磷、 肾小球滤过率 (GFR) 或血液和尿液 BUN( 血

25、尿素氮水平 ) 检测患有肾功能 异常的患者以及介入性心脏病患者群均被排除在外。 发明内容 0008 本发明部分地基于对具有改进性质的 LMWH 制剂的开发， 例如经设计而具有改进 性质 ( 例如， 提供临床优势的性质 )。此类功能性质包括， 例如应答硫酸鱼精蛋白的可逆 性、 可预期的或改进的药物动力学性质、 与例如依诺肝素相比改进的抗IIa活性 ； 在约30 180 分钟的期间内抗 Xa 活性与抗 IIa 活性比值的相对恒定 ； 可检测的活性水平 ； 皮下生物 利用度 ； 导致肝素诱导的血小板减少症 (HIT) 的可能性下降。本文公开的 LMWH 还具有可将 其与其它商购 LMWH 区分开的结

26、构特征。例如， 本文提供的 LMWH 制剂可具有一种或多种以 下性质 ： 基本上不能测得到的连接区域、 与可商购的LMWH制剂相比增加的3-O硫酸酯数量、 一些链在非还原末端具有未硫酸酯化的 U、 一些链 ( 例如大部分链或基本上所有的链 ) 在还原末端具有 N- 乙酰化己糖胺、 UHNAC， 6SGHNS， 3S， 6S与 U2SHNS， 6SIHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S的比值为 约 1 1 至 1 4( 例如， 约 1 2、 2 1、 3 1、 4 1) 以及基本未经修饰的还原末端结 构。本发明包括具有以上的一种或多种性质和特征的 LMWH 制剂， 以及制备和使用此类制剂 的

27、方法。本发明还公开了在生产此类 LMWH 制剂过程中， 分析起始原料、 加工、 中间体和终产 物的方法。 0009 因此， 本发明的第一个方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0010 重均分子量为约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da， 约 5500 8000Da， 约 5700 7900Da， 约 5800 6800Da ； 和 0011 约 50 300IU/mg 的抗 IIa 活性， 例如约 70 280IU/mg， 约 90 250 IU/mg， 约 说 明 书 CN 101495517 B 6 3/65 页 7 100250IU/mg， 约10014

28、0IU/mg， 150200IU/mg， 约130190IU/mg， 约155195IU/ mg。 0012 本发明的第二方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0013 重均分子量为约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da， 约 5000 8000Da， 约 5500 8000Da， 约 5700 7900Da， 约 5800 6800Da， 和 0014 例如通过活化部分凝血活酶时间(ACT)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)测量， 鱼 精蛋白中和了至少 50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99或 100的抗 IIa 活性。 优选在施用鱼精蛋

29、白后 5、 10、 15、 30 分钟内， LMWH 的抗 IIa 活性被中和了至少 50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99或 100。 0015 本发明的第三方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0016 重均分子量为约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da， 约 5500 8000Da， 约 5700 7900Da， 约 5800 6800Da， 和 0017 例如通过摩尔测定， UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S占组合物的 5至 15， 例如 7至 14， 9至 12。优选例如通过摩尔测定， 位于分子非还原性末端的 UHNAc，

30、 6SGHNS， 3S， 6S占组合 物的链的约 5至 15， 例如 7至 14， 9至 12。 0018 本发明的第四方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0019 平均链长为约 9 18 个二糖或 8 18 个二糖， 例如约 9 16 或 8 16 个二糖 ； 和 0020 例如通过摩尔测定， UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S占组合物的 5 15， 例如 7 14， 9 12。优选例如通过摩尔测定， 位于分子非还原性末端的 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S占组合 物链的约 5 15， 例如 7 14， 9 12。 0021 本发明的第五方面公开了具有下述特征的

31、 LMWH 组合物 ： 0022 重均分子量为约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da， 约 5500 8000Da， 约 5700 7900Da， 约 5800 6800Da ； 和 0023 抗 Xa 与抗 IIa 比值为 3 1 或更小， 例如 2 1、 1.6 1、 1.5 1、 1.4 1、 1.3 1、 1.2 1、 1.1 1、 1 1 或 0.5 1。 0024 优选在施用 LMWH 制剂的疗程期间维持相对恒定的抗 Xa 与抗 IIa 比值， 例如在约 30、 60、 120、 180、 240、 300 分钟的期间内抗 Xa 与抗 IIa 比值的变化不超过

32、约 1.5、 1、 0.5 或 0.2。例如， 如果初始抗 Xa 活性与抗 IIa 活性比值为 2， 则在初始施用后的第二 时间 ( 例如， 在约 30、 60、 120、 180、 240、 300 分钟 ) 测量的比值优选小于 3， 并优选等于 2 或 在 2 附近。 0025 本发明的第七方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0026 任选地， 重均分子量为约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da， 例如约 5500 8000Da， 例如约 5700 7900Da， 例如约 5800 6800Da ； 和 0027 在通过使用肝素酶I、 肝素酶II和肝素酶I

33、II消化以及毛细管电泳进行分析时， 存 在表 10A 中列出所有峰 1-14。 0028 在优选的实施方案中 ： 根据使用肝素酶 I、 肝素酶 II 和肝素酶 III 消化以及毛细 管电泳的分析， LMWH 组合物中各个峰值与在表 10A 列出的类似， 各个峰值均在表 10A 提供 的范围之内， 峰 10 和峰 11 的值在表 10A 提供的范围之内。 说 明 书 CN 101495517 B 7 4/65 页 8 0029 本发明的第八方面公开了具有下述特征的 LMWH 组合物 ： 0030 任选地， 具有约 5000 9000Da， 例如约 5000 8300Da、 约 5500 8000

34、Da、 约 5700 7900Da、 约 5800 6800Da 的重均分子量 ； 和 0031 通过 2D 核磁共振 (NMR) 分析， 存在表 11A 中列出的各结构的质子。 0032 在优选的实施方案中 ： 通过 2D NMR 分析， LMWH 组合物中各个结构的量与在表 11A 列出的类似。 0033 本发明的第九方面公开了具有下述一个或多个特征的 LMWH 组合物 ： 0034 所述组合物基本不包含 ( 例如， 至少 85、 90、 95或更多的链不包含 ) 经修饰 的还原末端结构 ； 至少 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99的组合物链在还原末端具 有 HNAc；

35、组合物 90、 95、 98、 99的链在非还原末端均不具有硫酸酯化 U， 优选所述 组合物的所有链在非还原末端均不 具有硫酸酯化 U ； 组合物中基本不存在连接区域 ( 例 如， 小于 0.1的连接区域 ) ； 所述聚合物中带有 3-O 硫酸酯的链多于可商购的 LMWH( 例 如， 依诺肝素或达肝素) ； 组合物中UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S与U2SHNS， 6SIHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S的比值为约 1 1 至 4 1。 0035 在一个实施方案中， 所述组合物具有两个、 三个、 四个、 五个或全部以上特征。 0036 本发明的第十方面公开了具有以下结构的 LM

36、WH 组合物 ： 0037 0038 其中 R 是 H 或 SO3X ； 0039 R1是 SO3X 或 COCH3； 0040 X 是单价或二价阳离子 ； 0041 n 2 50， 例如 2 40 ； 并且 0042 所述组合物的 n 的平均值优选为 9 16， 8 16 或 8 15。 0043 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有以下结构 ： 0044 0045 其中 ： 0046 0047 R 是 H 或 SO3X ； 说 明 书 CN 101495517 B 8 5/65 页 9 0048 R1是 SO3X 或 COCH3； 0049 X 是单价或二价阳离子 ； 0050

37、n 2 50， 例如 2 40 ； 并且 0051 所述组合物的 n 的平均值优选为 9 16， 8 16 或 8 15。 0052 本发明的第十一方面公开了具有以下结构的 LMWH 组合物 ： 0053 0054 其中 X 是 Na 或 Ca， R 是 H 或 SO3Na ； 0055 R1是 SO3Na 或 COCH3； 0056 n 2 45， 例如 2 35 ； 并且 0057 所述组合物的 n 的平均值优选为 7 11 或 8 12。 0058 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有以下结构 ： 0059 0060 其中 ： 0061 0062 X 是 Na 或 Ca， R

38、是 H 或 SO3Na ； 0063 R1是 SO3Na 或 COCH3； 0064 n 2 45， 例如 2 35 ； 并且 0065 所述组合物的 n 平均值优选为 7 11 或 8 12。 0066 此组合物可作为 LMWH 生产中的中间体存在， 例如作为快速移动组分的酶消化产 物 ( 如本文所述 )。 0067 本发明的第十二方面公开了具有以下结构的 LMWH 组合物 ： 0068 0069 其中 X 是 Na 或 Ca， R 是 H 或 SO3Na ； 说 明 书 CN 101495517 B 9 6/65 页 10 0070 R1是 SO3Na 或 COCH3； 0071 n 2

39、50， 例如 2 40 ； 并且 0072 所述组合物的 n 的平均值优选为 8 15( 例如 10 15) 或 9 16( 例如 11 16)。 0073 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有以下结构 ： 0074 0075 其中 X 是 Na 或 Ca， R 是 H 或 SO3Na ； 0076 R1是 SO3Na 或 COCH3； 0077 n 2 50， 例如 2 40 ； 和 0078 所述组合物的 n 的平均值优选为 8 15( 例如 10 15) 或 9 16( 例如 11 16)。 0079 此组合物可作为 LMWH 生产中的中间体 ( 或称中间产物 ) 存在， 例如

40、作为快速移动 组分的沉淀产物 ( 如本文所述 )。 0080 本文所述的 LMWH( 例如上文所述的 LMWH) 可具有其它性质， 例如上述组合物之一 可进一步具有一个或多个下文所述的功能或结构性质。 0081 因此， 在一个实施方案中， 所述LMWH组合物具有的抗Xa活性为约100400IU/ mg， 例如约120380IU/mg， 例如约150350IU/mg， 例如约170330IU/mg， 例如约180 300IU/mg， 例如约150200IU/mg， 约200300IU/mg， 约130220IU/mg， 约225274IU/ mg。 0082 在一个实施方案中， 例如， 经抗 X

41、a 活性、 ACT 或 aPTT 测定， 所述 LMWH 组合物具有 的抗Xa活性至少50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99、 100可被中和。 优选在使 用鱼精蛋白后5、 10、 15分钟内， 抗Xa活性被中和了至少50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99或100。 例如， 在以每100IU血浆抗Xa活性的LMWH组合物施用约1、 2、 3mg剂量 的鱼精蛋白后的5、 10、 15、 30分钟之内， 抗Xa活性被中和至少50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99或 100。 0083 在另一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有

42、一个或多个以下性质 ： 可通过 aPTT 和 / 或 ACT 监测组合物的活性 ； 所述组合物的多分散性小于 1.6， 例如多分散性约为 1.6 1.1， 例如 1.5 1.1， 1.4 1.1， 1.3 1.1， 1.2 1.1 ； 所述组合物中小于 70、 60、 50、 45、 40、 35、 30的链具有大于 7500Da 或 8000Da 的分子量 ； 所述组合物中小于 40、 35、 30、 25的链具有小于5500Da或5000Da的分子量 ； 所述组合物在链的非还原 末端具有U和I/G结构的混合 ； 所述组合物中具有PF4结合位点的链少于依诺肝素、 达肝 素、 UFH。 008

43、4 在一个实施方案中， LMWH 组合物中约 15、 20、 25、 30、 35、 45、 50的 链在非还原末端具有 U。优选所述组合物中约 15 50的链 ( 例如 15 35的链， 20 35的链 ) 在非还原末端具有 U。 说 明 书 CN 101495517 B 10 7/65 页 11 0085 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有高于依诺肝素或达肝素的硫酸酯化程 度。在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物组合物中具有多于依诺肝素或达肝素的三硫酸酯 化二糖， 例如通过摩尔测定， 所述 LMWH 组合物具有约 50 65的三硫酸酯化二糖， 例 如 55 60、 55

44、58、 57 60的三硫酸酯化二糖。 0086 在一个实施方案中， 所述组合物包含的 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S水平高于依诺肝素、 达肝 素和 / 或 UFH， 例如包含约 5 15 摩尔， 7 14 摩尔， 9 12 摩尔的 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S水平。 0087 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有小于 3、 2.5、 2、 1.5、 1.0的钙 含量和 / 或低于 30、 25、 20、 15、 10的钠含量。在一个实施方案中， 所述 LMWH 组 合物具有少于 1000ng/mg、 750ng/mg、 500ng/mg、 250ng/mg

45、的肝素酶 ( 例如本文所述的肝素 酶 ) ； 少于 1.0、 0.5、 0.3 w/w 的甲醇 ； 少于 1.0、 0.5、 0.3、 0.1 w/w 的乙醇 ； 少于 2.0、 1.75、 1.25、 1.0、 0.5、 0.3、 0.15的氯化物 ； 少于 15 重量、 10 重 量、 5 重量、 2.5 重量的水 ； 少于 2000ppm、 1500ppm、 1000ppm、 950ppm、 900ppm、 850ppm、 800ppm、 750ppm、 700ppm、 650ppm、 600ppm、 550ppm、 500ppm、 450ppm、 400ppm、 350ppm、 300

46、ppm 的游离硫酸酯。 0088 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物提供了大于依诺肝素的 TFPI 释放。在一个 实施方案中， 与依诺肝素相比， LMWH提供的TFPI释放至少增加了2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 30、 40 倍。 0089 在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有约 30 分钟至 3 小时的静脉内半衰期， 例 如约 1 2 小时。在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有约 30 分钟至 3.0 小时或 3.5 小时的皮下半衰期， 例如约 1.5 2.5 小时 ( 例如约 2 小时 ) 的皮下半衰期。 0090 在上

47、述第一、 第二、 第三、 第四、 第五、 第六、 第七、 第八、 第九、 第十个方面的任意一 个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有一个或多个下述特征 ： 0091 所述组合物基本不包含 ( 例如， 至少 85、 90、 95或更多的链不包含 ) 经修饰 的还原末端结构 ； 所述组合物至少 60、 70、 80、 85、 90、 95、 99的链在还原末 端具有 HNAc； 所述组合物 90、 95、 98、 99的链在非还原末端均不具有硫酸酯化 U， 优选所述组合物的所有链在非还原末端均不具有硫酸酯化 U ； 组合物中基本不存在连接 区域 ( 例如， 小于 0.1的连接区域 ) ； 所述

48、组合物中带有 3-O 硫酸酯的链多于可商购的 LMWH( 例如， 依诺肝素或达肝素 ) ； 组合物中 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S与 U2SHNS， 6SIHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S的 比值为约 1 1 至 4 1( 例如 1 1， 2 1， 3 1 或 4 1)。在一个实施方案中， 所述 LMWH 组合物具有两个、 三个、 四个、 五个或全部以上特征。 0092 另一方面， 本发明公开了具有以下性质的 LMWH 组合物 ： 0093 约 5000 9000Da 的重均分子量 ； 0094 约 50 300IU/mg 的抗 IIa 活性 ； 0095 例如通过 AC

49、T 或 aPTT 测定， 至少 50的抗 IIa 活性可被鱼精蛋白中和 ； 0096 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S占组合物约 5 15， 优选 UHNAc， 6SGHNS， 3S， 6S 位于 5 15 的组合物的非还原末端 ； 0097 约 9 16 个二糖的平均链长 ； 0098 抗 Xa 活性与抗 IIa 活性的比值为 3 1 或以下 ； 说 明 书 CN 101495517 B 11 8/65 页 12 0099 在施用 LMWH 的疗程期间维持相对恒定的抗 Xa 与抗 IIa 比值， 例如在约 30、 60、 120、 180、 240、 300 分钟的时间内抗 Xa 与抗 IIa 比值的变化不超过约 1.5、 1、 0.5 或 0.2。例如， 如果抗 Xa