一种棉铃虫微孢子虫株系及其在农业害虫防治中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510717755.8 (22)申请日 2015.10.30 CGMCC NO.11289 2015.10.19 C12N 1/10(2006.01) C12N 3/00(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (71)申请人 江西新龙生物科技股份有限公司 地址 336000 江西省宜春市袁州区医药工业 园 (72)发明人 邓方坤 (54) 发明名称 一种棉铃虫微孢子虫株系及其在农业害虫防 治中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种棉铃虫

2、微孢子虫株系， 棉 铃虫微孢子虫 FDK001 株系， 保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 为 CGMCC No. 11289。所述的棉铃虫微孢子虫株 系的制备方法， 包括以下步骤 ：（1） 将棉铃虫微孢 子虫 FDK001 株系的孢子液喷洒在棉铃虫饲料上， 喂食棉铃虫 ；（2） 棉铃虫食入带有棉铃虫微孢子 虫 FDK001 株系的饲料后， 被棉铃虫微孢子虫感染 而死亡 ；（3） 取死亡的棉铃虫虫体中的棉铃虫微 孢子虫 FDK001 株系的孢子， 即为防治农业害虫的 活性成分。本发明提供的棉铃虫微孢子虫株系可 以用于防治棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘

3、蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟等多种鳞翅目农业害 虫。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105385600 A 2016.03.09 CN 105385600 A 1/1 页 2 1.一种棉铃虫微孢子虫株系， 其特征在于， 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系， 保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC No. 11289。 2.一种如权利要求 1 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ： （1） 将棉铃虫微孢子虫 FDK0

4、01 株系的孢子液喷洒在棉铃虫饲料上， 喂食棉铃虫 ； （2） 棉铃虫食入带有棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的饲料后， 被棉铃虫微孢子虫感染而 死亡 ； （3） 取死亡的棉铃虫虫体中的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的孢子， 即为防治农业害虫 的活性成分。 3.根据权利要求 2 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述孢子液与棉铃虫饲料的比例为 50 微升孢子液喷洒于 1 立方厘米的饲料上。 4.根据权利要求 2 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 其特征在于， 所述的孢子 液中孢子的浓度为 1104孢子 /ml -110 8孢子 /ml。 5.根据

5、权利要求 2 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 其特征在于， 所述的棉铃 虫的饲养条件为 25-30， 相对湿度 60-70%， 每日光照时间 16 小时。 6.根据权利要求 2 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 具体可以通过如下方法获取死亡虫体中所述的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系微孢子 ： 将步 骤 （2） 中所述死亡的棉铃虫研磨、 再用 120 目的网筛过滤， 将所有过滤得到的组织液用等体 积的水稀释后， 进行如下差速离心 ： 500-1000 转 / 分钟离心 15 分钟取上清， 将上清液 3000 转 / 分钟离心 30 分钟取沉淀， 即

6、为所述的 FDK001 棉铃虫微孢子虫株系的孢子。 7.权利要求 1 所述的棉铃虫微孢子虫株系在防治农业害虫中的应用。 8.根据权利要求 7 所述的棉铃虫微孢子虫株系在防治农业害虫中的应用， 其特征在 于， 所述害虫为鳞翅目害虫， 包括棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟和稻 纵卷叶螟。 9.根据权利要求 7 所述的棉铃虫微孢子虫株系在防治农业害虫中的应用， 其特征在 于， 包括含有所述棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系孢子成分的农业害虫防治剂。 10.根据权利要求 9 所述的棉铃虫微孢子虫株系在防治农业害虫中的应用， 其特征在 于， 所述防治剂包括润湿剂， 为吐温 8

7、0， 十二烷基苯磺酸钠、 十二烷基硫酸钠、 烷基萘磺酸 钠、 脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、 脂肪醇聚氧乙烯醚、 壬基酚聚氧乙烯醚、 山梨醇脂肪酸酯聚 氧乙烯醚中的一种或几种的混合物 ； 包括分散剂， 为 NNO、 木质素磺酸钠、 木质素磺酸钙、 聚 丙烯酸钠、 亚甲基双萘磺酸盐、 烷基氨基牛磺酸盐、 亚甲基双萘磺酸钠甲醛缩合物、 聚氧乙 烯聚氧丙烯嵌段共聚物、 羧甲基纤维素、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 三聚磷酸钠、 烷基萘磺 酸盐等中的一种或几种混合物 ； 包括防冻剂， 为蔗糖、 乙二醇、 丙二醇、 甘油等中的一种或几 种的混合物 ； 包括紫外防护剂， 为苯丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸、 二苯甲

8、酮、 二甲氧基二苯甲酮、 甲氧基肉桂酸辛酯、 水杨酸辛酯等中的一种或几种的混合物。 权 利 要 求 书 CN 105385600 A 2 1/4 页 3 一种棉铃虫微孢子虫株系及其在农业害虫防治中的应用 技术领域 0001 本发明涉及害虫生物防治技术领域， 具体是一种棉铃虫微孢子虫株系及其在农业 害虫防治中的应用。 背景技术 0002 棉铃虫属于鳞翅目夜蛾科， 为杂食性害虫。棉铃虫的幼虫蛀食危害棉花、 玉米、 番 茄、 辣椒等， 是我国农业上的主要害虫， 也是世界农业上的主要害虫。我国自从 1990 年来， 棉铃虫连年大爆发， 造成巨大的经济损失。后来， 随着转 Bt 基因的抗虫棉的大面积使用

9、， 棉 铃虫在棉田中的危害得到了有效的控制， 但是， 近年来有报道称棉铃虫对转基因的 Bt 蛋白 已经产生了严重抗性， 在南美洲的巴西， 近年来棉铃虫又再次大爆发。 0003 目前防治棉铃虫的方法主要是采用化学农药防治， 尽管化学防治可以迅速的压低 棉铃虫的虫口密度， 但是往往造成环境污染、 杀伤大量有益动物， 人畜中毒和害虫产生抗药 性等不良后果。 生物农药防治棉铃虫不但可以有效控制棉铃虫的危害， 而且不杀伤天敌、 对 环境友好、 对人畜安全， 具有十分广阔的应用前景。因此， 开发利用其他的有效生物防治资 源对棉铃虫进行防治， 有利于提高防治效果， 减缓抗性发展， 具有重要意义。 0004

10、微孢子虫是昆虫病原微生物， 属于专性细胞内寄生的单细胞原生生物。它一旦侵 入寄主昆虫体内， 便能够通过食物， 接触等将病原体传播给其他个体， 而且可以通过卵传染 给后代， 从而引起昆虫微孢子虫病的发生和流行， 是自然界制约昆虫种群密度的重要因素 之一。 0005 虽然目前已经有报道棉铃虫核型多角体病毒可以用于生物防治棉铃虫， 但是微孢 子虫对棉铃虫的防治具有多种优势。 第一、 棉铃虫核型多角体病毒对野外环境较为苛刻， 对 紫外线敏感， 而微孢子虫较病毒更耐紫外线， 可以满足大田使用的要求。第二、 棉铃虫核型 多角体病毒专一侵染棉铃虫杀虫谱窄， 而棉铃虫微孢子虫可以侵染包括棉铃虫、 小菜蛾、 甜

11、 菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟等多种鳞翅目害虫， 其杀虫谱广。 第三、 棉铃 虫核型多角体病毒只能通过食入传播侵染棉铃虫， 而不能垂直传播给下代的卵。棉铃虫微 孢子可以垂直传播侵染下代的卵， 造成下一代的幼虫带有微孢子虫， 并可以通过接触传播 侵染其他昆虫， 极大的控制整体的虫群基数。 0006 因而， 开发棉铃虫微孢子虫用于农业害虫防治具有现实意义。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种棉铃虫微孢子虫株系， 及其在防治包括棉铃虫、 小菜 蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟等多种鳞翅目害虫中的应用。 0008 为实现上述目的， 本发明提

12、供如下技术方案 ： 一种棉铃虫微孢子虫株系， 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系， 保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC No. 11289。 0009 所述的棉铃虫微孢子虫株系的制备方法， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 105385600 A 3 2/4 页 4 （1） 将棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的孢子液喷洒在棉铃虫饲料上， 喂食棉铃虫 ； （2） 棉铃虫食入带有棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的饲料后， 被棉铃虫微孢子虫感染而 死亡 ； （3） 取死亡的棉铃虫虫体中的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的孢子， 即为防治农业害虫 的活

13、性成分。 0010 作为本发明进一步的方案 ： 步骤 （1） 中， 所述孢子液与棉铃虫饲料的比例为 50 微 升孢子液喷洒于 1 立方厘米的饲料上。 0011 作为本发明再进一步的方案 ： 所述的孢子液中孢子的浓度为 1104孢子 /ml -1108孢子 /ml。 0012 作为本发明再进一步的方案 ： 所述的棉铃虫的饲养条件为 25-30， 相对湿度 60-70%， 每日光照时间 16 小时。 0013 作为本发明再进一步的方案 ： 步骤 （3） 中， 具体可以通过如下方法获取死亡虫体 中所述的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系微孢子 ： 将步骤 （2） 中所述死亡的棉铃虫研磨、 再 用 1

14、20 目的网筛过滤， 将所有过滤得到的组织液用等体积的水稀释后， 进行如下差速离心 ： 500-1000 转 / 分钟离心 15 分钟取上清， 将上清液 3000 转 / 分钟离心 30 分钟取沉淀， 即为 所述的 FDK001 棉铃虫微孢子虫株系的孢子。 0014 所述的棉铃虫微孢子虫株系在防治农业害虫中的应用。 0015 作为本发明再进一步的方案 ： 所述害虫为鳞翅目害虫， 包括棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜 夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟和稻纵卷叶螟。 0016 作为本发明再进一步的方案 ： 包括含有所述棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系孢子成 分的农业害虫防治剂。 0017 作为本发明

15、再进一步的方案 ： 所述防治剂包括润湿剂， 为吐温 80， 十二烷基苯磺 酸钠、 十二烷基硫酸钠、 烷基萘磺酸钠、 脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、 脂肪醇聚氧乙烯醚、 壬 基酚聚氧乙烯醚、 山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚中的一种或几种的混合物 ； 包括分散剂， 为 NNO、 木质素磺酸钠、 木质素磺酸钙、 聚丙烯酸钠、 亚甲基双萘磺酸盐、 烷基氨基牛磺酸盐、 亚 甲基双萘磺酸钠甲醛缩合物、 聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、 羧甲基纤维素、 聚乙烯醇、 聚 乙烯吡咯烷酮、 三聚磷酸钠、 烷基萘磺酸盐等中的一种或几种混合物 ； 包括防冻剂， 为蔗糖、 乙二醇、 丙二醇、 甘油等中的一种或几种的混合物 ； 包括紫外

16、防护剂， 为苯丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸、 二苯甲酮、 二甲氧基二苯甲酮、 甲氧基肉桂酸辛酯、 水杨酸辛酯等中的一种或几种 的混合物。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 本发明提供的棉铃虫微孢子虫可以用于 防治棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟等多种鳞翅目农业 害虫。该产品属于生物农药， 对环境和人、 畜、 禽无毒害， 对天敌安全， 应用前景广阔。 具体实施方式 0019 以下的实施例子便于更好的理解本发明， 但并不限定本发明。下述的实施例子中 的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。下述实施例子中所用的实验材料， 如无特殊说 明，

17、 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例子中的定量实验， 均设置三次重复实 验， 结果取平均值。 说 明 书 CN 105385600 A 4 3/4 页 5 0020 实施例 1 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的获得 将田间采集患病的棉铃虫 （棉铃虫死虫多为黑色死亡， 不化水， 虫体软， 表皮容易破裂， 中肠肿胀变粗， 脆弱易断） ， 研磨、 过滤、 镜检， 微孢子虫在显微镜下为无色， 折光性强， 长卵 形， 少数为肾形， 大小约 4.5um2.5um， 用 Giemsa 染色， 核被染色为浅红色， 细胞质染色为 蓝色。将各个野生棉铃虫微孢子虫株系以一系列的浓度涂抹在棉铃虫饲料上

18、， 之后饲喂棉 铃虫， 收获死亡较早的虫体 （代表毒力强的毒株） ， 经过研磨、 过滤、 离心等。得到纯化的棉铃 虫微孢子虫。连续筛选 10 代， 得到棉铃虫微孢子虫 （Nosema heliothidis） FDK001 株系。 0021 在 2015 年 10 月 19 日将棉铃虫微孢子虫 （Nosema heliothidis） FDK001 株系保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC， 地址北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号） ， 保藏编号 CGMCC No. 11289。棉铃虫微孢子虫 （Nosema heliothidis） FDK001 株系

19、 CGMCC No. 11289 简称 FDK001 株系。 0022 实施例 2 FDK001 株系的致病性的鉴定 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系用血球计数板确定浓度。棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系对 棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟的感染试验采用微孢子 FDK001株系悬浮液 （106孢子/ml） 直接喷雾在卵粒上的方法。 对棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟 2 龄幼虫的感染试验， 将微孢子 FDK001 株系悬浮液 （106孢子 /ml） 50 微升喷洒在 1 立方厘米的人工饲料上， 于 26，

20、相对湿度 60%， 每日光照 时间 16 小时 / 天。感染饲养。记录幼虫死亡率。每个处理 3 次重复， 每次重复 360 头虫。 0023 同时设置空白对照组， 空白对照组幼虫的死亡率在 1% 以下为有效试验。 0024 致病性感染试验的结果见表 1。 0025 致病性感染结果表明棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系对棉铃虫、 小菜蛾、 甜菜夜蛾、 菜青虫、 甘蓝夜蛾、 二化螟、 稻纵卷叶螟都具有强的致病感染性。 0026 表 1 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系 106孢子 /ml 对几种昆虫的感染试验 实施例子 3 说 明 书 CN 105385600 A 5 4/4 页 6 棉铃虫微孢

21、子虫 FDK001 株系孢子的制备 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系孢子的制备， 包括如下步骤 ： （1） 将棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的孢子液浓度 1106孢子 /ml 喷洒在棉铃虫饲料 上 （50 微升孢子液喷洒于 1 立方厘米的饲料上） ， 喂食棉铃虫 ； （2） 棉铃虫食入带有棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的饲料后， 棉铃虫被棉铃虫微孢子 虫FDK001株系感染而死亡， 所述的棉铃虫的饲养条件为25-30， 相对湿度60-70%， 每日光 照时间 16 小时 ； （3） 将步骤 （2） 中所述死亡的棉铃虫研磨、 再用 120 目的网筛过滤。将所有过滤得到的 组织液用等体积

22、的水 （最好为蒸馏水） 稀释后， 进行如下差速离心 ： 500-1000 转 / 分钟离心 15 分钟取上清， 将上清液 3000 转 / 分钟离心 30 分钟取沉淀， 即为所述的 FDK001 棉铃虫微 孢子虫株系的孢子。分离获取得的死亡的棉铃虫虫体中的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系的 孢子， 即为防治农业害虫的活性成分。 0027 实施例子 4 棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系孢子制剂的制备和应用 将实施例子 3 中获得的棉铃虫微孢子虫 FDK001 株系孢子， 加入 5% 润湿剂吐温 80， 5% 分散剂木质素磺酸钠， 5% 防冻剂蔗糖， 1% 紫外线保护剂色氨酸制备为悬浮剂。其中棉铃虫 微孢子虫 FDK001 株系孢子的含量为 2109孢子 /ml。 0028 将上述悬浮剂在棉铃虫于 2 龄盛发期兑水 500 倍进行大田喷雾， 每亩使用 100 毫 升制剂。 设置3个重复和空白对照组。 喷雾后7天统计进行喷雾的实验大田的棉铃虫数量， 计算防效。微孢子虫 FDK001 株系孢子制剂防效为 81%。 0029 上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明， 但是本专利并不限于上述实施方 式， 在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内， 还可以在不脱离本专利宗旨的前提下 做出各种变化。 说 明 书 CN 105385600 A 6