一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍生物制备方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102775276 B (45)授权公告日 2014.10.01 CN 102775276 B (21)申请号 201210265916.0 (22)申请日 2012.07.26 C07C 33/02(2006.01) C07C 29/74(2006.01) C07C 29/17(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院林产化学工 业研究所 地址 210042 江苏省南京市玄武区锁金五村 16 号 (72)发明人 王成章 陶冉 周彦 CN 101967083 A,2011.0

2、2.09, CN 1529550 A,2004.09.15, CN 1392167 A,2003.01.22, CN 1850109 A,2006.10.25, 杨兰等 . 脱色纯化银杏叶聚戊烯醇的工艺 研究 .林产化学与工业 .2010, 第 30 卷 ( 第 6 期 ),51-54. 李春斌等 . 银杏叶聚戊烯醇分离分析方法 的研究进展 .大连民族学院学报 .2007,( 第 1 期 ),41-43. 周春华等 . 银杏叶聚戊烯醇研究进展 .中 成药 .2009, 第 31 卷 ( 第 9 期 ),1416-1419. (54) 发明名称 一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇 及其加氢衍

3、生物制备方法 (57) 摘要 本专利公开一种具有抑菌和抗氧化活性的植 物聚戊烯醇及其加氢衍生物制备方法， 以银杏、 松 针和桑叶为原料， 通过非极性溶剂提取聚戊烯醇 类脂软膏， 在脲醇溶液中和填料包合， 结晶， 制备 聚戊烯醇类脂尿素包合物， 经柱层析， 纯化聚戊烯 醇类脂。 加入到5-40氢氧化钠溶液中皂化反 应， 制备含量大于95聚戊烯醇。 在二氯甲烷-甲 醇溶液中加入催化剂， 聚戊烯醇与催化剂质量比 为 80 200 1， 反应压力 8 20MPa， 反应时间 为 18 48h， 反应温度 10 50； 反应结束后， 过滤， 真空浓缩， 浓缩物为聚戊烯醇加氢衍生物。 本专利制备的聚戊烯醇

4、及其加氢衍生物对于金黄 色葡萄球菌 (Sa.)、 大肠杆菌 (Ec.)、 枯草芽孢菌 和沙门氏菌具有抑制作用， 对于清除超氧自由基 和羟基自由基具有清除作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 平大为 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书12页 附图5页 (10)授权公告号 CN 102775276 B CN 102775276 B 1/2 页 2 1. 一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物的制备方法， 其特征在于由 以下步骤组成 ： 第一步， 聚戊烯醇类脂提取 ： 将富含

5、聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子， 室温阴干， 破碎至 100目以下粉末， 加入无水丙酮或C1C3醇中任一种溶剂， 叶子与溶剂按质量比为120， 在室温浸泡 10 72 小时， 或在 10 80经微波提取或超声波提取 10 60 分钟， 重复 提取两次， 合并提取液， 真空回收有机溶剂， 浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏 ； 第二步， 脲醇溶液的制备 ： 将尿素放入无水甲醇中， 在充氮条件下水浴加热至尿素全部 溶解， 其中尿素与无水甲醇的重量体积比为 1 1 10， 回流温度为 40 90 ； 第三步， 聚戊烯醇类脂尿素包合物制备 ： 在脲醇溶液中加入聚戊烯醇类脂软膏和填料， 聚戊烯醇类脂软膏填料脲醇溶液的

6、质量比例0.11131040， 在4090 搅拌回流， 冷却至室温后， 在 -40 10结晶， 抽滤， 结晶物为聚戊烯醇类脂尿素包合物 ； 第四步， 聚戊烯醇类脂纯化 ： 将聚戊烯醇类脂尿素包合结晶物装柱， 用非极性溶剂进行 洗脱， 洗脱体积为柱体积 1-4 倍， TLC 检测， 合并聚戊烯醇类脂洗脱组分， 浓缩后加入质量比 为 1 6 30 无水丙酮， 室温搅拌溶解 ； 40 200 目硅藻土与石英沙按质量比 1 1 10 混合， 得到混合助剂， 混合助剂与聚戊烯醇类脂质量比为 0.5 20 100 混合， 在 -30 0搅拌 2 30 小时， 3000 20000 转 / 分钟离心机过滤，

7、 清液回收有机溶剂， 浓缩物为纯 化聚戊烯醇类脂 ； 第五步， 聚戊烯醇制备 ： 聚戊烯醇类脂加入到 5 -40氢氧化钠溶液中， 聚戊烯醇类 脂与氢氧化钠溶液质量比为 1 10 50， 在 30 90搅拌反应 0.5 3 小时， 再用正己 烷等体积萃取反应液 2-5 次， 合并萃取相， 用等体积水反洗 2 5 次， 有机相减压浓缩， 浓缩 物加入 5-20 倍硅胶混匀， 再用 2-6 倍正己烷室温浸泡 0.5-2 小时， 过滤， 滤液浓干， 浓缩物 为淡黄色聚戊烯醇油状物， 聚戊烯醇含量大于 95 ； 第六步， 聚戊烯醇加氢衍生物制备 将聚戊烯醇溶于二氯甲烷 - 甲醇溶液中， 二氯甲烷与甲醇体

8、积比为 8 1 1， 聚戊烯醇与二氯甲烷 - 甲醇溶液质量体积比 (g ml)1 20 100 ； 加入催化剂 (S)-Ru(OAc)2(BINAP)、 Rh/PVP-TiO2、 Ru(BINAP)(OAc)2中任一种， 聚戊烯醇与催化剂质量比 为 80 200 1， 反应压力 8 20MPa， 反应时间为 18 48h， 反应温度 10 50； 反应 结束后， 过滤， 真空浓缩， 浓缩物为聚戊烯醇加氢衍生物。 2. 根据权利要求 1 所述一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物制备 方法， 其特征在于聚戊烯醇及其加氢衍生物对于金黄色葡萄球菌 (Sa.)、 大肠杆菌 (Ec.)、 枯草

9、芽孢菌和沙门氏菌具有抑制作用， 对于清除超氧自由基和羟基自由基具有清除作用。 3. 根据权利要求 1 所述一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物制备 方法， 其特征在于聚戊烯醇来源于银杏叶、 松针叶、 桑叶中的一种， 聚戊烯醇的结构为桦木 醇型 -(trans)2-(cis)n-OH， 其中 n 的范围为 10 20。 4. 根据权利要求 1 所述一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物制备 方法， 其特征在于聚戊烯醇加氢衍生物是聚戊烯醇分子结构中一个异戊烯基单元被氢饱和 为异戊烷基单元。 5. 根据权利要求 1 所述一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物制备 方法

10、， 其特征在于第一步中 C1 C3 醇为甲醇、 乙醇、 正丙醇、 异丙醇中任一种。 权 利 要 求 书 CN 102775276 B 2 2/2 页 3 6. 根据权利要求 1 所述一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇加氢衍生物制备 方法， 其特征在于第三步中填料为硅胶、 活性炭、 聚酰胺树脂、 凹凸棒土、 氧化铝、 硅藻土中 一种。 权 利 要 求 书 CN 102775276 B 3 1/12 页 4 一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍生 物制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍生物制备方 法， 属于生物医药领域。 技术背景

11、 0002 聚戊烯醇在裸子、 被子植物中均广泛存在， 其还存在于细菌、 真菌和哺乳动物的脏 器中， 其结构与具有生物活性的多萜醇结构相似， 因此被誉为最佳的合成中间体， 所以从植 物提取桦木型聚戊烯醇与人体中多萜醇结构相似， 因此提取分离植物聚戊烯醇并合成多萜 醇成为一种新的药物开发理念。 0003 聚戊烯醇是以 C5异戊烯基为结构单元的类脂化合物， 从结构上可分 ： 桦木醇型 -(trans)2-(cis)n-OH、 菲卡醇型 -(trans)3-(cis)n-OH 和茄尼醇型 -(trans)n-OH， 王 成章等从银杏叶中分离出 7 种桦木醇型聚戊烯醇， 结构单元为 15 22。如图 1

12、. 0004 聚戊烯醇类脂在植物体中多以乙酸酯和游离态的醇的形式存在， 在动物体中多以 磷酸酯和醇的形式存在。有研究表明， 在桦木中以碳链长度为 30 40 的不饱和醇和乙酸 酯的形式存在， 木兰叶中的聚戊烯醇为 45 65 碳的不饱和醇， 叶绿醇中以碳链长度为 20 和 45 的饱和醇存在， 翻白草中以碳链长度为 75 175 的不饱和醇存在， 酵母中的聚戊烯醇 以碳链长度为 30 40 的饱和乙酸酯存在， 猪肝脏中的聚戊烯醇碳链长度为 55 的饱和醇和 磷酸酯， 真菌感染的叶子中含有碳链长度为 55 的饱和醇。目前有报道银杏聚戊烯醇、 刺山 柑聚戊烯醇、 松针聚戊烯醇、 桑叶聚戊烯醇、 柏

13、叶聚戊烯醇等。 0005 植物聚戊烯醇及其加氢衍生物是人体糖蛋白生物合成的关键载体， 具用抗肿瘤、 辅助放化疗及抗病毒和降血糖、 抗突变、 降血脂和调节免疫功能等作用。尤其 S- 多萜醇含 有不饱和双键， 具有抗氧化、 清除脂质自由基作用， 能抗衰老， 提高亚键康人群的生活质量。 尽管多萜醇及其磷酸酯是生物代谢的关键载体， 但由于多萜醇在动物体内的含量太低， 其 提取、 分离和纯化繁锁， 收率极低， 从动物内脏提取分离天然多萜醇成本极高， 天然存在的 多萜醇的供应极其稀少， 如 5kg 猪肝仅含有 200mg 多萜醇， 到目前为止， 国内外没有解决高 纯度多萜醇的大量制备问题， 从而限制了多萜

14、醇及其磷酸酯的药物开发。 因此， 如何合成多 萜醇及其磷酸酯， 并研究它们的生物活性及其代谢机理， 成为国际研究的方向。 0006 目前国内外对于聚戊烯醇的提纯多用于硅胶柱层析分离， 对于尿素包埋法纯化分 离聚戊烯醇国内外并没有报道， 尤其对于聚戊烯醇作为中间体加氢产物及其抗氧化性和抑 菌生物活性的研究甚少。多萜醇是聚戊烯醇未端单元中异戊烯基加氢为饱和的异戊醇， 是 聚戊烯醇加氢产物中一种。本发明提取分离桦木醇型结构 (-(trans)2-(cis)n-OH， n 10 20) 的聚戊烯醇， 通过合成制备聚戊烯醇分子结构中一个异戊烯基单元被氢饱和为异 戊烷基单元的加氢衍生物， 本发明的合成产物

15、包括了多萜醇。 发明内容 说 明 书 CN 102775276 B 4 2/12 页 5 0007 为实现上述目的， 发明了一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍 生物制备方法， 由以下步骤组成 ： 0008 第一步， 聚戊烯醇类脂提取 ： 将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子， 室温阴干， 破 碎至 100 目以下粉末， 加入无水丙酮或 C1 C3 醇中任一种溶剂， 叶子与溶剂按质量比为 1 20， 在室温浸泡 10 72 小时， 或在 10 80经微波提取或超声波提取 10 60 分 钟， 重复提取两次， 合并提取液， 真空回收有机溶剂， 浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏 ； 0009 第二

16、步， 脲醇溶液的制备 ： 将尿素放入无水甲醇中， 在充氮条件下水浴加热至尿素 全部溶解， 其中尿素与无水甲醇的重量体积比为 1 1 10， 回流温度为 40 90 ； 0010 第三步， 聚戊烯醇类脂尿素包合物制备 ： 在脲醇溶液中加入聚戊烯醇类脂软膏和 填料， 聚戊烯醇类脂软膏填料脲醇溶液的质量比例 0.1 1 1 3 10 40， 在 40 90搅拌回流， 冷却至室温后， 在 -40 10结晶， 抽滤， 结晶物为聚戊烯醇类脂尿素 包合物。 0011 第四步， 聚戊烯醇类脂纯化 ： 将聚戊烯醇类脂尿素包合结晶物装柱， 用非极性溶 剂进行洗脱， 洗脱体积为柱体积 1-4 倍， TLC 检测，

17、合并聚戊烯醇类脂洗脱组分， 浓缩后加 入质量比为 1 6 30 无水丙酮， 室温搅拌溶解 ； 40 200 目硅藻土与石英沙按质量比 1 1 10 混合， 得到混合助剂， 混合助剂与聚戊烯醇类脂质量比为 0.5 20 100 混合， 在 -30 0搅拌 2 30 小时， 3000 20000 转 / 分钟离心机过滤， 清液回收有机溶剂， 浓缩物为纯化聚戊烯醇类脂 ； 0012 第五步， 聚戊烯醇制备 ： 聚戊烯醇类脂加入到 5 -40氢氧化钠溶液中， 聚戊烯 醇类脂与氢氧化钠溶液质量比为 1 10 50， 在 30 90搅拌反应 0.5 3 小时， 再用 正己烷等体积萃取反应液 2-5 次，

18、合并萃取相， 用等体积水反洗 2 5 次， 有机相减压浓缩， 浓缩物加入 5-20 倍硅胶混匀， 再用 2-6 倍正己烷室温浸泡 0.5-2 小时， 过滤， 滤液浓干， 浓 缩物为淡黄色聚戊烯醇油状物， 聚戊烯醇含量大于 95。 0013 第六步， 聚戊烯醇加氢衍生物制备 0014 将聚戊烯醇溶于二氯甲烷 - 甲醇溶液 ( 体积比为 8 1 1) 中， 聚戊烯醇与二氯 甲烷 - 甲醇溶液质量体积比 (g ml)1 20 100 ； 加入催化剂， 聚戊烯醇与催化剂质量 比为 80 200 1， 反应压力 8 20MPa， 反应时间为 18 48h， 反应温度 10 50； 反 应结束后， 过滤，

19、 真空浓缩， 浓缩物为聚戊烯醇加氢衍生物。 0015 本发明中聚戊烯醇及其加氢衍生物对于金黄色葡萄球菌 (Sa.)、 大肠杆菌 (Ec.)、 枯草芽孢菌和沙门氏菌具有抑制作用， 聚戊烯醇抑菌圈直径为 6.82-8.55mm， 加氢衍生物抑 菌圈直径为 8.02 9.98mm， 氢化产物抑菌活性高于聚戊烯醇。氢化产物对 O2-的清除结 果表明， 氢化产物样品浓度的增加， 超氧自由基的清除率逐渐上升， 在0.20.4mg/mL范围 内呈平缓上升趋势， 0.41.0mg/mL范围内呈急速上升趋势， 1.0mg/mL以后增加浓度， 清除 率上升幅度较小， 在 1.4mL 以后趋势趋于平缓， 但总体而言

20、， 增加产品的浓度， 会增加超氧 自由基的清除率， 加强其抗氧化的活性。氢化产物对 OH 的清除结果表明， 氢化产物样品浓 度的增加， 羟基自由基的除率逐渐上升， 在 0.4 1.2mg/mL 范围内呈平缓上升趋势， 1.2 2.0mg/mL 范围内呈急速上升趋势， 2.0mg/mL 以后增加浓度， 清除率上升趋势趋于平缓， 但 总体而言， 增加产品的浓度， 会增加羟基自由基的清除率， 加强其抗氧化的活性。本发明制 备的氢化产物对清除超氧自由基和羟基自由基均有较好的清除作用， 有良好的抗氧化性。 说 明 书 CN 102775276 B 5 3/12 页 6 0016 本发明中聚戊烯醇来源于银

21、杏叶、 松针叶、 桑叶中的一种， 聚戊烯醇的结构为桦木 醇型 -(trans)2-(cis)n-OH， 其中 n 的范围为 10 20。通过催化加氢反应， 将聚戊烯醇分 子结构中一个异戊烯基单元被氢饱和为异戊烷基单元， 其中包括未端单元为异戊醇的多萜 醇结构。在本专利中选择的加氢催化剂是 (S)-Ru(OAc)2(BINAP)、 Rh/PVP-TiO2、 Ru(BINAP) (OAc)2中任一种。如图 1. 0017 在本发明第一步中 C1 C3 醇为甲醇、 乙醇、 正丙醇、 异丙醇中任一种， 优选异丙 醇。在脲醇溶液的制备中， 将尿素放入无水甲醇中， 在充氮条件下水浴加热至尿素全部溶 解，

22、其中尿素与无水甲醇的重量体积比为 1 1 10， 优选 1 1 4， 回流温度为 40 90， 优选 40 500 ； 本发明第三步中填料为硅胶、 活性炭、 聚酰胺树脂、 凹凸棒土、 氧化 铝、 硅藻土中一种。 0018 本发明在聚戊烯醇类脂尿素包合物制备， 将聚戊烯醇类脂软膏填料脲醇溶液 的质量比例0.11131040， 在4090搅拌回流， 优选4060， 再进行冷 却去杂， 优选-20-10结晶， 抽滤， 结晶物为聚戊烯醇类脂尿素包合物。 在聚戊烯醇类脂 纯化中， 将聚戊烯醇类脂尿素包合结晶物装柱， 用非极性溶剂进行洗脱， 优选正己烷， 洗脱 体积为柱体积1-4倍， TLC检测， 合并聚

23、戊烯醇类脂洗脱组分， 浓缩后加入质量比为16 30 无水丙酮， 室温搅拌溶解 ； 40 200 目硅藻土， 优选 100 120 目， 与石英沙按质量比 1 1 10 混合， 得到混合助剂， 混合助剂与聚戊烯醇类脂质量比为 0.5 20 100 混合， 在 -30 0搅拌 2 30 小时， 3000 20000 转 / 分钟离心机过滤， 清液回收有机溶剂， 浓缩物为纯化聚戊烯醇类脂 ； 0019 本发明中采用 TLC 检测和 HPLC 检测聚戊烯醇及其加氢衍生物， TLC 检测时碘蒸气 显色。HPLC 分析色谱条件为色谱柱采用 KromasilC18 ODS-1(4.6mm150mm， 5m)

24、， 流动相 为异丙醇甲醇 1 1(V/V)， 柱温 25， 流速 1mL/min， 检测器波长 210nm。本发明专利 采用 HPLC、 IR、 NMR 和 MS 表征聚戊烯醇及其加氢衍生物的结构。如图 2 为氢化产物与聚戊 烯醇的 HPLC 对比， 氢化产物的转化率在 25 65。 0020 图 3 为聚戊烯醇及其加氢衍生物的 IR， 氢化产物和聚戊烯醇的红外光谱基本一 致经分析 ： 在 3322cm-1和 835cm-1为 C-H 的伸缩和弯曲振动峰， 2958cm-1和 2860cm-1为 CH3- 和 -CH2- 伸缩振动峰， 1660cm-1为 C C 的伸缩振动。1450cm-1为

25、 CH3- 的弯曲振动， 1380cm-1为 -CH2- 的弯曲振动， 1000cm-1为 C-O-H 伸缩振动。图 4-5 为聚戊烯醇及其加氢 衍生物的 1H-NMR。聚戊烯醇1H-NMR 谱参照标准 CDCl 3 7.26( 单峰 )， 经分析得 ： 1.59(trans-CH3)， 1.68(cis-CH3)， 1.74(-CH3-cis)， 1.99-2.09(-CH3-)， 4.07(-CH2OH)， 5.12(-CCH)。 氢化产物的核磁氢谱在1.25和1.29多重峰为单元-CH(CH3)-CH2上 的亚甲基氢， 在0.85处多重峰为单元上的次甲基氢-CH(CH3)-CH2， 提示

26、不对称氢化产 生于聚戊烯醇单元不饱和双键处。 图6-7为聚戊烯醇及其加氢衍生物的 13C-NMR。 聚戊烯 醇 13C-NMR谱参照标准CDCl 377.00(三重峰)， ： 135.56(-cis-CH3CH)、 134.84和 134.77(trans-CH3CH )、 134.71(cis-CH3CH )、 134.42(trans-C(CH3) CH)、 123.67 124.53( CH)、 58.51(-CH2-O-C O)、 39.23(-CH2-)、 31.71(-CH2-)、 31.49(cis-CH2C(CH3) )、 26.14(trans-(CH3)2C CH-)、 2

27、5.90(trans-CH2CH )、 25.82(cis-CH2CH )、 25.18(cis-CH3C )、 22.86(-CH3)、 17.17(trans-C(CH3) CH)、 15.48(trans-CH3C )。氢 化产物的核磁碳谱经分析得 ： 在 29.71 上对应的次甲基峰高变， 在 139.1 处峰高减弱 说 明 书 CN 102775276 B 6 4/12 页 7 对应说明聚戊烯醇中 (-cis-CH3CH ) 处发生氢化， 提示不对称氢化产生于聚戊烯醇 单元不饱和双键处。 0021 本专利对聚戊烯醇加氢反应转化率的测定， 采用 HPLC 面积归一化法， 从图 2 可

28、以看出随着出峰时间推移聚戊烯醇峰和加氢衍生物峰分离效果较好， 所以我们选择以第 五个峰的峰面积做标准曲线， 推导了峰面积和聚戊烯醇的线性关系， 来标定聚戊烯醇的含 量， 从而推导出反应的转化率。聚戊烯醇的标准曲线如图 9 所示， 求得线性回归方程 y 7.23664x+3.8945， R2 0.9992， 在 5.1 25.2g 范围内线性关系良好。 0022 本专利对聚戊烯醇加氢反应进行了优化， 主要选取了反应压力、 反应时间、 反应温 度以及催化剂的用量， 聚戊烯醇与二氯甲烷-甲醇溶液质量体积比(gml)120100 ； 加入催化剂， 聚戊烯醇与催化剂质量比为 80 200 1， 反应压力

29、 8 20MPa， 反应时间为 18 48h， 反应温度 10 50； 反应结束后， 过滤， 真空浓缩， 浓缩物为聚戊烯醇加氢衍生 物。 0023 本发明的有益效果表现为 ： 0024 1. 首次将聚戊烯醇类脂与填料和脲醇溶液经混合溶解和冷冻结晶， 制备聚戊烯醇 类脂尿素包合物， 有效除去了色素、 脂肪酸及其酯、 极性含氧功能团， 能有效提高聚戊烯醇 类脂的纯度， 再经无水丙酮去蜡， 硅藻土与石英沙分离， 得到 80以上聚戊烯醇类脂。与传 统方法比较， 此方法制备的聚戊烯醇类脂在皂化反应时需要的碱液减少 50以上， 不仅环 境友好， 而且不皂化产物经柱分离得到 95聚戊烯醇。 0025 2.

30、首次采用不对称加氢催化剂， 如催化剂为 (S)-Ru(OAc)2(BINAP)、 Rh/PVP-TiO2、 Ru(BINAP)(OAc)2， 提取分离桦木醇型结构 (-(trans)2-(cis)n-OH， n 10 20) 的聚戊 烯醇， 通过催化加氢反应， 将聚戊烯醇分子结构中一个异戊烯基单元被氢饱和为异戊烷基 单元， 其中包括未端单元为异戊醇的多萜醇结构， 反应转化率最高 65。 0026 3. 首次制备具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍生物， 对于金黄色 葡萄球菌 (Sa.)、 大肠杆菌 (Ec.)、 枯草芽孢菌和沙门氏菌具有抑制作用， 对于清除超氧自 由基和羟基自由基具有清

31、除作用。 附图说明 ： 0027 图 1 三种类型的聚戊烯醇的化学结构 0028 图 2 聚戊烯醇与氢化产物的 HPLC(A ： 聚戊烯醇， B ： 氢化产物 ) 0029 图 3 聚戊烯醇与氢化产物的 IR(A ： 聚戊烯醇， B ： 氢化产物 ) 0030 图 4 聚戊烯醇的核磁氢谱 (1H-NMR) 0031 图 5 氢化产物的核磁氢谱 (1H-NMR) 0032 图 6 聚戊烯醇的核磁碳谱 (13C-NMR) 0033 图 7 氢化产物的核磁碳谱 (13C-NMR) 0034 图 8 聚戊烯醇的标准曲线 0035 图 9 样品各洗脱组分的 TLC 谱图 0036 图 10 加氢衍生物对

32、 O2-自由基的清除率 0037 图 11 加氢衍生物对OH 自由基清除率 说 明 书 CN 102775276 B 7 5/12 页 8 具体实施方式 0038 以下实施例为本发明的一些举例， 不应被看做是对本发明的限定。 0039 实施例 1 聚戊烯醇及其加氢衍生物制备方法 0040 一种具有抑菌和抗氧化活性的植物聚戊烯醇及其加氢衍生物制备方法， 由以下步 骤组成 ： 0041 第一步， 聚戊烯醇类脂提取 ： 将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子， 如银杏叶、 松 针叶、 桑叶中的一种， 优选银杏叶， 室温阴干， 破碎至100目以下粉末， 加入无水丙酮或C1 C3醇中任一种溶剂， 优选丙酮 ；

33、 叶子与溶剂按质量比为120混合， 在室温浸泡1072小 时， 优选 24 48 小时 ； 或叶子与溶剂按质量比为 1 20 混合后在 10 80经微波提取 或超声波提取 10 60 分钟， 优选超声波， 提取温度 10 40， 时间 10 30 分钟， 重复 提取两次， 合并提取液， 真空回收有机溶剂， 浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏 ； 0042 第二步， 脲醇溶液的制备 ： 将尿素放入无水甲醇中， 在充氮条件下水浴加热至尿素 全部溶解， 其中尿素与无水甲醇的重量体积比为1110， 如13、 14、 15、 16、 1 8， 回流温度为 40 90， 优选 40 60 ； 0043 第三步， 聚

34、戊烯醇类脂尿素包合物制备 ： 在脲醇溶液中加入聚戊烯醇类脂软膏和 填料， 填料选择硅胶、 活性炭、 聚酰胺树脂、 凹凸棒土、 氧化铝、 硅藻土中一种， 优选硅胶、 凹 凸棒土、 氧化铝。 聚戊烯醇类脂软膏填料脲醇溶液的质量比例0.111310 40， 在 40 90搅拌回流， 冷却至室温后， 在 -40 10结晶， 优选 -20 -10结晶， 抽 滤， 结晶物为聚戊烯醇类脂尿素包合物。 0044 第四步， 聚戊烯醇类脂纯化 ： 将聚戊烯醇类脂尿素包合结晶物装柱， 用非极性溶剂 进行洗脱， 优选正己烷、 石油醚， 洗脱体积为柱体积 1-4 倍， TLC 检测， 合并聚戊烯醇类脂洗 脱组分， 浓缩

35、后加入质量比为 1 6 30 无水丙酮， 优选 1 6 15 室温搅拌溶解 ； 40 200 目硅藻土， 与石英沙按质量比 1 1 10 混合， 得到混合助剂， 混合助剂与聚戊烯醇类 脂质量比为 0.5 20 100 混合， 优选 100 120 目， 在 -30 0搅拌 2 30 小时， 3000 20000 转 / 分钟离心机过滤， 优选 3000 10000 转 / 分钟清液回收有机溶剂， 浓缩 物为纯化聚戊烯醇类脂 ； 0045 第五步， 聚戊烯醇制备 ： 聚戊烯醇类脂加入到 5 -40氢氧化钠溶液中， 聚戊烯 醇类脂与氢氧化钠溶液质量比为 1 10 50， 在 30 90搅拌反应 0

36、.5 3 小时， 再用 正己烷等体积萃取反应液 2-5 次， 合并萃取相， 用等体积水反洗 2 5 次， 有机相减压浓缩， 浓缩物加入 5-20 倍硅胶混匀， 再用 2-6 倍正己烷室温浸泡 0.5-2 小时， 过滤， 滤液浓干， 浓 缩物为淡黄色聚戊烯醇油状物， 聚戊烯醇含量大于 95。 0046 第六步， 聚戊烯醇加氢衍生物制备 0047 将聚戊烯醇溶于二氯甲烷 - 甲醇溶液 ( 体积比为 8 1 1) 中， 聚戊烯醇与二氯 甲烷 - 甲醇溶液质量体积比 (g ml)1 20 100 ； 加入催化剂， 聚戊烯醇与催化剂质量 比为 80 200 1， 反应压力 8 20MPa， 反应时间为

37、18 48h， 反应温度 10 50； 反 应结束后， 过滤， 真空浓缩， 浓缩物为聚戊烯醇加氢衍生物。 0048 本实施例中采用不对称加氢催化剂， 如催化剂为 (S)-Ru(OAc)2(BINAP)、 Rh/ PVP-TiO2、 Ru(BINAP)(OAc)2， 对聚戊烯醇加氢反应进行了优化， 主要选取了反应压力、 反应 时间、 反应温度以及催化剂的用量， 氢化产物的转化率在 25 65， 最高达到 65。 说 明 书 CN 102775276 B 8 6/12 页 9 0049 本实施例中采用 TLC 检测和 HPLC 检测聚戊烯醇及其加氢衍生物， TLC 检测时碘蒸 气显色。HPLC 分

38、析色谱条件为色谱柱采用 KromasilC18 ODS-1(4.6mm150mm， 5m)， 流动 相为异丙醇甲醇 1 1(V/V)， 柱温 25， 流速 1mL/min， 检测器波长 210nm。采用 HPLC、 IR、 NMR 和 MS 表征聚戊烯醇及其加氢衍生物的结构。结果如图 2-9. 0050 实施例 2 聚戊烯醇加氢反应单因素试验 0051 1. 反应时间的选择 0052 固 定 反 应 温 度 30 ， 溶 剂 二 氯 甲 烷 甲 醇 2 1(V/V)， 催 化 剂 为 (S)-Ru(OAc)2(BINAP)， 聚戊烯醇与催化剂的质量比为 100 1， H2 压力 10MPa，

39、反应时间分 别为 3h、 6h、 9h、 12h、 18h、 24h、 36h， 反应过程中取上清液作 HPLC 检测， 反应转化率分别为 6.8、 16、 22、 32、 41、 56和 58。随着反应时间的增加， 产率逐步提高， 24h 后基 本稳定， 因此优选反应时间为 24h。 0053 2. 催化剂用量的选择 0054 固定反应温度20， 催化剂为Ru(BINAP)(OAc)2， 溶剂二氯甲烷甲醇31(V/ V)， H2压力 12MPa， 反应时间为 24h， 聚戊烯醇与催化剂的质量比分别取 50 1、 100 1、 200 1、 300 1、 500 1、 1000 1， 反应过程

40、中取上清液作 HPLC 检测， 反应转化率分别 为 48、 46、 40、 36、 24、 15， 随着催化剂用量的增加， 产率逐步提高， 当催化剂的 用量达到 100 1 时转化率稳定， 因此催化剂的用量优选 100 1。 0055 3. 反应压力的选择 0056 固定反应温度 40， 催化剂为 Rh/PVP-TiO2， 溶剂二氯甲烷甲醇 5 1(V/V)， 聚戊烯醇与催化剂的质量比为1001， 反应时间为24h。 反应压力分别为2MPa、 4MPa、 6MPa、 8MPa、 10MPa、 12MPa、 15MPa、 20MPa， 反应过程中取上清液作 HPLC 检测， 反应转化率分别为 6

41、、 18、 32、 43、 52、 60、 65、 68， 随着反应压力的增大转化率逐渐升高， 当压 力达到 12MPa 时转化率升高变缓， 2010MPa 时达到最高 68。考虑生产安全性， 反应压力优 选 10 15MPa. 0057 实施例 3 聚戊烯醇的纯化实验 0058 1. 取桑叶 1kg， 破碎至 40 目粉末， 加入无水丙酮 20kg， 在室温浸泡 50 小时， 过滤， 再加入15kg无水丙酮， 在40超声波提取20分钟， 合并提取液， 真空回收有机溶剂， 浓缩物 为聚戊烯醇类脂软膏 ； 0059 2. 筛选了硅胶、 味精脱色用活性炭、 聚酰胺树脂、 凹凸棒土等四种不同种类的吸

42、附 载体， 纯尿素以及尿素与吸附载体按质量比 10 1、 5 1、 5 2、 5 3、 1 1 等 5 种不同 质量配比对聚戊烯醇类脂软膏的纯化进行单因素筛选， 结果如表 1-2。 0060 表 1 尿素硅胶不同配比的纯化结果 0061 说 明 书 CN 102775276 B 9 7/12 页 10 0062 由表 1 以硅胶为载体， 石油醚为洗脱剂通过尿素与硅胶的不同配比， 实验结果可 以看出聚戊烯醇在纯尿素条件下得率达到 92.08， 纯度仅为 39.83， 尿素与硅胶质量比 为 5 1 纯化得到的银杏叶聚戊烯醇纯度最高， 其纯度为 72.34， 随着硅胶用量的增加其 纯度又逐渐变小，

43、得率也随之下降。 综合考虑其纯度和得率的因素， 得到以硅胶为载体的最 佳纯化条件为尿素硅胶质量比为 5 1， 其纯度为 72.34。 0063 表 2 不同载体的纯化结果 0064 0065 由表 2， 选择了硅胶、 味精脱色用活性炭、 凹凸棒土和聚酰胺树脂等四种不同的吸 附载体， 尿素与载体之间的质量比 5 1， 通过对比实验发现以硅胶为载体得到的产品纯度 最高， 味精脱色用活性炭次之， 聚酰胺树脂和凹凸棒土对产品纯度提高不大 ； 聚酰胺树脂、 凹凸棒土纯化得到的产品颜色较深显棕红色， 硅胶次之， 味精脱色用活性炭纯化得到的产 品颜色变淡为深黄色。综合考虑以硅胶为载体最佳。 0066 3 硅

44、胶柱层析纯化 0067 (1) 湿法装柱 0068 称取硅胶250g， 用石油醚浸泡过夜， 固定硅胶层析柱(柱规格325cm)， 在柱底 塞入薄薄的脱脂棉， 打开活塞， 在层析柱下方接好烧杯， 倾倒泡制好的硅胶悬浮液， 倾倒过 程中轻轻敲击柱体， 使气泡排除， 当硅胶装柱体积达到层析柱的 2/3 时停止装柱， 待液体缓 缓流出， 上层液面与硅胶面相平时， 关闭活塞， 在硅胶面上层铺置石英砂。 0069 (2) 干法上样 0070 用少量石油醚溶解后混入少量硅胶粉末， 搅拌成糊状， 烘干后上样。 0071 (3) 洗脱 0072 依次使用800mL石油醚、 400mL的石油醚乙酸乙酯991(V/

45、V)、 400mL的石油 醚乙酸乙酯 98 2(V/V)、 500mL 的石油醚乙酸乙酯 97 3(V/V) 进行洗脱。 0073 (4) 合并洗脱组分 说 明 书 CN 102775276 B 10 8/12 页 11 0074 得到的各组分洗脱液， 采用TLC定性检测， 展开剂为石油醚乙酸乙酯(91)， 经 碘蒸气显色， 合并回收溶剂得到银杏叶聚戊烯醇。如图 9. 0075 (5)HPLC定量分析 ： 采用KromasilC18 ODS-1(4.6mm150mm， 5m)， 流动相为异丙 醇甲醇 1 1(V/V)， 柱温 25， 流速 1mL/min， 检测器波长 210nm， 时间为 6

46、5min。经石 油醚乙酸乙酯973(V/V)洗脱所得的洗脱组分所含聚戊烯醇的纯度已达到90.22。 结果如表 3. 0076 表 3 聚戊烯醇 HPLC 纯度检测结果 0077 0078 实施例 4 聚戊烯醇及其加氢衍生物抑菌活性作用 0079 1. 实验菌种、 原料 0080 1.1 供试菌种 0081 大肠杆菌 (Ec.)、 金黄色葡萄球菌 (Sa.)、 黑曲霉菌、 沙门氏杆菌、 啤酒酵母菌和枯 草芽孢菌为实验室保留菌种。 0082 1.2 待测样品 0083 聚戊烯醇原料和加氢衍生物均由自己在实验室制备 0084 2 实验方法 0085 2.1 滤纸片法测定样品的抑菌活性 0086 (1

47、) 培养基的配制 0087 热溶解， 冷却后， 调节pH至7.07.2， 此为液体培养基， 在其中添加2.0g琼脂粉， 此为固体培养基， 121灭菌 20min。 0088 (2) 液体培养基接种与活化菌种 0089 打开净化工作台的紫外灭菌灯， 杀菌半小时后， 打开净化台的操作开关， 用灭菌后 的接种环取一环菌种溶入液体培养基中， 轻轻摩擦锥形瓶壁， 让菌落与接种环上分离， 取出 接种环， 封好锥形瓶， 轻轻振荡培养基， 使菌种分散均匀， 放于生化培养箱中， 37下活化 24h， 以此法分别培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。 0090 (3) 实验所需仪器的灭菌 0091 倒平板所用培养皿和装有

48、 6mm 滤纸片的培养皿用牛皮纸包好， 塞好胶塞的试管、 装有移液枪头的盒子分别用牛皮纸包好， 将配制好的生理盐水、 固体培养基分别用纱布和 牛皮纸封好。将其在 121， 100Pa 下高压灭菌 20min。 0092 (4) 调节菌落浓度 0093 将溶化的固体培养基倒入 20mL 左右于培养皿中， 置于净化操作台上， 自流平冷 却。 0094 取7支试管， 依次稀释活化好的菌悬液， 1号试管为原液经生理盐水稀释10倍后的 菌悬液， 2 号试管为稀释 100 倍的菌悬液， 依次稀释后， 第七号试管为稀释 107 倍的菌悬液。 0095 移取100L17号试管中的菌悬液涂布固体培养基， 静置使

49、其渗透于培养基中， 后倒置培养皿， 于生化培养箱中 37培养 24h。 说 明 书 CN 102775276 B 11 9/12 页 12 0096 根据菌落计算法则 ： 菌落形成单位 cfu 稀释倍数菌落数， 计数可数菌落平皿， 推算每皿菌落数， 选择菌落涂布浓度为 105cfu/mL。 0097 (5) 测试样品的配制 0098 用正己烷分别将聚戊烯醇和加氢衍生物配制成 2mg/mL 溶液， 将经过灭菌的滤纸 片浸于样品溶液中， 半小时后测定其抑菌活性。 0099 (6) 滤纸片法测定供试样品的抑菌活性 0100 用移液器移取 100L 菌悬液涂布于液体培养基， 放置一段时间后待菌液渗透于 培养基后， 以浸有待测样品的滤纸片轻轻贴服于皿中， 注意不要用力过猛， 将其陷于固体培 养基中， 3 片滤纸片等距均匀， 以两皿对照平行试验， 37下倒置生化培养 24h， 测量样品对 Sa. 和