基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510703249.3 (22)申请日 2016.02.22 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 崔大祥 张晶璞 (74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 31236 代理人 徐红银 郭国中 (54) 发明名称 基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测 法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 AgNCs/HpDNA 探针的 microRNA SDA 检测法， 该

2、法利用发夹型 DNA 模板 合成银纳米团簇， 并将其作为新型分子信标， 在引 物垂悬端富 G 序列介导的链取代等温扩增反应 中， 借助杂交产生的富 G 荧光增强效应， 实现对胃 癌血浆miRNA标志物的单个检测。 该法特异性高、 反应时间短、 用料少、 操作步骤简便， 为建立快速 简便的新型 miRNA 检测方法开辟了新方向。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 105483212 A 2016.04.13 CN 105483212 A 1.一种HpDNA， 其特征在于， 序列如SEQIDN

3、O： 1所示。 2.一种基于权利要求1所述HpDNA的AgNCs/HpDNA， 其特征在于， 所述AgNCs/HpDNA是通 过如下方法制备： 将AgNO3溶液、 NaBH4溶液加入HpDNA中， 震荡， 静置， 即得AgNCs/HpDNA。 3.根据权利要求2所述的AgNCs/HpDNA， 其特征在于， 所述HpDNA、 AgNO3、 NaBH4的终摩尔 浓度之比为1:17:17； 所述震荡的时间为45s1min； 所述静置具体为暗环境中室温下放置18h。 4.一种根据权利要求2所述的AgNCs/HpDNA在检测胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3p中 的应用， 所述miR-19b-3

4、p的序列如SEQIDNO： 2所示。 5.一种基于权利要求2所述AgNCs/HpDNA的胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3pSDA检测 方法， 其特征在于， 所述检测方法包括： 以所述AgNCs/HpDNAs为分子探针， 在含富G序列垂悬 端的引物作用下进行SDA反应， 借助富G序列杂交荧光增强效应， 分别在430nm及490nm波长 激发下， 实现miR-19b-3p检测。 6.根据权利要求5所述的胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3pSDA检测方法， 其特征在 于， 该引物序列如SEQIDNO： 3。 7.根据权利要求5所述的胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3pSDA

5、检测方法， 其特征在 于， 所述SDA反应的总体积为50 L， 其中， 8.根据权利要求7所述的胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3pSDA检测方法， 其特征在 于， 所述缓冲液1Nb2.1包括50mMNaAc、 10mMTris-HAc、 10mMMg(Ac)2和100 g/mLBSA， 缓冲液pH7.9。 9.根据权利要求7所述的胃癌血浆miRNA标志物miR-19b-3pSDS检测方法， 其特征在 于， 所述SDA反应的反应条件为55环境中孵育55min。 10.一种根据权利要求5至9任一项所述的检测方法在单个碱基错配核酸序列检测中的 应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10

6、5483212 A 2 基于AgNCs/HpDNA探针的microRNASDA检测法 技术领域 0001 本发明涉及医学和分子诊断领域， 是一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNASDA 检测法， 特别是涉及一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇探针结合链取代等温扩增的 单个microRNA检测方法。 背景技术 0002 MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码小RNA分子， 其可通过与mRNA 之间精确或非精确互补配对， 参与调控mRNA的表达水平。 多个miRNA可协同调控一个mRNA， 或一个miRNA也可同时影响多个靶基因， 从而形成一个高度复杂的调

7、控网络， 影响着从分子 到细胞再到组织水平的一系列生物功能。 miRNA表达异常与疾病及癌症发生密切相关。 尤为 重要的是， 已发现多种miRNA标志物可用于癌症早期诊断、 预后及进程监控。 其中， 上海交通 大学崔大祥课题组用微阵列芯片miRNA全基因组扫描结合qRT-PCR技术筛选得到miR-16-5p 和miR-19b-3p两种血浆miRNA标志物， 并指出二者可用于指示胃癌发生发展进程(Zhang, J.,Song,Y.,Zhang,C.,etal.(2015)CirculatingmiR-16-5pandmiR-19b-3pastwo novelpotentialbiomarkers

8、toindicateprogressionofgastric cancer.Theranostics,5,733-745.)。 其中， qRT-PCR是进行miRNA定量检测的金标准， 但由 于其需分步进行逆转录和热循环扩增及检测， 导致该法耗时且费力。 所以仍有必要进一步 发展便捷快速的miRNA检测新方法。 0003 等温扩增技术的出现使核酸扩增技术因摆脱了热循环变性步骤和仪器的束缚， 而 受到了众多研究者的关注。 作为第一代等温扩增技术， 链取代扩增Strand-displacement amplification(SDA)受DNA修复中碱基切除修复机制的启发迅速发展起来， 至今， 已发

9、展出 包括多引物SDA(multiplyprimedSDA)， 剪切诱导SDA(nicking-initiatedSDA)， 环介导 等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)和结构转换诱发SDA (structure-switching-triggeredSDA)等多种亚型。 其中， 由于结构转换诱发SDA不需要 特殊设计剪切位点和额外使用剪切酶， 而仅通过待测靶核酸与发夹结构探针的结合并导致 后者打开而诱导SDA反应， 特别适合对短链核酸分子及miRNA进行检测。 目前， 常用于结构 转换诱发SDA的检测探针是一端连接有荧光染料及另一端连

10、接荧光淬灭子的发夹型DNA分 子信标(molecularbeacon(MB)， 但由于其需要对DNA进行偶联修饰， 使检测成本增高， 检 测应用受限。 0004 随着以DNA模板合成银纳米团簇(DNA-templatedsilvernanoclusters(AgNCs/ DNA)的兴起， 使得可能发展出除荧光染料或量子点修饰以外的新型核酸荧光探针。 银纳米 团簇是仅由几个或几十个银原子组成的直径小于1nm的集合体， 其易于合成， 且荧光可调 控。 更重要的是， AgNCs/DNA中由于DNA模板的引入， 可仅通过改变DNA序列、 长度和构象来获 得特定的光物理学特性。 近来， 已有多种DNA序

11、列合成AgNCs用于核酸或miRNA检测。 Yang和 Shah以5 -CCTCCTTCCTCC-3 为AgNCs成核区序列， 并连接以miRNA杂交序列， 借助该探针的 荧光淬灭效应， 对miR-160和miR-172进行了检测(Yang,S.W.andVosch,T.(2011)Rapid 说明书 1/7 页 3 CN 105483212 A 3 detectionofmicroRNAbyasilvernanoclusterDNAprobe.Anal.Chem.,83,6935- 6939.)。 Liu利用指数等温扩增反应生成用于红色荧光AgNCs合成的DNA模板， 并借助荧光强 度与DN

12、A模板浓度间关系， 对miR-141进行了测定。 这些检测或借助荧光淬灭效应， 或分别进 行信号扩增和信号检测， 导致特异性不好， 或操作繁琐(Liu,Y.-Q.,Zhang,M.,Yin,B.- C.andYe,B.-C.(2012)AttomolarultrasensitivemicroRNAdetectionbyDNA- s ca f f o ld ed s i l v e r - na n o c l us te r p r o be ba s ed o n i s o t h e rm a l amplification.Anal.Chem.,84,5165-5169.)。 而随着Y

13、eh报道了杂交介导的富G序列对 AgNCs/DNA的荧光增强效应， 使建立基于light-up信号的核酸检测平台成为可能(Yeh, H.C.,Sharma,J.,Han,J.J.,Martinez,J.S.andWerner,J.H.(2010)ADNA-silver nanoclusterprobethatfluorescesuponhybridization.NanoLett.,10,3106- 3110.)。 但是， 单纯的杂交检测虽然简便， 却也很难确保较好的特异性。 因而， 为进一步提高 检测特异性， 简化操作步骤， 我们首次将基于AgNCs/DNA的富G序列荧光增强效应与结构转 换

14、诱发SDA扩增技术结合， 并研究二者的相互作用， 以期实现可调控、 简便及高特异检测。 发明内容 0005 为了克服上述现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种基于AgNCs/HpDNA探针 的miRNASDA检测法， 具体是一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇(AgNCs/HpDNA)探针 结合SDA反应对miRNA进行检测的方法， 即针对前期筛选得到的miRNA标志物miR-19b-3p， 设 计并构建AgNCs/HpDNA探针， 验证该探针的富G序列荧光增强性能， 在此基础上， 对miRNA标 志物进行单个检测， 及单个碱基错配检测。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

15、0007 第一方面， 本发明提供一种HpDNA， 序列如SEQIDNO： 1所示。 0008 第二方面， 本发明提供一种基于所述HpDNA的AgNCs/HpDNA， 所述AgNCs/HpDNA是通 过如下方法制备： 0009 将AgNO3溶液、 NaBH4溶液加入HpDNA中， 震荡， 静置， 即得AgNCs/HpDNA。 0010 优选地， 所述HpDNA、 AgNO3、 NaBH4的终摩尔浓度之比为1:17:17； 所述震荡的时间为 45s1min， 震荡具体为剧烈震荡； 所述静置具体为暗环境中室温下放置18h。 0011 第三方面， 本发明提供一种所述的AgNCs/HpDNA在检测胃癌血

16、浆miRNA标志物miR- 19b-3p中的应用， 所述miR-19b-3p的序列如SEQIDNO： 2所示。 0012 第四方面， 本发明提供一种基于所述AgNCs/HpDNA的胃癌血浆miRNA标志物miR- 19b-3pSDA检测方法， 所述检测方法包括： 以所述AgNCs/HpDNAs为分子探针， 在含富G序列 垂悬端的引物作用下进行SDA反应， 借助富G序列杂交荧光增强效应， 实现miR-16-5p检测， 该引物序列如SEQIDNO： 3。 0013 优选地， 所述SDA反应的总体积为50 L， 其中， 说明书 2/7 页 4 CN 105483212 A 4 0014 0015 优

17、选地， 所述缓冲液1Nb2.1包括50mMNaAc、 10mMTris-HAc、 10mMMg(Ac)2和 100 g/mLBSA， 缓冲液pH7.9(25)。 0016 优选地， 所述SDA反应的反应条件为： 在55环境中孵育55min。 荧光检测的激发波 长为490nm和430nm。 第五方面， 本发明提供所述的检测方法在单个碱基错配核酸序列检测 中的应用。 0017 本发明所采用的技术方案是： 0018 如图1所示， 用于合成AgNCs的发夹型探针(GRE19b(5s)C)含三个区， 分别为颈区 HpS、 环区HpL和3 垂悬区HpGO。 其中， 特别设计的垂悬区富含C序列用于合成AgN

18、Cs， 且HpGO (5 -CCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCC-3 )在杂交作用下与互补链中的富G垂悬序列靠近而得到绿 色荧光增强信号。 用于miR-19b-3p检测的探针为GRE19b(5s)C， 其序列如SEQIDNO： 1所示。 0019 而待测miRNA序列分别与5 端颈部HpS部分序列及环区HpL互补， 对应序列区域分 别为MSc和MLc， 该设计有利于更好地打开发夹结构， 相应的靶miRNA为miR-19b-3p， 其序列 如SEQIDNO： 2所示。 0020 引物序列也由两个区域组成， 分别为颈区互补区(PGSc,5 -TATACG-3 )和富G序列 垂悬区(PO:5

19、 -GGGTGGGGTGGGGTGGGG-3 )， 相应HpDNA的引物为Pri6(7s)， 其序列如SEQID NO： 3所示。 0021 miRNA的检测机制如下。 首先， 在发夹型探针上生成AgNCs， AgNCs/GRE19b(5s)C探 针在490nm波长激发下无荧光发射或较弱。 在有靶miRNA时， 其通过与AgNCs/HpDNA杂交， 而 打开发夹结构。 随后， 引物杂交至发夹探针颈部3 端， 在聚合酶和dNTP的共同作用下， 引导 聚合酶链反应， 延伸得到HpDNA的互补链HpDNAc(GRE19b(5s)G， 其序列如SEQIDNO： 4所 示)， 从而使杂交双链AgNCs/

20、HpDNA-HpDNAc中富G垂悬互补序列与AgNCs靠近， 并得到位于该 波长处的探针的荧光增强信号。 同时， 先前与HpDNA结合的靶miRNA序列被取代并释放， 进入 下一个循环反应。 相反， 在没有靶miRNA时， HpDNA保持闭合状态， 引物无法结合， 进而也无法 扩增生成HpDNAc， 最终， 无法获得该波长处的荧光增强信号。 0022 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0023 第一， 基于AgNCs/HpDNA探针及其富G序列荧光增强效应， 可实现miRNA的高特异性 检测。 相比SYBRGreen随意插入双链核酸， 及MB只要发夹探针打开即可产生荧光信号响应 的机制，

21、 本发明所用探针仅在形成带富G垂悬序列的互补序列并与之杂交后， 才会生成荧光 增强信号， 发夹探针打开及任何中间体杂交双链均不会产生该信号， 因而具有高特异性。 0024 第二， 杂交介导的富G序列增强效应对一个反应能产生双重检测信号， 即荧光增强 说明书 3/7 页 5 CN 105483212 A 5 程度和荧光淬灭程度， 为检测产物判断提供更丰富的信息。 0025 第三， 发夹型DNA既作为SDA反应的模板， 又作为AgNCs的生成模板， 缩短了反应时 间并节省了反应材料。 通过将AgNO3与NaBH4按照一定比例与发夹型DNA混合， 即可制备得到 AgNCs/HpDNA探针。 尽管该探

22、针需要静置18h以使AgNCs充分老化， 但其可以一次性大量制备 并长期储存， 且静置时间也可缩短至4h。 在此基础上， SDA反应时间仅一步完成， 时长 55min， 也可进一步缩短至30min。 附图说明 0026 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述， 本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显： 0027 图1为检测原理示意图； 0028 其中， HpDNA模板上生成AgNCs； 靶miRNA杂交互补于HpDNA的5 颈区和环区； HpDNA打开； 富G垂悬引物结合于HpDNA3 颈区； 在聚合酶作用下延伸形成富G垂悬互补 链HpDNAc； 靶miRNA释放， 进入下一

23、循环SDA反应； 0029 图2为富G序列杂交荧光增强效应验证； 其中， 0030 图A.AgNCs/GRE19b(5s)C探针及其杂交产物荧光发射谱； 0031 GRE19b(5s)C-Pri6(7s)： AgNCs/GRE19b(5s)C与Pri6(7s)杂交， 0032 GRE19b(5s)C-Pri6(7s)-h19b： AgNCs/GRE19b(5s)C与Pri6(7s)及miR-19b-3p杂 交， 0033 GRE19b(5s)C-G： AgNCs/GRE19b(5s)C与GRE19b(5s)G杂交； 0034 图B.反应产物凝胶电泳图； 0035 泳道1-3依次为不含AgNCs

24、的核酸标志物GRE19b(5s)C、 GRE19b(5s)G及GRE19b (5s)C-G； 泳道4-6依次为GRE19b(5s)C、 GRE19b(5s)C-Pri6(7s)、 GRE19b(5s)C-Pri6 (7s)-h19b及GRE19b(5s)C-G)； 0036 图3为梯度浓度单个miRNA检测； 其中， 0037 A、 B： 490nm波长激发下miR-19b-3p检测荧光发射光谱及荧光发射峰增强值与待测 核酸浓度间关系； 0038 C、 D： 430nm波长激发下miR-19b-3p检测荧光发射光谱及荧光发射峰减弱值与待测 核酸浓度间关系； 0039 图4为单个碱基错配检测；

25、其中， 0040 A、 B： 490nm波长激发下基于GRE19b(5s)C检测探针的待测核酸的荧光发射光谱及 荧光发射峰增强值； 0041 C、 D： 430nm波长激发下基于GRE19b(5s)C检测探针的待测核酸的荧光发射光谱及 荧光发射峰减弱值； h19b指miR-19b-3p， h16指miR-16-5p， h19bDM ， 分别指1个碱基错 配的miR-19b-3p的拟似物； 0042 图5为miR-19b-3p实时检测： 基于GRE19b(5s)C检测探针的不同浓度miR-19b-3p 的等温扩增曲线(A)、 熔解曲线(B)及熔解温度(C)； 0043 图6为基于GRE19b(5

26、s)C探针检测miR-19b-3p和错配核酸的凝胶电泳图； 其中， miR-19b-3p浓度依次为0(泳道4)， 0.5 M(泳道5)， 2.5 M(泳道6)， 错配核酸为0.5 MmiR- 说明书 4/7 页 6 CN 105483212 A 6 16-5p(泳道7)及h19bDM (泳道8)和h19bDM(泳道9)， 泳道1-3依次为不含AgNCs的核酸 标志物GRE19b(5s)C、 GRE19b(5s)G及GRE19b(5s)C-G。 具体实施方式 0044 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。 以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 应

27、当指出的是， 对本领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进。 这些都属于本发明 的保护范围。 0045 本申请所涉序列如下所示： 0046 GRE19b(5s)C(SEQIDNo.1)： tatacgtcagttttgcatggatttgcacaactgacgtata cccccccccccccccgcccgcc 0047 hsa-miR-19b-3p(SEQIDNo.2)： ugugcaaauccaugcaaaacuga 0048 Pri6(7s)(SEQIDNo.3)： gggtggggtggggtggggtatacg 0049 GRE19b( 5

28、s )G( SEQIDNo .4 )： gggtggggtggggtggggtatacgtcagt tgtgcaaatccatgcaaaactgacgtata 0050 h19bDM (SEQIDNo.5)： tgtgcaaatccatgcaaaaccga 0051 h19bDM(SEQIDNo.6)： tgtgcaaatcgatgcaaaactga 0052 实施例1、 检测方案可行性验证 0053 (1)AgNCs/HpDNAs探针合成 0054 按照Yeh文中方法进行合成。 HpDNAs(GRE19b(5s)C)， AgNO3， NaBH4起始浓度分别为 100 M， 1mM和1mM。

29、磷酸盐缓冲液储备浓度为200mM(Pi,pH8.0)。 等摩尔的AgNO3和NaBH4依次 按照1GRE19b(5s)C:17AgNO3:17NaBH4的比例加入到HpDNA中， 使三者终浓度分别为15 M, 250 M和250 M(Pi,20mM,pH8.0)。 其中， NaBH4需要新鲜配置， 并最后在30s内快速加入到Ag+/ HpDNA的混合液中， 之后， 剧烈震荡45s1min。 所得溶液于暗环境中室温下放置18h， 以得到 稳定的AgNCs/HpDNAs探针。 0055 (2)富G序列杂交荧光增强效应验证 0056 向所得到探针AgNCs/GRE19b(5s)C中， 分别加入相应的

30、一定量的引物(Pri6 (7s)， 或引物(Pri6(7s)与靶miRNA(miR-19b-3p)的混合物， 或互补链HpDNAc(GRE19b (5s)G,SEQIDNO： 4)， 使得到等摩尔的探针与上述核酸的混合液， 之后在55环境中孵育 55min。 最后， 4暗环境中放置1h以上， 即可在荧光分光光度计上进行荧光检测。 0057 (3)结果 0058 在SDA反应中， HpDNAc、 引物、 靶miRNA均可与AgNCs/HpDNA杂交， 为此， 我们分别测 定了上述杂交产物的荧光。 如图2所示， AgNCs/GRE19b(5s)C探针仅在与其互补链杂交形成 GRE19b(5s)C-

31、G时， 才会在490nmex/570nmem处产生显著的荧光增强， 而其它核酸的杂交 包括引物及靶miRNA均不会得到如此显著的增强信号(图2(A)。 同时， 凝胶电泳结果显示 AgNCs/HpDNA-HpDNAcs形成最明亮的双链条带， 而靶miRNA的加入也可形成少量双链样条 带， 引物的加入不会产生双链样条带(图2(B)。 上述结果表明， 富G序列荧光增强效应仅发 生在AgNCs/HpDNA-HpDNAcs上， 而不会出现于SDA反应的任何中间体上， 且确实由靶miRNA而 非引物打开HpDNA， 证实该检测策略可行。 另外， 值得注意的是， 凡是有AgNCs/GRE19b(5s)C 说

32、明书 5/7 页 7 CN 105483212 A 7 的泳道中均产生一额外条带， 迁移速度快于GRE19b(5s)C， 可能是在AgNCs作用下， 使该探 针自身结构不稳定， 部分降解产生的片段。 0059 实施例2、 单个miRNA检测 0060 (1)AgNCs/GRE19b(5s)C探针合成 0061 按照(1)中所述步骤制备AgNCs/GRE19b(5s)C探针， 但GRE19b(5s)C终浓度为5 M， AgNO3和NaBH4加入量仍按1GRE19b(5s)C:17AgNO3:17NaBH4进行。 0062 (2)单个miRNA检测 0063 每个反应管中为50 LSDA反应液，

33、包含以下成分： 1Nb2.1自制缓冲液(缓冲液pH 7.925)(50mMNaAc、 10mMTris-HAc、 10mMMg(Ac)2和100 g/mLBSA)200 MdNTPs、 10U Bsu聚合酶(无DTT)、 AgNCs/GRE19b(5s)C探针(2.5 MHpDNA)、 不同浓度的靶miRNA(0.05- 2.5 MmiR-19b-3p)以及2.5 M引物Pri6(7s)。 所得反应液置于55条件下孵育55min， 随后 于4暗环境中保存， 即可在荧光分光光度计上进行荧光检测， 实验重复3次。 另外， 基于 AgNCs/GRE19b(5s)C探针的反应液还在实时荧光定量PCR仪

34、Bio-RadiQ5上进行了检测， 利 用FAM色团， 在55条件下孵育55min， 同时采集实时qPCR信号， 随后以1/30s的速率从25 升温至95， 绘制高分辨率溶解曲线(HRM)。 0064 (3)结果 0065 梯度浓度单个miRNA检测结果如图3所示。 随着miR-19b-3p浓度的增加， 反应产物 在490nm波长激发下荧光逐渐增强， 在430nm波长激发下荧光逐渐减弱。 绘制点图后， 可以看 到变化呈线性。 基于上述探针miR-19b-3p检测限为0.05 M( ex490nm)和0.1 M( ex 430nm)。 0066 基于AgNCs/GRE19b(5s)C探针的miR

35、-19b-3p实时检测显示三种浓度0 M， 1 M和 2.5 M的反应液均具有线性扩增曲线(图4)， 且在20min内空白样不产生背景信号。 此结果 证实了SDA反应的顺利进行。 此外， 该探针还可用于绘制HRM曲线， 得到有靶miRNA的反应液 其产物Tm值为55。 0067 凝胶电泳结果显示梯度浓度0 M， 0.5 M和2.5 M的反应液双链产物AgNCs/HpDNA- HpDNAcs条带逐渐明亮， 剩余单链AgNCs/HpDNA条带逐渐变微弱(图6)， 也表明了基于AgNCs/ GRE19b(5s)C探针的单个miRNA检测SDA反应的顺利进行。 0068 实施例3、 单个碱基错配核酸检

36、测 0069 (1)单个碱基错配核酸检测 0070 按照实施例2中(1， 2)所述步骤进行， 仅将待测核酸改为0.5 M错配核酸， 即基于 AgNCs/GRE19b(5s)C探针检测miR-16-5p， h19bDM (序列SEQIDNO： 5)和h19bDM(序列 SEQIDNO： 6)。 0071 (2)结果 0072 错配核酸检测结果如图5所示。 可以看到， 在基于AgNCs/GRE19b(5s)C探针的检测 中， 仅miR-19b-3p( ex490nm)显示了最高的荧光增强信号， 其余样本在该激发波长处的 荧光增强均较弱， 此外， 基于AgNCs/GRE19b(5s)C探针在430n

37、m波长激发下， miR-19b-3p和 h19bDM 同样表现为荧光淬灭， 而miR-16-5p和h19bDM 出现相反的荧光增强。 综上可见， 基于AgNCs/GRE19b(5s)C探针的检测表现出一定的特异性， 但在检测miRNA与HpDNA颈区互 补部分(MSc区)上的一个碱基错配上表现不甚稳定。 说明书 6/7 页 8 CN 105483212 A 8 0073 凝胶电泳结果显示错配核酸样品条带与空白样品条带一致(图6)， 进一步验证了 该检测方法的特异性。 0074 以上对本发明的具体实施例进行了描述。 需要理解的是， 本发明并不局限于上述 特定实施方式， 本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改， 这并不影 响本发明的实质内容。 说明书 7/7 页 9 CN 105483212 A 9 0001 序列表 1/2 页 10 CN 105483212 A 10 0002 序列表 2/2 页 11 CN 105483212 A 11 图1 图2 说明书附图 1/4 页 12 CN 105483212 A 12 图3 说明书附图 2/4 页 13 CN 105483212 A 13 图4 图5 说明书附图 3/4 页 14 CN 105483212 A 14 图6 说明书附图 4/4 页 15 CN 105483212 A 15