一株木质纤维素类物质高效降解菌M2及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510861433.0 (22)申请日 2015.12.01 CGMCC No.10166 2014.12.12 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 北京德瑞丰农业科技有限责任公司 地址 100094 北京市海淀区永丰中路颐和山 庄芳辉园 1-10 (72)发明人 付海燕 杨峰山 孙永帅 吴奇 丁仕波 杨微 刘春光 王鲲鹏 王庆华 魏才强 曲金玲 张慧 于文全 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 侯静 (54) 发明名称 一株木质纤维素类物

2、质高效降解菌 M2 及其 应用 (57) 摘要 一株木质纤维素类物质高效降解菌 M2 及其 应用， 它涉及一株木质纤维素类物质高效降解 菌 M2 及其应用。它为芽孢杆菌 (Bacillus sp.) M2， 于 2014 年 12 月 12 日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号 CGMCC No.10166。 它用于降解木质纤维素类物质。 本发明 菌株增殖迅速， 适应性强， 应用广泛 ； 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2发酵处理后的袋料木耳废料的 失重率在 35以上， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.) M2 发酵处理后的玉米秸秆的失重率在 30以上

3、 ； 具有木质素降解能力， 可以高效降解木质素。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书19页 序列表2页 附图5页 CN 105385629 A 2016.03.09 CN 105385629 A 1/1 页 2 1.一株木质纤维素类物质高效降解菌 M2， 其特征在于它为芽孢杆菌 (Bacillus sp.) M2， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝阳区北 辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 12 月 12 日， 保藏号 CGMCC No.1016

4、6。 2.如权利要求1所述的一株木质纤维素类物质高效降解菌M2的应用， 其特征在于它用 于降解木质纤维素类物质。 权 利 要 求 书 CN 105385629 A 2 1/19 页 3 一株木质纤维素类物质高效降解菌 M2 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株木质纤维素类物质高效降解菌 M2 及其应用。 背景技术 0002 我国是一个农业大国， 农业废弃物产生量极其巨大， 由于受经济效益和技术普及 的限制， 农业废弃物大都粗放低效利用且闲置状况严重， 造成资源浪费和环境污染， 废弃物 已经成为中国最大的污染源。而在农业废弃物存在着大量的木质纤维素， 亟待人们去开发 利用。 0003 木

5、质纤维素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机可再生资源， 也是微生物 最难降解的成分之一。 近年来， 某些降解木质素的真菌已开始在实际中得以应用， 但仍有待 进一步开发。木质素微生物降解的应用主要有 ： 造纸工业 ； 饲料工业 ； 发酵与食品工业 ； 生 物物肥料环境保护 ； 木素酶的生物漂白技术， 等等。 0004 目前农业有机固体废弃通常通过能源化利用、 有机肥料、 禽畜饲料、 可食用菌培养 基料和工业原料进行利用。在利用农业废弃物的生产实践中， 物理、 化学和生物处理方法 经常结合使用， 而其中生物处理方法尤其是利用微生物处理代表了今后的发展趋势。生物 方法就是指利用木质素降解酶去降解

6、木质纤维材料中的木质素， 从而使木质素 - 半纤维 素 - 纤维素结构解体， 纤维素得以暴露出来供后续步骤处理与传统的机械、 物理化学类法 相比， 生物处理法的优点是能耗低， 所需环境条件温和， 避免了传统化学处理、 机械处理技 术等耗能较多、 存在环境污染等缺点， 从成本和设备角度考虑， 生物脱木质素法占有独特的 优势。 但是， 目前的生物处理法有一个很大的弱点限制了它的应用， 这就是生物处理法中的 关键角色 - 木质素降解酶的活性普遍不高， 从而导致处理效率较低， 如果能利用基因工程 和传统的生物技术对菌种和酶进行改造， 提高酶活力， 降低酶成本， 生物法脱木质素法则有 望应用于大规模工业

7、生产。 0005 而目前应用最广泛的是微生物菌肥， 微生物菌肥作为一种新的农业技术措施， 在 发展高产、 优质、 高效农业中的作用逐渐被人们所认识。 传统的微生物肥料己经在大面积推 广应用中， 新型的微生物菌肥品种不断开发出来。微生物肥是由具有特殊效能的微生物经 过发酵而制成的、 含有大量有益微生物、 对作物有特定肥效的特定微生物制品。 微生物肥料 利用微生物的生命活动， 将作物不能吸收利用的物质转化为可被作物吸收利用的营养物， 改善作物的营养条件， 有些兼有刺激作物生长或增强抗病性的作用， 以提高作物产量， 改善 农产品品质。 它既能增加农产品的出日创汇， 又具有工农业有机废物有效利用、 防

8、止环境污 染、 改进土壤结构、 提高土壤肥力和保护生态良性循环的巨大社会效益和生态效益。 0006 国内的研究大多数为真菌降解木质纤维素。但是， 利用真菌降解木质纤维素普遍 存在酶活力较低的问题。由于芽孢杆菌繁殖较快， 发酵周期短， 可应用于工业生产， 且芽孢 杆菌产生的纤维素酶一般作用条件为中性或偏碱性， 这在制浆、 造纸和洗涤剂工业等污染 行业的废水治理上有着潜在的应用前景， 因此从芽孢杆菌中筛选出有效菌株应用于木质纤 维素降解具有一定的实际意义及开发前景。 说 明 书 CN 105385629 A 3 2/19 页 4 发明内容 0007 本发明的目的是为了提供一株木质素高效降解菌 M2

9、 及其应用。 0008 本发明的一株木质素高效降解菌为芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)M2， 保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期为 2014 年 12 月 12 日， 保藏号 CGMCC No.10166。 0009 本发明的一株木质素高效降解菌 M2 用于降解木质素上。 0010 本发明的有益效果如下 ： 0011 本发明的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 增值迅速， 适应性强， 应用广泛耐盐性为 NaCl浓度10， 耐热性为70； 连续传代培养10次， 菌株生长情况、 产酶情况以及酶活力稳 定， 无退

10、化现象 ； 对袋料木耳废料和玉米秸秆具有明显的降解效果， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理后的袋料木耳废料的失重率在 35以上， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理后的玉米秸秆的失重率在 30以上 ； 具有木质素降解能力， 可以高效降解木质 素， 经复合微生物菌剂发酵处理的玉米秸秆中木质素含量是经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理的玉米秸秆中木质素含量的2.8倍， 作为单一菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2对 木质素的降解能力强于复合微生物菌剂 ； 在降解样品时， 不影响样品中的主要元素含量， 不 会导致试样中的全氮、 全磷

11、、 全钾、 速效磷和速效钾含量变化， 保存样品肥效。 0012 本发明从袋料木耳废料、 林间朽木和林间土壤中分离筛选出能够以木质素为唯一 碳源生长的原始菌株， 确定对木质素的降解能力以及种属关系， 为将来复合微生物菌剂构 建奠定基础。将为我国农业资源的有效化利用提供有力帮助。 附图说明 0013 图 1 为本发明芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)M2 培养 12h 后的扫描电子显微镜图 (20,000) ； 0014 图 2 为 16S rDNA 序列 PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图其中， 1 泳道为 Maker DL2000， 2 泳道为菌株 M2 ； 0015 图 3 为回收后的

12、 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测图其中， 1 泳道为 Maker DL2000， 2 泳道为菌株 M2 ； 0016 图 4 为阳性克隆子筛选的琼脂糖凝胶电泳检测图其中， 1 泳道为 Maker DL2000， 2 泳道为菌株 M2 ； 0017 图 5 为本发明芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 的系统进化树 ； 0018 图 6 为本发明芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 对袋料木耳废料的失重率图 ； 0019 图 7 为本发明芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 对玉米秸秆的失重率图 ； 0020 图 8 为本发明芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 菌株降解

13、后玉米秸秆中各组分含量柱 状图 ； 其中， 1 为木质素含量柱状图 ； 2 为纤维素含量柱状图 ； 3 为半纤维素含量柱状图 ； 0021 图 9 为本发明芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 菌株发酵处理后玉米秸秆中全氮全磷 和全钾含量柱状图 ； 其中， 1 为全氮含量柱状图 ； 2 为全磷含量柱状图 ； 3 为全钾含量柱状 图 ； 0022 图10为本发明芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2菌株发酵处理后玉米秸秆中速效磷含 说 明 书 CN 105385629 A 4 3/19 页 5 量柱状图 ； 0023 图11为本发明芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2菌株发酵处理后玉

14、米秸秆中速效钾含 量柱状图。 具体实施方式 0024 具体实施方式一 ： 本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解菌 M2， 它为芽 孢杆菌 (Bacillus sp.)M2， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏 地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 12 月 12 日， 保藏号 CGMCC NO.10166。 0025 本实施方式的芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2为革兰氏阳性菌， 该菌株菌体形态为杆 状， 菌体大小为 0.68 0.761.9 2.4m， 形成芽孢， 有鞭毛， 无荚膜， ； 在 LB 培养基上 形成圆形、 透明

15、、 白色、 扁平、 表面粗糙、 边缘锯齿状的菌落 ( 如图 1 所示 )。 0026 该菌株的生理生化反应结果共 20 项、 30 个指标 ； 结合形态与生理生化反应结果， 比对 伯杰氏芽孢杆菌鉴定手册 确定该菌株的种属， 结果如表 1 所示。 0027 根据 常见芽孢杆菌系统鉴定手册 和 伯杰芽孢杆菌手册 对分离出的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 进行进行革兰氏染色、 氧化酶、 接触酶、 荧光色素、 甲基红、 七叶苷溶解、 明胶液化、 石蕊牛乳胨化及产酸、 脂酶、 淀粉水解、 V.P. 测定、 柠檬酸盐利用、 纤维素降解、 3- 酮基乳糖利用、 苯丙氨酸脱氨酶、 色氨酸脱氨酶、

16、耐热热性、 耐盐性生理生化实验的检测 和鉴定。 结果表明芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2为革兰氏阳性菌， 耐盐性为NaCl浓度10， 耐热性为 70， 可产生接触酶和脲酶， 但不能产生氧化酶、 脂酶、 苯丙氨酸脱氨酶、 色氨酸脱 氨酶和荧光色素， 甲基红、 柠檬酸盐利用、 V.P.试验、 糖醇发酵(甘露糖)、 石蕊牛乳胨化、 七 叶苷溶解和石蕊牛乳产酸表现为阳性， 淀粉水解、 明胶液化、 纤维素降解和 3- 酮基乳糖利 用表现为阴性。 0028 表 1 菌株 M2 的形态学特征与生理生化鉴定结果 0029 说 明 书 CN 105385629 A 5 4/19 页 6 0030 003

17、1 本实施方式的木质素高效降解菌为芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)M2 的筛选方法如 下 ： 0032 1、 筛选方法 说 明 书 CN 105385629 A 6 5/19 页 7 0033 取 10g 样品在无菌条件下充分研磨， 加入装有 90mL 无菌水 ( 带玻璃珠 ) 的三角瓶 中， 振荡 20min。取 5mL 样品悬液接入装有 100mL 液体 LB 培养基的三角瓶中， 37， 180r/ min振荡培养8h ； 将菌液分别制成稀释度为10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6的样液， 各取 200L 涂于木质素筛选培养基平板， 37恒温培养 4

18、8h， 根据菌落生长情况调整稀释梯度。 保持培养条件不变， 48h 后挑取各平板上的单菌落在木质素筛选培养基平板上反复划线纯 化。挑取纯化后的单菌落点接于木质素苯胺蓝培养基平板， 37避光恒温培养 48h， 测量各 菌株的透明圈直径 H 与菌落直径 C， 筛选出 H/C 值较大的菌株。对获得的菌株进行继代培 养， 连续传代 10 次， 观察菌株的生长状况并且测定 H/C 值。根据菌株各代菌落形态、 菌落直 径、 透明圈直径和 H/C 值大小， 确定菌株生长状况和对木质素降解效果的稳定性采用 -80 甘油冷冻法进行保存， 分离菌株保存3管， 写明标签(菌株编号、 分离地点、 生境类型和保存 时间

19、 )。 0034 2、 菌株 H/C 值测定 0035 将菌株点接于木质素苯胺蓝培养基平板， 37避光恒温培养 48h， 测量各菌株的透 明圈直径 H 与菌落直径 C。 0036 3、 结果分析 ： 0037 3.1、 菌株筛选 0038 通过上述的分离筛选过程， 共获得 134 株可在木质素筛选培养基上生长的菌株。 将这 134 株菌株纯化后接种于木质素苯胺蓝培养基上进行筛选， 根据透明圈产生时间、 清 晰度和 H/C 值大小筛选出木质素降解菌。菌株 M2 透明圈产生迅速并且清晰， H/C 值较大的 菌株， 确定为高效木质素降解菌， 根据筛选菌株的样品来源， 分别编号。将上述菌株进行 10

20、次传代培养后， 菌株菌落生长情况、 外观形态以及菌株的 H/C 值均无明显变化， 表明菌株生 长情况、 产酶情况以及酶活力稳定， 无退化现象。 0039 3.2、 菌株 H/C 值测定 0040 菌株 M2 透明圈产生清晰迅速， 并且 H/C 值较大 ； 经 10 次传代培养后， 该菌株的 生长情况、 产酶情况以及酶活力稳定， 无退化现象， 对这株菌的透明圈直径 H 与菌落直径 C 进行测定以及数据分析。菌株 M2 的平均菌落直径为 0.520.03cm， 最大菌落直径可到达 0.55cm ； 平均降解圈直径为 1.330.03cm， 最大降解圈直径能达到 1.37cm。菌株 M2 的平均 H

21、/C 值为 2.590.19， 最大 H/C 值能达到 2.85。 0041 表 2 M2 菌株降解效果 0042 0043 4、 基因组 DNA 的提取 0044 将上述筛选得到的菌株 M2 基因组 DNA 采用热破壁法提取。取 1mL 接种于 LB 液体 培养基37180r/min振荡培养24h的菌悬液， 打入1.5mL离心管中， 5000r/min离心5min， 弃上清， 加入 1mL ddH2O， 吸打均匀， 使菌体悬浮， 5000r/min 离心 5min， 弃上清， 加入 200L 说 明 书 CN 105385629 A 7 6/19 页 8 ddH2O， 吸打均匀， 使菌体悬浮

22、 ； 于沸水浴中 8 10min， 10000r/min 离心 10min。吸取上清 液， 转移至另一支 1.5mL 离心管中， 取 5L 点样， 以 EcoT14 为 Marker， 1琼脂糖凝胶电 泳检测， 其余 -20保存。 0045 5、 16S rDNA 的 PCR 扩增 0046 采用 16S rDNA 通用引物， 以所提取的菌株基因组 DNA 为模板， 按照如下反应体系 和扩增条件进行扩增。引物序列反应体系及扩增条件分别如表 3、 表 4 所示。PCR 产物用 1的琼脂糖电泳检测。 0047 表 3 16S rDNAPCR 扩增的引物序列 0048 0049 表 4 16S rD

23、NA 的 PCR 扩增的反应体系和反应程序 0050 0051 0052 5.1 PCR 产物的回收纯化 0053 将含有目标条带的PCR产物全部点样(80L/孔， 共两孔)， 1.5的琼脂糖凝胶电 泳， 电泳条带用天根琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收， 具体步骤如下 ： 0054 (1)柱平衡步骤 ： 向吸附柱CA2中(放入收集管中)加入500L平衡液BL， 12000r/ min， 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。 0055 (2) 将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下 ( 尽量切除多余部分 ) 放入干净 的离心管中， 称取重量。公式 ： ( 装

24、胶后的重量 - 装胶前离心管的重量 )1000 “1000 倍 体积” L。 0056 (3) 向胶块中加入 “1000 倍体积” 溶胶液 PN， 50水浴放置 10min， 其间不断温和 地上下翻转离心管， 以确保胶块充分溶解， 冷却， 将胶溶液温度降至室温再上柱， 上柱后停 留 2 5min。 说 明 书 CN 105385629 A 8 7/19 页 9 0057 (4) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CA2中， 将吸附柱放入收集管中， 13000r/ min 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放入收集管中。 0058 (5) 向吸附柱中加入 600L 漂洗液 PW(

25、 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 )， 停留 2min， 13000r/min 离心 1min， 倒掉废液， 将吸附柱重新放入收集管中。 0059 (6) 向吸附柱中加入 500L 漂洗液 PW， 13000r/min 离心 30 秒， 倒掉废液。将离心 吸附柱 CA2放入收集管中， 13000r/min 离心 2min， 尽量除去漂洗液。将吸附柱置于 50烘 箱中烘数分钟， 彻底地晾干， 以防止残留的漂洗液影响下一步的实验 ( 影响回收效率和 DNA 质量 )。 0060 (7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中 ( 剪掉帽 )， 向吸附膜中间位置悬空滴加 30L 洗脱缓冲液 EB， 室温放

26、置 2min， 13000r/min 离心 1min 收集 DNA 溶液。 0061 (8) 为了提高 DNA 的回收量， 可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中， 13000r/min 离心 1min 收集 DNA 溶液， 重复 3 次洗脱。 0062 (9) 将 DNA 溶液放置于有盖的离心管中 ( 最后一次洗脱时 )， 保存于 -20， 以防 DNA 降解。取少量回收后的 DNA 溶液用 1的琼脂糖电泳验证其纯度及含量。 0063 5.2 目的片段与克隆载体的连接 0064 将上一步 PCR 回收纯化得到的 DNA 片断与 pMD18-T 载体混合均匀， 4反应过夜。 连接体系如下 ：

27、0065 0066 0067 将连接后的载体转入E.coli DH5感受态细胞中， 摇培后， 涂板， 挑取白色菌落接 种于含有 Amp 的 LB 培养基中 37、 180r/min 摇床培养 10 12 小时。 0068 5.3 阳性克隆子检测 0069 以所得菌液为模板进行PCR扩增， 引物序列(参见pMD18-T Vector说明书)、 反应 体系及扩增条件分别如表 5 和表 6 所示， 产物用 1的琼脂糖电泳检测。 0070 表 5 重组子 PCR 检测所使用的引物序列 0071 0072 表 6 重组子 PCR 检测的反应体系和反应程序 0073 说 明 书 CN 105385629

28、A 9 8/19 页 10 0074 5.4 16SrDNA 序列分析 0075 将得到的阳性克隆送往上海生工 (Sangon Biotech) 生物工程股份有限公司进 行测序， 用 BioEdit 7.09 软件分析测序结果， 截除引物序列， 将获得的序列结果提交到 GenBank数据库获得登录号， 通过BLASTn程序(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线 分析， 下载相似性大于 90的模式菌株的序列， 并用 Clustal X 软件进行多重序列比对， 然 后采用软件 MEGA 5.03 中的 Neighbor-Joining 构建系统发育树， 确定菌株的种属关

29、系。 0076 6、 菌株 16S rDNA 序列鉴定结果 0077 6.1、 16S rDNA 序列 PCR 扩增 0078 16S rDNA 序列 PCR 扩增产物以 1琼脂糖凝胶电泳检查， 结果如图 2 所示。菌株 M2 的 16S rDNA 基因片段长度约为 1500bp。 0079 6.2、 PCR 产物回收 0080 对 6.1 中的 16S rDNA 序列 PCR 扩增产物以 1.5琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳条带 以 DNA 胶回收试剂盒回收。PCR 产物回收电泳图谱如图 3 所示， 根据条带亮度可知， 本实验 已成功回收到足量的纯化 PCR 产物， 可用于后续试验进行。 008

30、1 6.3、 阳性克隆子筛选 0082 将纯化后的 16S rDNA PCR 扩增产物与 T 载体连接， 转化至大芽孢杆菌感受态细 胞， 以所得菌体为模板进行PCR扩增， 结果如图4所示， 已获得具有重组质粒的阳性克隆子。 0083 6.4、 16S rDNA 核苷酸序列测定 0084 各菌株的 16S rDNA 核苷酸序列测定结果见序列表 1， 各菌株的系统发育树如图 5 所示。结合形态学及生理生化鉴定结果， 确定各菌株的种属， 结果见表 7。 0085 表 7 菌株的种属 0086 0087 7、 菌株的最佳培养条件 0088 以 pH、 温度、 氮源、 培养时间、 转速五个试验因素， 按

31、正交表 L18(35) 设计正交试验， 说 明 书 CN 105385629 A 10 9/19 页 11 以确定木质素降解菌的最佳培养条件如表 8 所示。 0089 表 8 正交试验试验因素与水平 0090 0091 菌株 M2 正交试验结果， 见表 9。 0092 表 9 菌株 M2 正交试验结果 0093 0094 说 明 书 CN 105385629 A 11 10/19 页 12 0095 通过形态学鉴定、 生理生化鉴定和 16S rDNA 分子鉴定， 确定上述筛选的菌株为芽 孢杆菌属 (Bacillus sp.) 芽孢杆菌 M2。 0096 通过正交实验表所得结果得出木质素降解菌株

32、 M2 生长的最佳培养条件为 pH4.5， 温度 30， 氮源为酒石酸铵， 时间为 2d， 转速为 180r/min。 0097 具体实施方式二 ： 本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解菌的应用， 它用 于降解木质纤维素类物质。 0098 对本发明的菌株进行以下功能检测 ： 0099 将具体实施方式的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2， 进行袋料木耳废料与玉米秸秆失 重率和木质素、 纤维素和半纤维素降解测定， 以验证其特有的功能。具体如下 ： 0100 1、 袋料木耳废料与玉米秸秆失重率测定 0101 1.1 玉米秸秆粉 0102 玉米秸秆于2012年10月取自黑龙江省哈尔滨市黑龙

33、江大学呼兰校区本实验室试 验田， 烘干， 粉碎过 40 目筛， 备用。 0103 1.2 袋料木耳废料 0104 袋料木耳废料由黑龙江省农科院牡丹江分院提供。 0105 1.3 对照菌剂 0106 中农绿康 ( 北京 ) 生物技术有限公司于 2011 年 10 月 27 日生产的 “有机物料腐熟 剂 ( 秸杆型 )” 。 0107 1.4 培养基 说 明 书 CN 105385629 A 12 11/19 页 13 0108 液体发酵培养基 ： 葡萄糖 5g， 蛋白胨 2g， NH4NO31.0g， CaCl20.2g， K2HPO40.5g， FeCl30.02， MgSO47H2O 0.5

34、g， NaCl 1.0g， 蒸馏水 1000mL， pH 7.0。 0109 摇瓶发酵基础培养基 ： 蛋白胨 2g， NH4NO31.0g， CaCl20.2g， K2HPO40.5g， FeCl30.02， MgSO47H2O 0.5g， NaCl 1.0g， 蒸馏水 1000mL， pH 7.0。 0110 1.5 试验方法 0111 1.5.1 袋料木耳废料失重率测定 0112 将具体实施方式一筛选得到的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 接种到 5mL 液体发酵 培养基中， 37180r/min振荡培养12h， 离心， 弃上清获得菌体。 取500L摇瓶发酵基础培 养基使菌体悬浮

35、， 将菌悬液接入含有 5袋料木耳废料的摇瓶发酵基础培养基中， 其中袋料 木耳废料使用间歇灭菌法灭菌， 121湿热灭菌 30min， 37 180r/min 振荡培养 30d 后， 离 心， 用去离子水洗涤沉淀， 重复洗涤三次后， 烘干称重， 用减量法计算袋料木耳废料失重率， 将所得数据通过SPSS19.0软件分析， 利用Duncan法进行多重比较， 结果以标记字母法标明 各菌株的显著差异性。 设置五组空白对照组和五组阳性对照组， 即空白对照组不接菌种， 阳 性对照组接入 5的对照菌剂， 其他操作均与上述操作相同。 0113 失重率计算公式如下 ： 0114 0115 1.5.2 玉米秸秆失重率

36、测定 0116 将具体实施方式一筛选得到的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 接种到 5mL 液体发酵 培养基中， 37180r/min振荡培养12h， 离心， 弃上清获得菌体。 取500L摇瓶发酵基础培 养基使菌体悬浮， 将菌悬液接入含有 5玉米秸秆粉的摇瓶发酵基础培养基中， 其中玉米秸 秆粉使用间歇灭菌法灭菌， 121湿热灭菌 30min， 37 180r/min 振荡培养 30d 后， 离心， 用 去离子水洗涤沉淀， 重复洗涤三次后， 烘干称重， 用减量法计算玉米秸秆失重率， 将所得数 据通过SPSS19.0软件分析， 利用Duncan法进行多重比较， 结果以标记字母法标明各菌株

37、的 显著差异性。 设置五组空白对照组和五组阳性对照组， 即空白对照组不接菌种， 阳性对照组 接入 5复合微生物菌剂， 其他操作均与上述操作相同。 0117 失重率计算公式如下 ： 0118 0119 1.6 结果与分析 0120 1.6.1 袋料木耳废料失重率测定 0121 菌株 M2 降解袋料木耳废料后， 失重率测定结果如表 10 和图 6 所示。 0122 表 10 菌株 M2 的袋料木耳废料失重率 0123 说 明 书 CN 105385629 A 13 12/19 页 14 0124 注 ： 袋料木耳废料和玉米秸秆经 30d 液体发酵后的失重率。空白对照组不接入菌 种， 阳性对照组接入

38、5中农绿康(北京)生物技术有限公司生产的复合微生物菌剂。 采用 Duncan 法进行多重比较。显著性水平 p 0.05 以小写字母表示， n 3。 0125 由表 10 和图 6 可知， 培养 30d 后， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵后， 袋料木 耳废料的失重率为 35.090.75； 空白对照组袋料木耳废料失重率为 21.60 0.82； 阳性对照组袋料木耳废料失重率为 38.53 0.87。经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 降 解后袋料木耳废料的失重率大于空白对照组， 小于阳性对照组。按照显著水平 p 0.05 分 析， 经芽孢杆菌(Bacillus s

39、p.)M2发酵处理袋料木耳废料的失重率与空白对照组的袋料木 耳废料失重率相比差异显著， 与阳性对照组的袋料木耳废料失重率相比差异显著。芽孢杆 菌 (Bacillus sp.)M2 对袋料木耳废料具有很强的降解能力。经芽孢杆菌 (Bacillus sp.) M2 发酵处理后的袋料木耳废料的失重率在 35以上。 0126 1.6.2 玉米秸秆失重率测定 0127 菌株 M2 降解玉米秸秆后， 失重率测定结果如表 10 和图 7 所示。 0128 由表 10 和图 7 可知， 培养 30d 后， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵后， 玉米秸 秆的失重率为 30.840.54 ； 空

40、白对照组玉米秸秆失重率为 25.80 0.63 ； 阳性对 照组玉米秸秆失重率为 44.81 1.02。经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 降解后玉米秸 秆的失重率大于空白对照组， 小于阳性对照组。按照显著水平 p 0.05 分析， 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理的玉米秸秆失重率与空白对照组的玉米秸秆失重率相比差异 不显著， 与阳性对照组的玉米秸秆失重率相比差异显著。芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 对玉 米秸秆的具有较强的的降解能力。经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理后的玉米秸秆 的失重率在 30以上。 0129 1.7 结论

41、0130 经具体实施方式一筛选出的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 对袋料木耳废料和玉米 秸秆具有明显的降解效果。 经芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2发酵处理后的袋料木耳废料的失 重率在 35以上 ； 经芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 发酵处理后的玉米秸秆的失重率在 30 以上。 芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2对袋料木耳废料强于阳性对照组中复合微生物菌剂对袋 料木耳废料的降解能力。 经芽孢杆菌(Bacillus sp.)M2降解后袋料木耳废料和玉米秸秆的 失重率均大于空白对照组的袋料木耳废料和玉米秸秆的失重率 ； 其中， 芽孢杆菌(Bacillus sp

42、.)M2 发酵处理的袋料木耳废料的失重率大于阳性对照组袋料木耳废料失重率。 0131 芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 对木质纤维素类物质的降解效果与菌株生长情况和 样品成分有很大关系， 袋料木耳废料和玉米秸秆采用范氏 (Van Soest) 洗涤纤维分析法测 定后， 玉米秸秆和袋料木耳废料中的各组分含量见表 11， 袋料木耳废料和玉米秸秆中的木 说 明 书 CN 105385629 A 14 13/19 页 15 质素、 纤维素和半纤维素的含量均明显不同。同一菌株对袋料木耳废料和玉米秸秆具有不 同的降解效果， 原因是由于袋料木耳废料和玉米秸秆中木质素和纤维素的含量不同影响菌 株的生

43、长和繁殖， 导致菌株生长情况不同， 酶的分泌能力存在差异， 进而导致菌株对降解产 物的利用能力不同， 影响其降解能力。 0132 表 11 袋料木耳废料和玉米秸秆各组分含量 0133 0134 2、 木质素、 纤维素和半纤维素降解情况测定 0135 2.1 培养基配制 ： 0136 液体发酵培养基 ： 葡萄糖 5g， 蛋白胨 2g， NH4NO31.0g， CaCl20.2g， K2HPO40.5g， FeCl30.02， MgSO47H2O 0.5g， NaCl 1.0g， 蒸馏水 1000mL， pH 7.0。 0137 摇瓶发酵基础培养基 ： 蛋白胨 2g， NH4NO31.0g， Ca

44、Cl20.2g， K2HPO40.5g， FeCl30.02， MgSO47H2O 0.5g， NaCl 1.0g， 蒸馏水 1000mL， pH 7.0。 0138 玉米秸秆于2012年10月取自黑龙江省哈尔滨市黑龙江大学呼兰校区本实验室试 验田， 烘干， 粉碎过 40 目筛， 备用。 0139 2.2 液体发酵 0140 将具体实施方式一的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)M2 接种到液体发酵培养基中制成 OD600 0.5 的菌悬液， 然后以 5 (mL/mL) 接种量将菌液接入含有 7.5玉米秸秆粉的摇 瓶发酵基础培养基中， 玉米秸秆粉使用间歇灭菌法灭菌， 121湿热灭菌 30mi

45、n， 设三次重 复， 37180r/min振荡培养30d， 采用冷冻真空干燥法进行干燥。 设置一组空白对照组和一 组阳性对照组， 即空白对照组不接菌种， 阳性对照组接入 5 (g/mL) 菌剂， 其他操作均与上 述操作相同。 0141 2.3 木质素、 纤维素和半纤维素降解情况测定 0142 木质纤维素各组分含量采用范氏 (Van Soest) 洗涤纤维分析法进行测定。详细过 程如下 ： 0143 2.3.1、 中性洗涤纤维 (NDF) 测定 0144 将 FiberCap 样品杯于 105烘箱干燥 30min， 取出转移到干燥器内， 冷却至 5min 后， 称重 ( 即为 W1)。准确称取

46、2.000g( 即为 W2) 液体发酵后的样品置于 FiberCap 样品杯 中， 将样品杯放入浸提烧杯， 加入400mL中性洗涤剂和1mL十氢化萘及2g无水亚硫酸钠。 将 烧杯套上冷凝装后置于加热板上， 煮沸 10min， 持续微沸 60min。煮沸完毕后， 用新鲜的热水 重复洗涤三次。 将样品杯放入烘箱中130烘干2h后， 在干燥器中冷却至室温， 称重(即为 W3)。 0145 2.3.2、 酸性洗涤纤维 (ADF) 测定 0146 将上述烘干称重后含有中性洗涤纤维的 FiberCap 样品杯置于浸提烧杯中， 加入 100mL 酸性洗涤剂和 1mL 十氢化萘及 2g 无水亚硫酸钠。将烧杯套

47、上冷凝装后置于加热板 上， 煮沸 10min， 持续微沸 60min。煮沸完毕后， 用新鲜的热水重复洗涤三次。将样品杯放入 说 明 书 CN 105385629 A 15 14/19 页 16 烘箱中 130烘干 2h 后， 在干燥器中冷却至室温， 称重 ( 即为 W4)。 0147 2.3.3、 酸性洗涤木质素 (ADL) 测定 0148 将上述烘干称重后含有中性洗涤纤维的 FiberCap 样品杯置于浸提烧杯中， 加入 72硫酸， 20消化3h后过滤， 用新鲜的热水重复洗涤三次。 将样品杯放入烘箱中130烘 干 2h 后， 在干燥器中冷却至室温， 称重 ( 即为 W5)。 0149 2.3

48、.4、 酸不溶灰分 (AIA) 测定 0150 将样品杯置于预干燥并称重(W6)的灰化坩埚(4560mm)中， 在马弗炉中600灰 化 4h。待坩埚缓慢冷却至大约 200时， 取出放于干燥器 ； 冷却至室温后称重 (W6)。 0151 将所得数据通过SPSS19.0软件分析， 利用Duncan法进行多重比较， 结果以标记字 母法标明各菌株的显著差异性。各计算公式如下 ： 0152 中性洗涤纤维 (NDF) 含量 ： 0153 NDF( ) (W3 W1)/W2100 ； 0154 酸性洗涤纤维 (ADF) 含量 ： 0155 ADF( ) (W4 W3)/W2100 ； 0156 酸性洗涤木质

49、素 (ADL) 含量 ： 0157 ADL( ) W5/W2100 ； 0158 半纤维素 (Hemicellulose) 含量 ： 0159 Hemicellulose( ) NDF( ) ADF( ) ； 0160 纤维素 (Cellulose) 含量 ： 0161 Cellulose( ) ADF( ) W5/W2100 ； 0162 木质素 (Lignin) 含量 ： 0163 Lignin( ) W5/W2100 W6/W2100 ； 0164 2.4 结果与分析 0165 2.4.1 木质素、 纤维素和半纤维素含量测定 0166 玉米秸秆经菌株发酵处理 30d 后， 纤维素、 半纤维素和木质素含量测定结果如表 12 和图 8 所示。 0167 表 12 菌株降解后玉米秸秆中各组分平均含量 0168 说 明 书 CN 105385629 A 16 15/19 页 17 0169 注 ： 空白对照组不接入菌种， 阳性对照组接入 5中农绿康 ( 北京 ) 生物技术有限 公司生产的复合微生物菌剂。采用 D