酶法生产DL-天冬氨酸的方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610092960.4 (22)申请日 2016.02.20 C12P 13/20(2006.01) (71)申请人 蒋光玉 地址 238300 安徽省芜湖市无为县西大街君 临四季花都小区 8 栋 405 室 (72)发明人 蒋光玉 (54) 发明名称 酶法生产 DL- 天冬氨酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种酶法生产 DL- 天冬氨酸的 方法， 属于生物工程领域， 该方法利用天冬氨酸消 旋酶使 L- 天冬氨酸消旋从而生产 DL- 天冬氨酸， 包括如下步骤 ： L- 天冬氨酸加入碱性物质溶解配 成 L- 天冬氨酸盐水溶液作为

2、酶促反应的底物 ； 向底物溶液中加入天冬氨酸消旋酶， 控制反应温 度进行酶促反应 ； 反应完成后， 过滤， 升温加入活 性炭脱色， 冷却后向清液中加入硫酸调节 pH， 使 DL- 天冬氨酸从溶液中结晶析出， 冷却后抽虑、 洗 涤、 干燥可得DL-天冬氨酸产品。 本发明生产方法 原料易得， 生产工艺简单， 反应条件温和， 降低了 DL- 天冬氨酸的生产成本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 105506016 A 2016.04.20 CN 105506016 A 1.酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于

3、利用天冬氨酸消旋酶使L-天冬氨酸消旋 从而生产DL-天冬氨酸， 包括如下步骤： 1） L-天冬氨酸加入碱性物质溶解配成L-天冬氨酸盐水溶液作为酶促反应的底物； 2） 向底物溶液中加入天冬氨酸消旋酶， 控制反应温度进行酶促反应； 3） 反应完成后， 过滤， 升温加入活性炭脱色， 冷却后向清液中加入硫酸调节pH， 使DL-天 冬氨酸从溶液中结晶析出， 冷却后经抽虑、 洗涤、 干燥可得DL-天冬氨酸产品。 2.根据权利要求1所述的酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于所用的天冬氨酸消 旋酶是经分离纯化后的纯酶， 含酶的全细胞， 附着于载体之上的酶或细胞中的任何一种形 态。 3.根据权利要求1所述

4、的酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于天冬氨酸消旋酶的 添加量为不少于12U/g(以L-天冬氨酸计算)。 4.根据权利要求1所述的酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于溶解L-天冬氨酸的 碱性物质是氨水、 NaOH、 Na2CO3、 NaHCO3或者KOH， 优选氨水、 NaOH， 最优氨水。 5.根据权利要求1所述的酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于底物浓度为50 260g/L(以L-天冬氨酸计算),优选150230g/L。 6.根据权利要求1所述的酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于酶促反应的温度为 2560， 优选3550， 最优40。 7.根据权利要求1所述的酶

5、法生产DL-天冬氨酸的方法， 其特征在于酶促反应的pH为 6.59.5， 优选7.59.0， 最优8.0。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506016 A 2 酶法生产DL-天冬氨酸的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种酶法生产DL-天冬氨酸的方法。 背景技术 0002 DL-天冬氨酸常用于氨基酸输液和营养增补剂， 在医药、 食品及化工合成领域具有 广泛的应用前景。 DL-天冬氨酸作为K+和Mg2+的载体， 能够向心肌输送电解质， 从而改善心肌 收缩功能， 同时还能降低氧消耗， 在冠状动脉循环障碍缺氧时， 对心肌有保护作用， 因此可 以用于合成DL-天冬氨

6、酸镁钾盐 （脉安定） ， 可用于治疗心律失常、 心动过速、 心力衰竭、 心肌 梗塞、 心绞痛、 肝炎及肝硬化等疾病。 DL-天冬氨酸的氨基取代衍生物在医药和饲料上有。 重 要作用， 如N-甲基-DL-天冬氨酸(NMA)是一种新型的饲料添加剂， 能显著提高猪的生长性 能， 促进饲料养分的吸收。 DL-天冬氨酸的另一重要用途是通过L-天冬氨酸- -脱羧酶来生 产D-天冬氨酸。 D-天冬氨酸是一种重要的药物前体、 中间体， 同时也是一种功能性保健品。 0003 目前， DL-天冬氨酸的生产方法主要有三种： 顺丁烯二酸酐氨化法、 阿斯巴甜母液 提取法和L-天冬氨酸物理化学消旋法。 0004 顺丁烯二酸

7、酐氨化法用顺丁烯二酸酐 （马来酸酐） 和氨化剂在较高的压力和温度 下直接进行加成反应合成出DL-天冬氨酸， 是目前DL-天冬氨酸的主要生产工艺。 该方法原 料廉价易得， 工艺简单， 收率高， 缺点是反应过程需要高温高压， 原料具有腐蚀性， 对设备的 要求较高， 反应中有副产物天冬酰氨， 分离精制困难。 专利文献主要有： PL133691MethodofmanufactureofDL-asparticacid； JPH07247251PreparationofDL-asparticacid； US5756839ProcessforpreparingD,L-Asparticacidfromammo

8、niumsaltsof themaleicacid。 0005 阿斯巴甜母液提取法的原料是生产阿斯巴甜的副产母液， 母液成份复杂， 造成产 品中杂质较多， 含量较低， 不适宜作为食品和医药的原料。 专利文献有： CN101284796母液回收制备DL-苯丙氨酸和DL-天冬氨酸的方法； CN103113248一种从生产阿斯巴甜废水中回收DL-天门冬氨酸的方法。 0006 L-天冬氨酸物理化学消旋法是L-天冬氨酸在物理或化学条件下消旋而得DL-天冬 氨酸， 反应温度较高， 对设备要求较高， 产物在反应中易分解。 专利文献有： US3213106Processofracemizingopticall

9、yactivealphaacids。 0007 天冬氨酸消旋酶广泛存在于大肠杆菌( Escherichia .coli )、 乳酸杆菌 （Lactobacillus） 、 链球菌 （Streptococcus） 、 嗜热球菌 （Pyrococcus） 等多种细菌中， 可由上 述细菌发酵培养而获得天冬氨酸消旋酶， 再通过本领域公知的方法对酶和细胞进行处理， 从而获得本发明中所需的纯酶、 固定化细胞或固定化酶。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种原料易得， 生产工艺简单， 反应条件温和， 能降低DL-天 说明书 1/3 页 3 CN 105506016 A 3 冬氨酸的生产成本的生产方法。

10、 0009 本发明是通过以下技术方案实现的： 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 利用天冬氨酸消旋酶使L-天冬氨酸消旋从而生产DL-天 冬氨酸， 包括如下步骤： 1） L-天冬氨酸加入碱性物质溶解配成L-天冬氨酸盐水溶液作为酶促反应的底物； 2） 向底物溶液中加入天冬氨酸消旋酶， 控制反应温度进行酶促反应； 3） 反应完成后， 过滤， 升温加入活性炭脱色， 冷却后向清液中加入硫酸调节pH， 使DL-天 冬氨酸从溶液中结晶析出， 冷却后经抽虑、 洗涤、 干燥可得DL-天冬氨酸产品。 0010 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的天冬氨酸消旋酶是经分离纯化后的纯酶， 含 酶的全细胞， 附着于载体之上

11、的酶或细胞中的任何一种形态。 0011 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的天冬氨酸消旋酶的添加量为不少于12U/g (以L-天冬氨酸计算)。 0012 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的溶解L-天冬氨酸的碱性物质是氨水、 NaOH、 Na2CO3、 NaHCO3或者KOH， 优选氨水、 NaOH， 最优氨水。 0013 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的底物浓度为50260g/L(以L-天冬氨酸计 算),优选150230g/L。 0014 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的酶促反应的温度为2560， 优选3550 ， 最优40。 0015 酶法生产DL-天冬氨酸的方法， 所述的

12、酶促反应的pH为6.59.5， 优选7.59.0， 最优8.0。 0016 本发明采用酶法生产DL-天冬氨酸， 常压反应无需高温高压， 对设备的要求低， 生 物酶催化反应专一性强， 产物单一没副产物， 同时本发明所述的生产方法所使用的原料廉 价易得， 使得整体生产成本较低。 本发明经过简单的过滤、 脱色、 结晶就可以拿到合格的产 品， 无需精制提纯， 其生产工艺简单易行， 产品化学纯度高， 比旋光度为0， 制造成本低。 具体实施方式 0017 天冬氨酸消旋酶的活性按如下进行测定。 0018 将被检测物加入到L-天冬氨酸铵 （180g/L、 pH8.0） 的水溶液中， 40下孵化60分 钟， 用

13、高效液相色谱定量测定反应液中的L-天冬氨酸。 将1分钟内消耗1 mol的L-天冬氨酸 的活性， 以1单位 （U） 表示。 0019 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述， 但本发明的保护范围不仅限于此。 0020 实施例1 向150gL-天冬氨酸加入NaOH溶解并调节pH8.5， 配制成1L的L-天冬氨酸钠水溶液， 向上 述溶液中加入0.2g纯化的天冬氨酸消旋酶 （总活力3200U） ， 保持温度37搅拌反应， 不断取 样用旋光仪测定反应体系中的旋光度， 14h后旋光度为零， 反应完毕。 用微滤膜过滤， 除去反 应液中的酶， 升温到80加入1g活性炭脱色， 保温1h后抽滤， 滤液冷却到40后

14、加入硫酸调 节pH2.8 （过程中温度不断升高） ， 缓慢搅拌下用冷却水降温到30以下抽率， 用2倍体积的 水洗涤物料， 烘干后得到白色的DL-天冬氨酸131.2g。 产品旋光度为零， 含量99.5%。 0021 实施例2 说明书 2/3 页 4 CN 105506016 A 4 向900gL-天冬氨酸加入氨水溶解并调节pH8.0， 配制成5L的L-天冬氨酸铵水溶液， 向上 述溶液中加入75g含天冬氨酸消旋酶的大肠杆菌细胞 （总活力15500U） ， 保持温度40搅拌 反应， 不断取样用旋光仪测定反应体系中的旋光度， 7h后旋光度为零， 反应完毕。 用微滤膜 过滤， 除去反应液中的细胞， 升温

15、到80加入15g活性炭脱色， 保温1h后抽滤， 滤液冷却到40 后加入硫酸调节pH2.8， 缓慢搅拌下用冷却水降温到30以下抽率， 用2倍体积的水洗涤 物料， 烘干后得到白色的DL-天冬氨酸782.8g。 产品旋光度为零， 含量99.6%。 0022 实施例3 向2000gL-天冬氨酸加入氨水溶解并调节pH8.0， 配制成10L的L-天冬氨酸铵水溶液， 向 上述溶液中加入105g卡拉胶固定的大肠杆菌细胞 （含天冬氨酸消旋酶总活力26800U） ， 保持 温度45搅拌反应， 不断取样用旋光仪测定反应体系中的旋光度， 12h后旋光度为零， 反应 完毕。 用滤纸过滤， 除去反应液中的固定化细胞， 升温到80加入30g活性炭脱色， 保温1h后 抽滤， 滤液冷却到40后加入硫酸调节pH2.8， 缓慢搅拌下用冷却水降温到30以下抽率， 用2倍体积的水洗涤物料， 烘干后得到白色的DL-天冬氨酸1778.5g。 产品旋光度为零， 含量 99.4%。 说明书 3/3 页 5 CN 105506016 A 5