乌塌菜总RNA的高效提取方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610087704.6 (22)申请日 2016.02.16 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西路 130 号 (72)发明人 汪承刚 方柔 刘思嘉 陈国户 袁凌云 朱世东 葛继涛 (74)专利代理机构 北京市京大律师事务所 11321 代理人 刘向辉 王凝 (54) 发明名称 乌塌菜总 RNA 的高效提取方法 (57) 摘要 本发明涉及乌塌菜总 RNA 的高效提取方法， 通过向乌塌菜叶片中加入液氮研磨、 提高离心转 速、 使用不同浓度乙醇洗涤 RNA

2、沉淀等操作， 可实 现高纯度高浓度、 且无降解的乌塌菜总 RNA 的提 取。本发明首次提供一套科学系统地从乌塌菜叶 片中提取总 RNA 的方法， 不仅提高了提取效率， 又 可有效避免提取过程中的污染， 导致 RNA 降解， 采 用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的 提取， 获得的高纯度高浓度无降解的总 RNA， 有利 于后续研究的深入。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105543215 A 2016.05.04 CN 105543215 A 1.乌塌菜总RNA的高效提取方法， 其特

3、征在于， 包括以下步骤： 1)取乌塌菜叶片加入液氮快速研磨成粉末， 倒入离心管中； 2)向上述粉末中加入Trizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置， 然后4 离心； 3)将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加氯仿， 震荡后室温静置， 然后4离心； 4)将上清液转移至另一离心管中， 加异丙醇上下颠倒摇匀， -20静置后， 4离心； 5)弃去上清液， 用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀， 4离心， 弃去上清液， RNA置于超净工作 台室温干燥后， 用不含RNA酶的灭菌水溶解， -80保存。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤1)具体为： 取乌塌菜叶片0.1mg， 剪碎 后

4、， 分2-3次加入15-20mL液氮， 在3-5min内将叶片研磨成粉末， 操作在超净工作台上完成。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)具体为： 向步骤1)的粉末中加入1- 1.5mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置3-5min， 然后4， 12000rpm 离心3-5min。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤3)具体为： 将步骤2)所得上清液置于 另一离心管中， 向上清液中加0.15-0.3mL氯仿， 盖紧离心管， 用手摇荡15-30s后， 室温静置 3-5min， 然后4， 13000rpm离心5-15min。 5.根据权利要求

5、1所述的方法， 其特征在于， 步骤4)具体为： 将步骤3)所得上清液转移 至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静置3-5min， 然后4， 13000rpm离心5-15min。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤5)具体为： 弃去上清液， RNA沉淀用 0.5-1.0mL75乙醇冲洗2次， 然后4， 13000rpm离心3-5min； 弃去上清液， RNA沉淀再用 0.5-1.5mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心3-5min； 去除乙醇， RNA置于超净工作 台室温干燥5-10min， 然后用不含RNA酶的灭菌水80-100 L溶解

6、， -80保存。 7.根据权利要求1-6任一项所述的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)取乌塌菜叶片0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加入20mL液氮， 在3min内将叶片研磨成粉末， 倒入离心管中， 操作在超净工作台上完成； 2)向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置 3min， 然后4， 12000rpm离心5min； 3)将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加0.2mL氯仿， 盖紧离心管， 用手摇荡20s 后， 室温静置5min， 然后4， 13000rpm离心10min； 4)将上清液转移至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇

7、匀， -20静置 5min， 然后4， 13000rpm离心10min； 5)弃去上清液， RNA沉淀用0.8mL75乙醇冲洗2次， 然后4， 13000rpm离心5min； 弃去 上清液， RNA沉淀再用1.0mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心5min； 去除乙醇， RNA 置于超净工作台室温干燥3-5min， 然后用不含RNA酶的灭菌水80 L溶解， -80保存。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543215 A 2 乌塌菜总RNA的高效提取方法 技术领域 0001 本发明涉及植物RNA的提取工艺， 具体地说， 涉及乌塌菜总RNA的高效提取方法。 背景技术 00

8、02 乌塌菜又名塌菜、 黑菜等， 为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种， 以墨绿色叶片 供食， 主要分布于我国长江流域。 目前， 针对乌塌菜的分子生物学研究， 尚未建立适宜的RNA 提取方法。 0003 乌塌菜细胞在细胞壁破碎后， 所含多糖、 蛋白质等次生代谢物以不同方式干扰RNA 的提取， 细胞内以及操作体系中存在的RNA酶将会对分离组织中的RNA进行降解， 从而影响 后续研究。 本发明在充分借鉴十字花科其他作物RNA提取方法的基础之上， 建立了乌塌菜总 RNA高效提取方法。 发明内容 0004 本发明旨在提供一种获得高纯度高浓度无降解的乌塌菜总RNA的高效提取方法。 0005 为了实现本发明

9、目的， 本发明提供的乌塌菜总RNA的高效提取方法， 包括以下步 骤： 0006 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)加入液氮快速研磨成粉末， 倒入离心管中； 0007 2)向上述粉末中加入Trizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置， 然 后4离心； 0008 3)将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加氯仿， 震荡后室温静置， 然后4离 心； 0009 4)将上清液转移至另一离心管中， 加异丙醇上下颠倒摇匀， -20静置后， 4离 心； 0010 5)弃去上清液， 用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀， 4离心， 弃去上清液， RNA置于超净 工作台室温干燥后(注意不要过分干燥)， 用不含RNA

10、酶的灭菌水溶解， -80保存。 0011 前述的方法， 步骤1)具体为： 取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加 入15-20mL液氮， 在3-5min内迅速将叶片充分研磨成粉末， 操作在超净工作台上完成(避风 环境)。 0012 前述的方法， 步骤2)具体为： 向步骤1)的粉末中加入1-1.5mLTrizol裂解液， 将离 心管置于旋窝机中剧烈震荡后室温静置3-5min， 然后4， 12000rpm离心3-5min。 0013 前述的方法， 步骤3)具体为： 将步骤2)所得上清液置于另一离心管中， 向上清液中 加0.15-0.3mL氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈摇荡15

11、-30s后， 室温静置3-5min， 然后4， 13000rpm离心5-15min。 0014 前述的方法， 步骤4)具体为： 将步骤3)所得上清液转移至另一离心管中， 加等体积 的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静置3-5min， 然后4， 13000rpm离心5-15min。 0015 前述的方法， 步骤5)具体为： 弃去上清液， RNA沉淀用0.5-1.0mL75乙醇冲洗2次， 说明书 1/4 页 3 CN 105543215 A 3 然后4， 13000rpm离心3-5min； 弃去上清液， RNA沉淀再用0.5-1.5mL无水乙醇冲洗1次， 然 后4， 13000rpm离心3-5m

12、in； 去除乙醇， RNA置于超净工作台室温干燥3-5min， 然后用不含 RNA酶的灭菌水80-100 L溶解， -80保存。 0016 优选地， 所述方法包括以下步骤： 0017 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加入20mL液氮， 在3min内将叶 片研磨成粉末， 倒入离心管中， 操作在超净工作台上完成(避风环境)； 0018 2)向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中剧烈震荡后室温 静置3min， 然后4， 12000rpm离心5min； 0019 3)将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加0.2mL氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈

13、 摇荡20s后， 室温静置5min， 然后4， 13000rpm离心10min； 0020 4)将上清液转移至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静 置5min， 然后4， 13000rpm离心10min； 0021 5)弃去上清液， RNA沉淀用0.8mL75乙醇冲洗2次， 然后4， 13000rpm离心5min； 弃去上清液， RNA沉淀再用1.0mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心5min； 去除乙醇， RNA置于超净工作台室温干燥3-5min(注意不要过分干燥)， 然后用不含RNA酶的灭菌水80 L 溶解， -80保存。 0022 本发明基于目

14、前从乌塌菜中提取植物总RNA存在的诸多问题， 提供一套科学系统 地提取高浓度高纯度的乌塌菜总RNA的方法， 获得的高浓度高纯度的基因组RNA有利于后续 研究的深入。 0023 本方法具有以下优点： 0024 (一)加快研磨速度。 通过向乌塌菜叶片中加入液氮， 既提高了研磨效率， 又可避免 研磨过程中污染所导致的RNA降解。 0025 (二)加入裂解液震荡后再静置， 可使组织裂解更彻底。 0026 (三)通过提高离心转速， 使提取率更高。 0027 (四)用不同浓度乙醇洗RNA沉淀， 可提高RNA纯度。 0028 (五)节省了提取时间。 采用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的提取

15、。 附图说明 0029 图1为本发明实施例4中采用不同方法提取乌塌菜总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果； 其中， 1为普通Trizol提取法， 2为试剂盒提取法， 3为实施例1的高效提取法。 具体实施方式 0030 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0031 实施例1乌塌菜总RNA的高效提取方法 0032 1、 取乌塌菜新鲜嫩叶0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加入20mL液氮， 在3min内将叶片研磨 成粉末， 倒入离心管中， 操作在超净工作台上完成(避风环境)。 0033 2

16、、 向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中剧烈震荡后室温 静置3min， 然后4， 12000rpm离心5min。 说明书 2/4 页 4 CN 105543215 A 4 0034 3、 将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加0.2mL氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈 摇荡20s后， 室温静置5min， 然后4， 13000rpm离心10min。 0035 4、 将上清液转移至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静 置5min， 然后4， 13000rpm离心10min。 0036 5、 弃去上清液， RNA沉淀用0.8mL75乙醇冲洗2次，

17、 然后4， 13000rpm离心5min； 弃去上清液， RNA沉淀再用1.0mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心5min； 去除乙醇， RNA置于超净工作台室温干燥3-5min(注意不要过分干燥)， 然后用不含RNA酶的灭菌水80 L 溶解， -80保存。 0037 实施例2乌塌菜总RNA的高效提取方法 0038 1、 取乌塌菜新鲜嫩叶0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加入20mL液氮， 在5min内将叶片研磨 成粉末， 倒入离心管中， 操作在超净工作台上完成(避风环境)。 0039 2、 向上述粉末中加入1.2mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中剧烈震荡后室 温

18、静置4min， 然后4， 12000rpm离心4min。 0040 3、 将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加0.15mL氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈 摇荡15s后， 室温静置4min， 然后4， 13000rpm离心5min。 0041 4、 将上清液转移至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静 置4min， 然后4， 13000rpm离心5min。 0042 5、 弃去上清液， RNA沉淀用0.5mL75乙醇冲洗2次， 然后4， 13000rpm离心4min； 弃去上清液， RNA沉淀再用0.5mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心4min；

19、去除乙醇， RNA置于超净工作台室温干燥3-5min(注意不要过分干燥)， 然后用不含RNA酶的灭菌水90 L 溶解， -80保存。 0043 实施例3乌塌菜总RNA的高效提取方法 0044 1、 取乌塌菜新鲜嫩叶0.1mg， 剪碎后， 分2-3次加入15mL液氮， 在3min内将叶片研磨 成粉末， 倒入离心管中， 操作在超净工作台上完成(避风环境)。 0045 2、 向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液， 将离心管置于旋窝机中剧烈震荡后室温 静置5min， 然后4， 12000rpm离心5min。 0046 3、 将上清液置于另一离心管中， 向上清液中加0.3mL氯仿， 盖紧离心管， 用

20、手剧烈 摇荡30s后， 室温静置3min， 然后4， 13000rpm离心15min。 0047 4、 将上清液转移至另一离心管中， 加等体积的4异丙醇， 上下颠倒摇匀， -20静 置3min， 然后4， 13000rpm离心15min。 0048 5、 弃去上清液， RNA沉淀用1.0mL75乙醇冲洗2次， 然后4， 13000rpm离心3min； 弃去上清液， RNA沉淀再用1.5mL无水乙醇冲洗1次， 然后4， 13000rpm离心3min； 去除乙醇， RNA置于超净工作台室温干燥3-5min(注意不要过分干燥)， 然后用不含RNA酶的灭菌水80 L 溶解， -80保存。 0049 实

21、施例4不同RNA提取方法的效果比较 0050 取0.1g乌塌菜新鲜嫩叶， 分别使用实施例1-3的高效提取法、 普通Trizol提取法 (参见白菜抽薹性相关序列的克隆与分析， 邹艳敏， 首都师范大学， 2009)以及植物总RNA提 取试剂盒(TIANGEN:RNAsimpleTotalRNAKit)三种方法提取乌塌菜叶片总RNA。 0051 实验结果见表1和图1， 结果表明， 本发明的乌塌菜总RNA的高效提取法较其他两种 说明书 3/4 页 5 CN 105543215 A 5 方法提取的乌塌菜叶片基因组RNA产率和纯度高， 且RNA无降解。 0052 表1三种方法提取RNA结果比较 0053 0054 注： a、 b、 c、 d、 e分别表示在0.05水平下的显著性差异。 0055 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105543215 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 105543215 A 7