聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102850450 B (45)授权公告日 2014.08.13 CN 102850450 B (21)申请号 201110184390.9 (22)申请日 2011.07.01 C07K 14/535(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (73)专利权人 齐鲁制药有限公司 地址 250100 山东省济南市历城区工业北路 243 号 (72)发明人 王晶翼 孙丽霞 王克波 艾现伟 董婷 王希菊 张乐 王乐 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 苗峻 (54) 发明名称 聚乙二醇

2、化重组人粒细胞集落刺激因子的纯 化方法 (57) 摘要 本发明提供一种聚乙二醇化重组人粒细胞集 落刺激因子的纯化方法， 本发明的发明人对各种 层析方法进行了大量的研究， 发现利用脱盐层析、 离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化， 能 够获得高纯度的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺 激因子。本发明纯化工艺充分利用了目的蛋白在 表面电荷和疏水性上的特点， 先通过一个阴离子 交换层析柱， 有效的去除了内毒素， 增加了工艺的 可控性 ； 第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水 性， 实现了串联层析， 将内毒素的去除和蛋白的纯 化两个步骤合并为一个步骤。本工艺不仅可以有 效去除内毒素， 并且简化了操作步骤，

3、节省了生产 时间， 提高了生产效率， 十分适合大规模工业化放 大生产。 (51)Int.Cl. 审查员 李煦颖 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102850450 B CN 102850450 B 1/1 页 2 1. 一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法， 其特征在于 ： 将经过脱盐 后的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合 型离子交换层析柱串联层析系统， 使内毒素结合到阴离子交换层析柱上 ； 之后采用添加了

4、氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱， 收集洗脱 后的目的蛋白液 ； 具体步骤如下 ： （1） 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液经过葡聚糖凝胶 G-25 脱盐， 得脱盐 液 ； （2） 脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统， 使 内毒素结合到阴离子交换层析柱上， 至上样完毕 ； （3） 采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱， 收集洗脱 后的目的蛋白液 ； （4） 洗脱后的目的蛋白液经过葡聚糖凝胶 G-25 脱盐柱脱盐去除 Na+、 Cl-， 得到高纯度的 蛋白样品 ； 其中所述的步骤 （2） 中采用的阴离子交换层析柱的

5、层析介质为琼脂糖凝胶类， 配基为 季氨基 Q 或二乙基氨乙基 DEAE ； 所述的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类， 配基为 N- 苯甲 基 -N- 甲基乙醇胺 ； 所述的添加了氯化钠的缓冲液为 Tris-HCl 或醋酸钠缓冲液， 缓冲液 pH 为 4.0 7.0， 缓冲液浓度为 10mmol/L 100mmol/L ； 其中氯化钠浓度为 0.1mol/L 1.0mol/L ； 所述步骤 （1） 中的葡聚糖凝胶 G-25 脱盐层析柱和步骤 （2） 中的阴离子交换层析柱与 多结合型离子交换层析柱串联层析洗脱在上样前， 均采用 pH6.0-8.5、 浓度为 10mmol/L 1

6、00mmol/L 的磷酸盐缓冲液进行平衡。 2. 根据权利要求 1 所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 （4） 中的葡聚糖凝胶 G-25 脱盐层析柱在上样前需采用 pH4.0 的 20mM 的醋 酸钠缓冲液进行平衡。 3. 根据权利要求 1 所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法， 其特征 在于 ： 所述的添加了氯化钠的缓冲液为 Tris-HCl 或醋酸钠缓冲液， 缓冲液浓度为 20mmol/ L 50mmol/L ； 其中氯化钠浓度为 0.1mol/L 0.6mmol/L。 权 利 要 求 书 CN 102850450 B 2 1/7

7、 页 3 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及利用重组 DNA 技术生产基因工程药物的方法， 具体涉及聚乙二醇化重 组人粒细胞集落刺激因子 (PEG-rhG-CSF 或 PEG-G-CSF) 的纯化方法， 属于医药技术领域。 背景技术 0002 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一， 由175个氨基酸组成， 是一种水溶 性的蛋白， 具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒细胞系造血细胞的增殖、 分化， 增加外 周血中性粒细胞数量， 活化中性粒细胞功能， 在预防和治疗多因素引起的中性粒细胞减少 症及其并发症 ( 如发热、 感染等 ) 方面疗效显著。1

8、991 年， Amgen( 安姆根 ) 公司的重组人 粒细胞集落刺激因子 (rhG-CSF) 被 FDA 批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治 疗。但作为一种生物大分子药物， rhG-CSF 像大多数生物制品一样， 在临床应用中存在体内 半衰期短， 易被酶水解和肾脏清除等问题。 在化疗过程中， 需要长达两周的持续每日静脉或 皮下注射， 造成病人依从性较差。 0003 聚乙二醇 (PEG) 修饰是实现蛋白质药物长效的一种应用较为广泛的方法， PEG 修 饰的蛋白质和多肽类药物半衰期明显延长， 溶解度和稳定性得到改善， 免疫原性降低， 生物 利用度增强， 毒副作用减少。PEG 修饰的 rhG

9、-CSF 实现了长效增加外周血中性粒细胞数的 目的， 2002 年， FDA 又批准了 Amgen 公司的聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子 (PEG-G-CSF) 上 市， 商品名 Neulasta。PEG-G-CSF 是由单甲氧基聚乙二醇丁醛与大肠杆菌表达纯化的蛋氨 酰化的粒细胞集落刺激因子N-末端赖氨酸氨基共价连接而成， 与G-CSF相比其在体内的半 衰期明显延长， 因而可以减少治疗时的注射次数， 减少病人的痛苦。 0004 在 PEG-G-CSF 的纯化过程中， 需要去除 PEG 与 G-CSF 交联反应液中的交联剂、 二 交联的 G-CSF 及未交联的 G-CSF 等。由于交联产生的多种不

10、同交联蛋白异构体， 除了分子 量有所区别外， 其他性质如表面电荷、 疏水性等差别较小， 因此， 分离纯化交联蛋白产物， 成 为聚乙二醇化技术的难点之一。安姆根公司在专利 CN1071760C 中公开了 N- 末端 PEG 化 rh-G-CSF 的纯化方法， 将交联反应混合物上样于阳离子交换层析柱 Sepharose FF 柱， 以醋 酸钠缓冲液平衡后进行线性洗脱， 收集洗脱液 ； 将洗脱液再进行分子筛层析的方法来纯化。 虽然， 分子筛层析能够去除分离各种交联异构体， 但是由于分子筛很难在工业中实现放大， 因此国内大多数的纯化方法是根据表面电荷的差异， 采用离子交换层析进行分离纯化， 例 如 C

11、N1663962A 公开了 PEG-G-CSF 的一步纯化方法， 采用阳离子交换层析柱 SP Sepharose F.F. 装柱后用乙酸 - 乙酸钠缓冲液平衡， 再用不同 pH 值的乙酸 - 乙酸钠缓冲液洗脱。此纯 化工艺虽然可以实现工业上的放大， 但由于采用的是作用比较单一的阳离子交换介质进行 吸附 - 解析来进行分离， 其内毒素很难控制， 导致终产品中内毒素含量不容易控制， 影响了 产品的质量。 发明内容 0005 本发明针对现有技术的不足， 提供一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的 说 明 书 CN 102850450 B 3 2/7 页 4 纯化方法， 本发明的发明人对各种层析方法

12、进行了大量的研究， 发现利用脱盐层析、 离子交 换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化， 能够获得高纯度的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺 激因子。本发明纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点， 先通过一个 阴离子交换层析柱， 有效的去除了内毒素， 增加了工艺的可控性 ； 第二步层析充分利用目的 蛋白的强疏水性， 实现了串联层析， 将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为一个步 骤。本工艺不仅可以有效去除内毒素， 并且简化了操作步骤， 节省了生产时间， 提高了生产 效率， 十分适合大规模工业化放大生产。 0006 实施本发明的前期步骤为现有技术 ： 可以采用 CN1071760C 中公开的

13、方法来获得 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液， 将该交联液作为后续处理的对象。 0007 该方法主要步骤在于 ： 将经过脱盐后的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交 联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统， 利用内毒素与 阴离子交换层析柱的高度吸附作用达到去除内毒素的目的 ； 0008 之后采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱， 收集 洗脱后的目的蛋白液 ； 0009 更进一步的， 本发明的具体处理步骤如下 ： 0010 (1) 聚 乙 二 醇 化 重 组 人 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子 交 联 液 经 过 葡 聚 糖 凝 胶

14、G-25(Sephadex G-25) 脱盐， 得脱盐液 ； 0011 (2) 脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系 统， 使内毒素结合到阴离子交换层析柱上， 至上样完毕 ； 0012 (3) 采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱， 收集 洗脱后的目的蛋白液 ； 0013 (4) 洗脱后的目的蛋白液经过葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐柱脱盐去除 Na+、 Cl-， 得到高纯度的蛋白样品。 0014 上述过程中， 步骤 (1) 和 (2) 中的葡聚糖凝胶 G-25 脱盐层析柱和阴离子交换层析 柱与多结合型离子交换层析柱串

15、联层析洗脱在上样前均采用 pH6.0-8.5， 浓度为 10mmol/ L 100mmol/L 的磷酸盐缓冲液进行平衡 ； 其中优选采用 pH7.0-8.0、 浓度为 20mmol/L 50mmol/L 的磷酸盐缓冲液进行平衡 ； 0015 步骤 (2) 中采用的阴离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶 (Sepharose) 类、 聚苯乙烯 (SOURCE) 类， 配基为季氨基 Q 或二乙基氨乙基 DEAE ； 优选层析介质为琼脂糖 凝胶类， 配基为季氨基 Q 或二乙基氨乙基 DEAE ； 最优选的层析介质为琼脂糖凝胶类， 配基为 季氨基 Q(Sepharose Q Fast Flow) ；

16、 0016 步骤 (2) 中的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类、 聚 苯乙烯类或硅颗粒类， 配基为带部分疏水基团的离子交换配基 ； 其中优选配基为 N- 苯甲 基 -N- 甲基乙醇胺、 带疏水基团的季氨基和带疏水基团的磺酸基 ； 最优选优选层析介质为 高流速琼脂糖类， 配基为 N- 苯甲基 -N- 甲基乙醇胺 (Captro adhere) ； 0017 这种多结合型离子交换层析介质相较于单一性质的分离层析介质， 同时具有离子 交换功能基团和疏水作用功能基团， 可以通过两种作用方式， 将蛋白吸附在层析介质上， 从 而实现通过多种性质进行目的蛋白的纯化、 分离。 0018 而

17、步骤 (2) 中所述的脱盐液可以连续通过阴离子交换层析柱和多结合型离子交 说 明 书 CN 102850450 B 4 3/7 页 5 换层析柱串联层析系统 ； 同样的步骤 (2) 中所述的脱盐液也可以首先通过阴离子交换层析 柱之后收集， 再集中通过多结合型离子交换层析柱。 0019 步骤 (3) 中所述的添加氯化钠的缓冲液为 Tris-HCl 或醋酸钠缓冲液， 缓冲液 pH 为 4.0 7.0， 缓冲液浓度为 10mmol/L 100mmol/L ； 优选缓冲液浓度为 20mmol/L 50mmol/L， 而其中所添加氯化钠的缓冲液中氯化钠的浓度为 100mmol/L 1.0mol/L ；

18、优选 氯化钠的浓度为 100mmol/L 600mmol/L。控制氯化钠的浓度可以使得缓冲液的离子强度 发生变化， 从而使吸附在阳离子交换层析柱上的目标蛋白解吸， 达到了分离的目的。 0020 所述步骤 (4) 中的葡聚糖凝胶 G-25 脱盐层析柱在上样前， 需采用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液进行平衡。 0021 采用这种技术后， 通过采用合适的缓冲体系和层析介质， 将两步层析进行了串联， 简化了层析步骤， 节省了层析时间和工艺成本， 并提高了工艺的处理量。 0022 PEG-G-CSF的等电点为5.05.3左右， 如果通过阴离子交换层析采用流穿的方式 进行内毒素的去除， 传统工

19、艺需要将缓冲液的 pH 值调整为 5.0 以下， 但是那样会使去除内 毒素的效果大大减弱。通过选择合适的磷酸盐缓冲液和 pH 值， 将目的蛋白在高 pH 的条件 下， 仍能穿过阴离子交换层析， 确保了去内毒素效果， 减轻了后续纯化步骤的负荷， 提高了 工艺稳定性 ； PEG-G-CSF 的疏水性较强， 采用带疏水基团的多结合型离子交换层析介质， 在 低离子强度条件下将目的蛋白吸附在多结合型离子交换层析介质上， 并将内毒素去除和蛋 白纯化两步层析实现了串联。 0023 同时， 通过内毒素去除和蛋白纯化的蛋白液， 可以再经过最后一步的脱盐层析改 变串联层析后所得蛋白液的缓冲体系， 之所以这样设计，

20、 主要是由于纯化步骤采用了添加 了氯化钠的缓冲液， 所得的蛋白液也含有这种缓冲液， 为了去除其中的氯化钠， 需再经过脱 盐层析， 可以用适合于制剂生产的缓冲液洗脱， 这样就使缓冲体系改变了， 所得目的蛋白液 可以不再经过其他处理， 纯度高达 99以上， 可以直接用于制剂生产。 0024 综上所述， 本发明采用的纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的 特点， 先通过一个阴离子交换层析柱， 有效的去除了内毒素， 增加了工艺的可控性 ； 第二步 层析充分利用目的蛋白的强疏水性， 实现了串联层析， 将内毒素的去除和蛋白的纯化两个 步骤合并为一个步骤。 本工艺不仅可以有效去除内毒素， 并且简化

21、了操作步骤， 工艺设计合 理， 工艺过程简单， 易于控制， 便于操作， 重复性好 ； 目的蛋白损失少， 蛋白收率和质量有明 显提高 ； 一次性处理蛋白量大， 工艺稳定性强， 适合于大规模工业生产。 附图说明 0025 图 1 为 Captro adhere 离子交换层析图谱 ； 0026 图 2 为 Captro adhere 离子交换层析电泳图谱 ； 0027 图中 1 为二交联 mPEG-G-CSF， 2 为 mPEG-G-CSF， 3 为 G-CSF。 具体实施方式 0028 以下通过实施例将进一步说明本发明， 这些实例不应作为本发明的限制。 0029 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子

22、交联液可由现有技术直接获得， 如 CN1071760C 中公开的方法。 说 明 书 CN 102850450 B 5 4/7 页 6 0030 实施例 1 0031 1、 采用 pH8.5 的 100mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0032 2、 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose Q Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层析 介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro adhere)。 0

23、033 3、 用 pH8.5 的 100mM 磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液 上样， 完毕后， 再用 pH8.5 的 100mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与 多结合型离子交换层析柱分开， 用 pH7.0 的 100mM Tris-HCl 缓冲液平衡 Captro adhere 离 子交换层析柱， 然后用含 0.1 1.0mol/L 氯化钠的 pH7.0 的 100mM Tris-HCl 缓冲液进行 梯度洗脱， 收集目的蛋白液， 用醋酸将其 pH 调整至 4.5 左右。 0034 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-

24、25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0035 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 97以上， 串联柱收率可达 68以上。 0036 实施例 2 0037 1、 采用 pH6.0 的 10mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0038 2、 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介

25、质为琼脂糖凝胶 (sepharose Q Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层析 介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro MMC)。 0039 3、 用pH6.0的10mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用pH6.0的10mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。 然后将阴离子交换层析柱与多结 合型离子交换层析柱分开， 用 pH4.0 的 100mM 醋酸钠缓冲液平衡 Captro MMC 离子交换层析 柱， 然后用含 0.1mol/L 1.0mol/L 氯化钠的 pH4.0 的 20mM 醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱， 收集目的蛋白液。 0040 4、

26、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0041 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 97以上， 串联柱收率可达 70以上。 0042 实施例 3 0043 1、 采用 pH8.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0044 2、 先将阴离子交换层

27、析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose DEAE Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层 析介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro adhere)。 0045 3、 用pH8.0的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH8.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子交换层析柱分开， 用 pH6.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液平衡 Captro adhere 离子 说 明 书 CN 102850450 B 6 5/7 页

28、 7 交换层析柱， 然后用含 100mmol/L 600mmol/L 氯化钠的 pH7.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液 进行梯度洗脱， 收集目的蛋白液， 用醋酸将其 pH 调整至 4.5 左右。 0046 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0047 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 75以上。 0048 实施例 4

29、 0049 1、 采用 pH7.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0050 2、 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose DEAE Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层 析介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro MMC)。 0051 3、 用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH7.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液冲

30、洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子交换层析柱分开， 用 pH5.0 的 20mM 醋酸钠缓冲液平衡 Captro MMC 离子交换层 析柱， 然后用含 100mmol/L 600mmol/L 氯化钠的 pH5.0 的 20mM 醋酸钠缓冲液进行梯度洗 脱， 收集目的蛋白液。 0052 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0053 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE

31、 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 75以上。 0054 实施例 5 0055 1、 采用 pH7.5 的 30mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0056 2. 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose Q Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层析 介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro adhere)。 0057 3、 用pH7.5的30mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，

32、 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH7.5 的 30mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子交换层析柱分开， 用 pH6.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液平衡 Captro adhere 离子 交换层析柱， 然后用含 100mmol/L 600mmol/L 氯化钠的 pH6.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液 进行梯度洗脱， 收集目的蛋白液， 用醋酸将其 pH 调整至 4.5 左右。 0058 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓

33、冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0059 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 80以上。 0060 实施例 6 0061 1、 采用 pH6.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 说 明 书 CN 102850450 B 7 6/7 页 8 0062 2、 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶

34、 (sepharose Q Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层析 介质为高流速琼脂糖凝胶 (Captro MMC)。 0063 3、 用pH6.5的50mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH6.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子交换层析柱分开， 用 pH5.0 的 30mM 醋酸钠缓冲液平衡 Captro MMC 离子交换层 析柱， 然后用含 100mmol/L 600mmol/L 氯化钠的 pH5.0 的 30mM 醋酸钠缓冲液进行梯度洗 脱， 收集目的蛋白液。 0064 4、 用

35、 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0065 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 80以上。 0066 实施例 7 0067 1、 采用 pH8.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0068 2、 先将阴离子交换层析柱

36、和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose DEAE Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层 析介质为高流速琼脂糖凝胶 (QMA Spherosil LS)。 0069 3、 用pH8.0的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH8.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子交换层析柱分开， 用 pH6.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液平衡 QMA Spherosil LS 离 子交换层析柱， 然后用含 100mmol/L 60

37、0mmol/L 氯化钠的 pH7.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲 液进行梯度洗脱， 收集目的蛋白液， 用醋酸将其 pH 调整至 4.5 左右。 0070 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0071 5、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 75以上。 0072 实施例 8 0073 1、 采用 pH8.0 的 20mM 磷酸

38、盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 层析柱， 将 PEG-G-CSF 交联液上样完毕， 收集脱盐液。 0074 2、 先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联， 阴离子交换层析 柱的层析介质为琼脂糖凝胶 (sepharose Q Fast Flow)， 多结合型离子交换层析柱的层析 介质为高流速琼脂糖凝胶 (QMA Spherosil LS)。 0075 3、 用pH8.0的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡， 将收集的脱盐液上 样， 完毕后， 再用 pH8.0 的 20mM 磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多 结合型离子

39、交换层析柱分开， 用 pH6.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲液平衡 QMA Spherosil LS 离 子交换层析柱， 然后用含 100mmol/L 600mmol/L 氯化钠的 pH7.0 的 20mM Tris-HCl 缓冲 液进行梯度洗脱， 收集目的蛋白液， 用醋酸将其 pH 调整至 4.5 左右。 0076 4、 用 pH4.0 的 20mM 的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25) 脱盐 说 明 书 CN 102850450 B 8 7/7 页 9 柱， 将目的蛋白液上样， 用平衡缓冲液继续洗脱， 收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。 0077 5、

40、 在百级层流罩下进行除菌过滤， 即为 PEG-G-CSF 原液， 取样进行 SDS-PAGE 检测 纯度平均可达 99以上， 串联柱收率可达 75以上。 0078 试验例 1 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的药效学研究 0079 PEG-G-CSF 主要通过 PEG 的末端醛基与 G-CSF 的氨基酸残基反应而成的， 与 G-CSF 相比， 分子量的增加， 降低了 PEG-G-CSF 在肾小球的滤过率， 提高了药物的稳定性。 因为 PEG-G-CSF 在清除过程中存在着自我调节过程， 在中性粒细胞水平恢复以前， 血清中 PEG-G-CSF 的水平要高于同等剂量 G-CSF 的血清水平， 从

41、而使半衰期得以延长， 由原来的 3.5 小时延长到 33 小时。药效学研究可知， PEG-G-CSF 可减少化疗期间 IV 度中性粒细胞减 少的发生率， 升高中性粒细胞最低值， 60、 100或200g/kg每个化疗周期给药1次能较好地 预防中性粒细胞减少症。 0080 G-CSF 的半衰期较短， 需要每日注射， 每个化疗周期至少连续注射 2 周 ； 而 PEG-G-CSF每疗程只需注射1次， 且在安全性和疗效方面与每日注射G-CSF相仿。 这样以来 PEG-G-CSF 相对于 G-CSF 就具有低给药频率和提高病人顺应性的优势。 0081 比较例 1 0082 采用实施例 5 所述的方法对聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子进行纯化， 同 时采用现有技术 CN1663962A 公开的纯化方法进行对比， 对比结果如下 ： 0083 表现有技术与本发明技术参数对比 0084 0085 可见， 采用本发明所述的纯化方法， 简化了操作步骤， 缩短处理所需的时间， 工艺 设计合理， 工艺过程简单， 易于控制， 便于操作， 重复性好 ； 目的蛋白损失少， 蛋白收率和质 量有明显提高 ； 一次性处理蛋白量大， 工艺稳定性强， 适合于大规模工业生产。 说 明 书 CN 102850450 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102850450 B 10