检测FIX基因全外显子的方法和引物.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511023610.4 (22)申请日 2015.12.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 地址 310030 浙江省杭州市西湖区振中路 208 号 2 幢北楼 1 至 5 层、 2 幢南楼 1 至 2 层 (72)发明人 李文静 林有升 王淑一 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 黄素萍 徐关寿 (54) 发明名称 检测 FIX 基因全外显子的方法和引物 (57) 摘要 本发明公开了检测 FIX

2、基因全外显子的方 法、 引物和试剂盒， 所述引物、 试剂盒均包括扩增 覆盖 FIX 基因全外显子序列的 7 对正、 反向引物， 并采用 Sanger 测序法， 利用 1 对通用引物为测序 引物， 检测FIX基因全外显子序列的突变情况。 本 发明所述引物和方法可应用于血友病 B 患者的基 因诊断、 家族女性携带者检测及产前基因诊断等 方面。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 序列表6页 附图2页 CN 105506106 A 2016.04.20 CN 105506106 A 1.检测FIX基因全外显子的引物， 其特征

3、在于， 包括： 扩增覆盖检测FIX基因全外显子的 正、 反向引物； 其碱基序列为： FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT FIX-4

4、R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA FIX-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA FIX-7R： AAC

5、AGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA。 2.如权利要求1至2之一所述的引物， 其特征在于， 所述7对正、 反向引物的使用浓度比 为： FIX-1F:FIX-1R1:1； FIX-2+3F:FIX-2+3R1:1； FIX-4F:FIX-4R1:1； FIX-5F:FIX-5R 1:1； FIX-6F:FIX-6R1:1； FIX-7F:FIX-7R1:1； FIX

6、-8F:FIX-8R1:1。 3.一种检测检测FIX基因全外显子序列的方法， 其包括如下步骤： (1)提取样品DNA； (2)利用7对扩增引物FIX-1F与FIX-1R； FIX-2+3F与FIX-2+3R； FIX-4F与FIX-4R； FIX-5F 与FIX-5R； FIX-6F与FIX-6R； FIX-7F与FIX-7R； FIX-8F与FIX-8R。 对(1)中的DNA分别进行扩 增， 获得覆盖检测FIX基因全外显子的扩增产物； (3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序， 获 得所述扩增产物的基因序列； (4)将(3)中的基因序列与野生型F

7、IX序列进行比较， 确定突变位点是否存在； 其中所述引物序列为： FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT FIX-4R： AACAGC

8、TATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA FIX-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA 权利要求书 1/2 页 2 CN 105

9、506106 A 2 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA M13-F： TGTAAAACGACGGCCAGT M13-R： AACAGCTATGACCATG。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105506106 A 3 检测FIX基因全外显子的方法和引物 技术领域 0001 本发明属生命科学和生物技术领域， 特别涉及检测FIX基因全外显子

10、突变的引物 和方法 背景技术 0002 血友病B也称为凝血因子IX(FIX)缺乏症， 是一种X染色体连锁隐性遗传病， 发病机 制为FIX(F9)基因突变导致血浆中FIX含量减少或功能缺陷， 在男性中的发病率为1/30000， 在女性中罕见。 血友病B症状主要表现为患者全身各部位自发性或损伤后过度出血， 目前尚 无有效的治愈方法， 只能通过输血或FIX浓缩制剂来减轻或延缓症状， 因而给患者家庭和社 会带来沉重的负担。 0003 FIX基因位于Xq26.3-27.2， 全长34kb， 由8个外显子、 7个内含子以及侧翼顺序中的 调区域构成。 8个外显子长度从25bp至1935bp不等， 外显子1编

11、码信号肽， 可引导合成的蛋白 分泌至血液中； 外显子2和3编码前肽和GLA结构域； 外显子4编码类表皮生长因子结构域I， 该结构域可与Ca2+紧密结合； 外显子5编码类表皮生长因子结构域II； 外显子6编码活化结构 域， 凝血过程中在XIa、 a和组织因子的共同作用下FIX将在第221位组氨酸、 第269位精氨 酸和第365位丝氨酸处被切断， 形成轻链和重链， 此时FIX就转变成了有活性的FIXa； 外显子 7和8编码催化结构域， 在催化FX向FXa的转化中起着十分重要的作用。 FIX基因缺陷类型十 分繁多， 最新的人类基因突变数据库中收集到的突变FIX基因突变已超过1000个， 包括点突 变

12、、 小片段的插入和缺失、 大片段的复制重排等多种突变类型， 其中最常见的是由单个碱基 突变所造成的错义突变、 无义突变和剪接突变。 0004 基因测序技术尚未普及之前， 家系连锁分析是最常用于血友病家族女性携带者检 测及产前基因诊断的方法。 由于连锁分析需提供家系中多名成员的血样， 尽可能使家系的 遗传信息完整， 且必须检测到具有多态性意义的标志性位点时才能采用， 因而在实际使用 时可能面临诸多的限制。 当采用的多态性位点位于基因外时， 也可能由于同源重组现象而 使得连锁分析出现错误， 导致最终的结果判定产生较大的误差。 直接突变检测通过DNA测序 仪对F9基因直接测序， 找出突变的确切位置，

13、 可提供更为准确的信息。 由于实现了自动化操 作， 我们采用的PCR结合DNA直接测序方法， 因而大大缩短了诊断时间， 节省了的人力和物 力， 测序效率高， 能够确定基因突变的位置和形式， 结果也更为明确。 0005 多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、 单链构象多态性(SSCP)、 异源双 链分析(HA)、 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法,但所有这些方 法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。 目前常用的基因突变检测的方法是 基因测序和荧光定量PCR等。 由于FIX容量大、 突变类型多、 突变率高、 突变位点散在分布,故 而阻止了对FIX

14、基因突变的深入研究， 荧光定量PCR法并不适用。 发明内容 0006 本发明提供检测FIX基因全外显子的引物， 采用Sanger测序法， 可用于快速检测 说明书 1/9 页 4 CN 105506106 A 4 FIX基因全外显子突变的情况， 用于HB的基因诊断。 0007 本发明的目的在于提供检测FIX基因全外显子的引物， 包括： 扩增覆盖检测FIX基 因全外显子突变的7对正、 反向引物； 其碱基序列为： 0008 FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT 0009 FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCT

15、GGCTGTTAGACTCT 0010 FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG 0011 FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC 0012 FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT 0013 FIX-4R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC 0014 FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA 0015 FI

16、X-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA 0016 FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG 0017 FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA 0018 FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA 0019 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT 0020 FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATA

17、ATATTGAGGAGACAG 0021 FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA 0022 进一步地， 所述7对正、 反向引物的使用浓度比为： FIX-1F:FIX-1R1:1； FIX-2+ 3F:FIX-2+3R1:1； FIX-4F:FIX-4R1:1； FIX-5F:FIX-5R1:1； FIX-6F:FIX-6R1:1； FIX-7F:FIX-7R1:1； FIX-8F:FIX-8R1:1。 0023 本发明的目的还在于提供一种检测FIX基因全外显子的方法， 其包括如下步骤： 0024 (1)提取样品DNA； 0025 (2)

18、利用7对扩增引物FIX-1F与FIX-1R； FIX-2+3F与FIX-2+3R； FIX-4F与FIX-4R； FIX-5F与FIX-5R； FIX-6F与FIX-6R； FIX-7F与FIX-7R； FIX-8F与FIX-8R对(1)中的DNA进行扩 增， 获得覆盖检测FIX基因全外显子序列的扩增产物； 0026 (3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序， 获 得所述扩增产物的基因序列； 0027 (4)将(3)中的基因序列与野生型FIX基因序列进行比较， 确定突变位点是否存在； 其中所述引物序列为： 0028 FIX-1-F： TGTAAAACG

19、ACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT 0029 FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT 0030 FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG 0031 FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC 0032 FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT 0033 FIX-4R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACAT

20、CATTATTAC 0034 FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA 0035 FIX-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA 0036 FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG 0037 FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA 说明书 2/9 页 5 CN 105506106 A 5 0038 FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAA

21、GCCAATA 0039 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT 0040 FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG 0041 FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA 0042 M13-F： TGTAAAACGACGGCCAGT 0043 M13-R： AACAGCTATGACCATG 0044 本发明的目的还在于提供一种检测FIX基因全外显子的试剂盒， 所述试剂盒包括 样品DNA抽提试剂； 无水乙醇； 检测体系PCR反应液

22、、 测序体系反应液、 阳性对照品、 阴性对照 品和空白对照品， 其中检测体系PCR反应液包括7对扩增引物FIX-1F与FIX-1R； FIX-2+3F与 FIX-2+3R； FIX-4F与FIX-4R； FIX-5F与FIX-5R； FIX-6F与FIX-6R； FIX-7F与FIX-7R； FIX-8F与 FIX-8R， 测序体系包括1对测序引物M13-F与M13-R， 包括： 0045 FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT 0046 FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT

23、 0047 FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG 0048 FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC 0049 FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT 0050 FIX-4R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC 0051 FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA 0052 FIX-5R： AACAGCTA

24、TGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA 0053 FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG 0054 FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA 0055 FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA 0056 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT 0057 FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACA

25、G 0058 FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA 0059 M13-F： TGTAAAACGACGGCCAGT 0060 M13-R： AACAGCTATGACCATG 0061 进一步地， 所述检测体系PCR反应液还包括2PCRBuffer； dNTPs； KODFXDNA Polymerase。 0062 进一步地， 所述测序体系还包括测序纯化液、 EDTA、 无水乙醇、 75乙醇、 HIDI和 BigdyeTerminatorV3.1。 0063 进一步地， 所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。 0064 本发明设计

26、了扩增覆盖检测FIX基因全外显子序列的7对正、 反向引物， 并创新性 的在PCR扩增的上游引物5 端和下游引物5 端分别加了一段长18bp的M13-F引物序列和长 16bp的M13-R引物序列。 这样扩增产物两端都会带上所引入的M13-F及M13-R引物序列， 随后 进行测序反应的时候， 所有的扩增产物可以使用统一的M13-F和M13-R引物进行正反向测 序。 因为FIX基因有8个外显子， 每个样本检测需要扩增7个PCR产物， 如果每个产物使用各自 的测序引物进行测序， 操作将会十分繁琐， 也极易引起污染。 而本试剂盒这样的设计有效的 避免了这一问题， 大大简化了测序反应的操作步骤， 使整个过

27、程非常便捷。 同时通过调整正 说明书 3/9 页 6 CN 105506106 A 6 反向引物的浓度、 退火温度等反应条件， 可使扩增效率达到最佳。 0065 利用本发明所述扩展引物和测序引物， 采用Sanger测序法检测FIX基因全外显子 序列的突变， 可以扩展整个全外显子序列， 通过测序结果的分析， 可以很直观的了解FIX基 因全外显子的基因突变情况， 并不受FIX突变多样化以及没有突变热点的影响， 可覆盖待检 测的所有突变位点， 且很大程度的节省了检测成本； 具有很高的特异性及准确性； 采用PCR 方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性， 具有灵敏度高， 操作简单、 成本低等优点。 附

28、图说明 0066 图1样品1的检测结果图。 0067 图2样品2的检测结果图。 0068 图3样品3的检测结果图。 0069 图4样品4的检测结果图。 0070 图5样品5的检测结果图。 0071 图6样品6的检测结果图。 0072 图7样品7的检测结果图。 具体实施方式 0073 下面结合具体实施例和附图， 进一步阐述本发明。 应当注意的是， 实施例中未说明 的常规条件和方法， 通常按照所属领域实验人员常规采用方法： 譬如， 奥斯柏和金斯顿主编 的 精编分子生物学实验指南 第四版， 或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。 0074 实施例1 0075 检测检测FIX基因全外显子的引物， 包括：

29、 扩增覆盖检测FIX基因全外显子的7对 正、 反向引物； 所述扩展引物的碱基序列为： 0076 FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT 0077 FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT 0078 FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG 0079 FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC 0080 FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGT

30、TGGCTTCCAGGTCAGTAGTT 0081 FIX-4R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC 0082 FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA 0083 FIX-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA 0084 FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG 0085 FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA 0086 FIX

31、-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA 0087 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT 0088 FIX-8F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG 0089 FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA 0090 所述引物还包括1对测序引物， 其碱基序列为 0091 M13-F： TGTAAAACGACGGCCAGT 说明书 4/9 页 7 CN 105506106 A 7 0092 M

32、13-R： AACAGCTATGACCATG 0093 在检测中， 先利用上述7对正、 反向扩增引物对覆盖检测FIX基因全外显子的DNA片 段进行扩增， 获得扩增产物， 然后利用上述1对测序引物对扩增产物进行测序， 获得扩增产 物的基因序列。 0094 在引物设计上， 所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧， 即扩增区 域包括了该外显子的全部序列。 因为FIX的突变位点很多， 突变类型不定。 因此本发明所述 引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来， 也保证无论外显子的何处位置发生突变， 都 不会出现漏检的情况。 因为第2和3号外显子序列都较短， 在基因序列中的位置分别是9291- 94

33、54,9643-9667， 中间的内含子序列也只有189bp， 因此本发明在检测第2和3号外显子时， 采用同一对扩增引物。 0095 检测检测FIX基因全外显子的试剂盒， 包括： 组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生 物的提取试剂盒)； 无水乙醇； 检测体系PCR反应液、 测序体系反应液、 阳性对照品、 阴性对照 品和空白对照品， 其中 0096 检测体系PCR反应液包括： 2PCRBuffer； 2mMdNTPs； KODFXDNAPolymerase (1U/ l)； 检测目的基因用的7对上、 下游引物FIX-1F(10 m)与FIX-1R(10 m)； FIX-2+3F(10 m)与FI

34、X-2+3R(10 m)； FIX-4F(10 m)与FIX-4R(10 m)； FIX-5F(10 m)与FIX-5R(10 m)； FIX- 6F(10 m)与FIX-6R(10 m)； FIX-7F(10 m)与FIX-7R(10 m)； FIX-8F(10 m)与FIX-8R(10 m)。 0097 测序体系包括： 测序纯化液、 EDTA(125mmol)、 无水乙醇、 75乙醇、 HIDI(高度去 离子甲酰胺)、 测序引物： M13-F(3.2 m)与M13-R(3.2 m)， 以及BigdyeTerminatorV3.1(购 买自美国AppliedBiosystems公司)， 其中

35、测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸 外切酶I(EXONI)1.2U。 0098 检测体系PCR反应液配制如下： 0099 0100 其中， FIX-1F与FIX-1R； FIX-2+3F与FIX-2+3R； FIX-4F与FIX-4R； FIX-5F与FIX-5R； FIX-6F与FIX-6R； FIX-7F与FIX-7R； FIX-8F与FIX-8R的碱基序列为： 0101 FIX-1-F： TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT 0102 FIX-1-R： AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTC

36、T 0103 FIX-2+3-F： TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG 0104 FIX-2+3-R： AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC 0105 FIX-4F： TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT 0106 FIX-4R： AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC 说明书 5/9 页 8 CN 105506106 A 8 0107 FIX-5F： TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAA

37、GGCTCCAA 0108 FIX-5R： AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA 0109 FIX-6F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG 0110 FIX-6R： AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA 0111 FIX-7F： TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA 0112 FIX-7R： AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT 0113 FIX-8F： TGTAAAACGACG

38、GCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG 0114 FIX-8R： AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA 0115 阳性对照品： 含有FIX序列的溶液。 0116 阴性对照品： 无FIX序列的溶液。 0117 空白对照品： 2 l生理盐水或不加任何物质。 0118 实施例2 0119 血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程： 0120 (1)抽提血液中的基因组DNA: 0121 1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液， 颠倒混匀， 室温放置5分钟， 期间再颠 倒混匀几次。 3000rpm离心5min， 吸去上清，

39、 留下白细胞沉淀， 加200uL缓冲液GA， 振荡至彻底 混匀。 0122 2)加入20 l蛋白酶K溶液， 混匀。 0123 3)加入200 l缓冲液GB， 充分颠倒混匀， 70放置10分钟， 溶液应变清亮， 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 0124 4)加入200 l无水乙醇， 充分振荡混匀15秒， 此时可能会出现絮状沉淀， 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 0125 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管 中)， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集管中。 0126 6)向吸附柱CB3中加入500 l缓冲液

40、GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管中。 0127 7)向吸附柱CB3中加入700 l漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管中。 0128 8)向吸附柱CB3中加入500 l漂洗液PW， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废 液。 0129 9)将吸附柱CB3放回收集管中， 12,000rpm(13,400g)离心2分钟， 倒掉废液。 将吸 附柱CB3置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸

41、附材料中残余的漂洗液。 0130 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加100 l 洗脱缓冲液TE， 室温放置2-5分钟， 12,000rpm(13,400g)离心2分钟， 将溶液收集到离心管 中。 0131 (2)试剂配置： 按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X l， 每人份18 l分装： 0132 X18 l反应液(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照) 0133 n为检测标本数。 0134 (3)加样： 加入3个检测体系PCR反应液中各2 lDNA； 阳性对照和阴性对照直接加2 说明书 6/9 页 9 CN 105506106 A 9

42、l阳性对照品和阴性对照品； 空白对照加2 l生理盐水或不加任何物质。 0135 (4)扩增： 检测在常规PCR仪上进行， 可用仪器包括ABIveriti(美国Applied Biosystems公司)等。 反应条件如下： 0136 0137 (5)sanger测序： 0138 取9 lPCR产物与2 l纯化体系。 按照以下程序进行纯化： 0139 0140 0141 将1 l纯化产物分别与测序引物： M13-F(3.2 m)与M13-R(3.2 m)， 按照如下体系进 行混合： 0142 0143 0144 测序反应程序： 说明书 7/9 页 10 CN 105506106 A 10 0145

43、 0146 沉淀环节： 0147 向完成测序反应的产物中加入2 l125mmol的EDTA， 静置5min； 加入15ml无水乙 醇， 漩涡混匀； 3700rpm离心30min； 倒置离心15sec， 加入50ml70乙醇， 漩涡混匀； 3700rpm 离心15min； 倒置离心15sec， 置于95金属浴上； 加入10 lHIDI后进行变性试验。 变性程 序： 0148 0149 变性程序结束后， 上测序仪(ABI3730)测序。 0150 (7)结果判断： 将测序结果与野生型参考序列(GeneBankNo.:K02402.1)进行比 对， 根据实际突变情况对结果进行报告。 0151 实施例

44、3 0152 取临床患者样本7份， 7份样本都不确定是否患有HB， 检测该7份样本是否存在FIX 突变。 按实施例2所述方法提取基因组、 配制试剂并检测。 每份样品加入检测体系PCR反应液 中2 l。 同时做阳性， 阴性， 空白对照各一份。 用普通PCR仪检测， 时间为160分钟。 0153 样品1的第1号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。 0154 样品2的第2号和3号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未 检测出FIX突变。 0155 样品3的第4号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。

45、 0156 样品4的第5号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。 0157 样品5的第6号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。 0158 样品6的第7号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。 0159 样品7的第8号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测出 FIX突变。 0160 从检测结果可以看出， 本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了， 能够扩展 说明书 8/9 页 11 CN 105506106 A 11 出FIX基因全外显子， 并且测序结

46、果完全准确。 本发明所述引物可以准确的扩展出FIX基因 全外显子序列， 无论是野生型还是突变型。 说明书 9/9 页 12 CN 105506106 A 12 0001 序列表 1/6 页 13 CN 105506106 A 13 0002 序列表 2/6 页 14 CN 105506106 A 14 0003 序列表 3/6 页 15 CN 105506106 A 15 0004 序列表 4/6 页 16 CN 105506106 A 16 0005 序列表 5/6 页 17 CN 105506106 A 17 0006 序列表 6/6 页 18 CN 105506106 A 18 图1 图2 图3 图4 图5 说明书附图 1/2 页 19 CN 105506106 A 19 图6 图7 说明书附图 2/2 页 20 CN 105506106 A 20