肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510784435.4 (22)申请日 2012.11.09 FERM BP-11512 2012.10.26 FERM BP-11513 2012.10.26 FERM BP-11514 2012.10.26 FERM BP-11515 2012.10.26 2011-248438 2011.11.14 JP 201280050798.X 2012.11.09 C12P 19/46(2006.01) C07D 309/10(2006.01) A61K 31/047(2006.01) A61P 3/06(2006.01) (71)申

2、请人 旭化成化学株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 小西一诚 今津晋一 佐藤真弓 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 丁香兰 李洋 (54) 发明名称 肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法 (57) 摘要 本发明提供肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制 造方法。本发明的目的在于， 针对适于应用基因 重组技术与合成生物学方法的大肠杆菌等不具有 内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物， 赋 予显著得到改善的肌肉肌醇生产能力。在本发明 中， 使下述转化体中的肌醇单磷酸酶活性增强， 该 转化体是在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路 的宿主微生物内导入肌肉肌醇生物合成通

3、路而得 到的。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书21页 序列表8页 附图4页 CN 105506036 A 2016.04.20 CN 105506036 A 1.一种肌肉肌醇衍生物， 其是下述结构式所表示的化合物： 化2 2.一种肌肉肌醇的制造方法， 其特征在于， 利用能够催化 -糖苷键的水解反应的酶将 权利要求1所述的肌肉肌醇衍生物分解， 生成肌肉肌醇。 3.一种组合物， 其含有权利要求1所述的肌肉肌醇衍生物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105

4、506036 A 2 肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法 0001 本申请是分案申请， 其原申请的国际申请号是PCT/JP2012/079182， 国际申请日是 2012年11月9日， 中国国家申请号为201280050798.X， 进入中国的日期为2014年4月16日， 发 明名称为 “肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法” 。 技术领域 0002 本发明涉及基因重组技术在肌肉肌醇的制造中的应用。 特别是涉及利用原核微生 物的转化体的肌肉肌醇的工业制造方法。 本发明进一步涉及新颖的肌肉肌醇衍生物及其制 造方法。 背景技术 0003 肌肉肌醇对于多数高等动物来说为必不可缺的物质， 因而其作为营养

5、食品、 饲料、 药品等成分广泛使用。 例如， 已知肌肉肌醇在脂肪和胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用， 在高胆固醇血症等的预防或治疗中是特别有效的。 因而， 对于以工业规模制造肌肉肌醇的 制造工艺提出了多种改良方案。 0004 以往， 肌肉肌醇是从米糠、 玉米浆等直接提取的， 但该提取方法中， 肌肉肌醇的收 率低， 并且大量生成杂质， 因而肌肉肌醇的精制困难， 生产效率极低。 因此， 还有人提出了对 具有肌肉肌醇生产能力的面包酵母进行培养， 由该培养物中生成肌肉肌醇的方法， 但该方 法的生产率仍然较低， 在经济上不成立， 因而未进行工业实施。 0005 因而， 对更加有效地生产肌醇的微生物进行了

6、检索。 专利文献1公开了可向菌体外 分泌肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。 专利文献2和3分别公开了在上述假丝酵母属 酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢抵抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。 另外， 在专利 文献4、 5和6中还分别公开了通过在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针 对叔胺、 六氯环己烷和十六烷基三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌醇的收率的内容。 专利 文献7中同样公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-卤代-6- 脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。 在专利文献8中还公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵 母属酵母中导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。 00

7、06 进一步地， 现有技术还记载了利用基因重组进行的酵母的转化。 在专利文献9中公 开了下述内容： 在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中， 肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应， 在这一恰当推论下， 通过单独利用编码上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA对不具有肌醇分泌能 力的假丝酵母属酵母进行转化而对该酵母赋予肌醇生产能力。 在专利文献10中公开了通过 将置于甘油-3-磷酸脱氢酶基因启动子的调节下的编码肌醇-1-磷酸合成酶的DNA单独导入 酵母， 来提高该酵母的肌醇生产率的内容。 0007 进一步地， 专利文献11中还涉及甲醇利用性酵母毕赤酵母进行肌醇生产的内容， 其中公开了在该酵母中导入肌肉肌醇-1-磷

8、酸合成酶基因并同时导入肌醇磷酸磷酸酯酶基 因的内容， 但未明确该追加的肌醇磷酸磷酸酯酶基因导入的意义和效果。 0008 因而， 关于上述酵母的任一文献均是以在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中肌 说明书 1/21 页 3 CN 105506036 A 3 醇-1-磷酸合成酶承担控速反应为前提的， 并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除 此以外的酶的重要性。 0009 另一方面， 对于以大肠杆菌为代表的原核微生物， 由于其旺盛的增殖能力及发酵 管理中的各种优越性， 与酵母相比， 其为极富魅力的工业生产用生物。 但是， 具有内源性肌 肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不为人所知。 0010 因而， 为

9、了利用原核微生物进行肌肉肌醇的工业生产， 在原核微生物宿主内构建 外来性的肌肉肌醇生物合成通路为不可缺的。 0011 具体地说， 为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路， 下述催 化剂活性为必要的： 0012 活性1： 由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性； 0013 活性2： 将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、 即肌醇-1-磷酸合成酶 活性； 和 0014 活性3： 以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酯酶活性。 0015 但是， 由于作为活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸为原核微生物普遍产生的代谢中 间体， 因而对原核微生物赋予该活性并非为必须的。 此外， 对于活

10、性3来说， 就本发明人所 知， 大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性 肌醇单磷酸酶、 或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。 此外， 若对 活性2进行观察， 则多为原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。 并且， 如上所 述， 在肌肉肌醇生物合成反应中， 认为肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应。 因而， 为了在原核 微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路， 认为在该细胞中导入肌醇-1-磷酸合成 酶基因是充分必要的。 0016 实际上， 非专利文献1公开了肌肉肌醇在大肠杆菌转化体内的生产， 但仅在该转化 体中导入了肌醇-1-磷酸

11、合成酶基因。 0017 专利文献12中还公开了在大肠杆菌宿主细胞中仅导入肌醇-1-磷酸合成酶基因来 制作转化体、 由此在该转化体内构建外来性肌肉肌醇生物合成通路的内容。 但是， 该文献的 最终目的生成物为D-葡糖二酸， 肌肉肌醇是作为中间体生产的。 特别要指出的是， 该文献中 还记载了下述内容：“还应该注意到， 本发明中的suhB基因或相同的磷酸酯酶并未过剩表 达。 但是， 在培养产物中未检测出肌肉肌醇-1-磷酸， 另一方面却蓄积了肌肉肌醇。 因而发明 人得出结论， 磷酸酯酶活性并未限制通过通路的代谢流(flux)。 ” (第33页、 第25行)。 0018 因而， 现有技术并未公开或暗示肌醇

12、单磷酸酶在通过重组微生物进行肌肉肌醇生 产中的决定性作用。 0019 现有技术文献 0020 专利文献 0021 专利文献1： 日本特开平8-00258号公报 0022 专利文献2： 日本特开平8-38188号公报 0023 专利文献3： 日本特开平8-89262号公报 0024 专利文献4： 日本特开平9-117295号公报 0025 专利文献5： 日本特开平10-42860号公报 0026 专利文献6： 日本特开平10-42882号公报 说明书 2/21 页 4 CN 105506036 A 4 0027 专利文献7： 日本特开平10-42883号公报 0028 专利文献8： 日本特开20

13、00-41689公报 0029 专利文献9： 日本特开平9-220093号公报 0030 专利文献10： 日本特开平10-271995号公报 0031 专利文献11： 日本特开2011-55722号公报 0032 专利文献12： WO2009/145838号小册子 0033 非专利文献 0034 非专利文献1： J.Am.Chem.Soc.1999,Vol.121,3799-3800 发明内容 0035 发明所要解决的课题 0036 对于不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物， 通过使用与基因重组技术联 合的合成生物学方法， 其具有容易调节肌肉肌醇生产率的优点。 特别是大肠杆菌等原核微 生物

14、宿主除了不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路以外， 还不具有多数酵母所具有的肌醇 同化能力(分解能力)， 因而更容易应用合成生物学的方法。 此外， 对于大肠杆菌来说， 由于 其迅速的生长能力及发酵管理的容易性， 从工业发酵生产的方面考虑其是极富魅力的， 同 时从应用基因重组技术时的实际成绩、 确定的安全性的方面出发也具有优点。 0037 因而， 本发明所要解决的课题在于对不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物赋予显著得到改善的肌肉肌醇和相关衍生物的生产能力。 0038 解决课题的手段 0039 如上所述， 在迄今为止的任一研究中， 均暗示了肌醇-1-磷酸合成酶在肌肉肌醇生 物合成反应中承担

15、控速反应的内容。 并且， 在任一研究中均未对肌醇单磷酸酶活性予以特 別关注。 0040 但是， 本发明人令人吃惊地发现， 在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中， 肌醇单磷酸酶活性具有重大的作 用。 出人预料地， 通过增强肌醇单磷酸酶活性， 这样的转化体的肌肉肌醇生产能力大幅提 高。 本发明人进一步发现， 在这样的转化体的培养物中表达出了新型的肌肉肌醇衍生物。 0041 因而， 本发明的第1方面在于： 0042 (1)一种肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法， 其包括下述工序： 0043 1)准备转化体的工序， 该转化体为不表达内源性肌醇-1-

16、磷酸合成酶的微生物的 转化体， 其至少含有以能够在该转化体内表达的方式导入的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外 来基因， 并且具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化 进行诱导的基因重组或变异； 以及 0044 2)在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下， 使该转化体与能够由该转化体 转换为肌肉肌醇的碳源进行接触的工序。 0045 更特定地说， 上述制造方法为使用下述转化体的肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制 造方法， 该转化体为具有以能够表达的方式导入到不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微 生物内的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因的转化体， 其特征在于， 上述转化体具有对功

17、 能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。 说明书 3/21 页 5 CN 105506036 A 5 0046 上述(1)的培养物中生产的肌肉肌醇衍生物为新颖的化合物， 在该衍生物中， 葡萄 糖与肌肉肌醇呈 14键合。 因而， 本发明的一个方式为： 0047 (2)如上述(1)所述的制造方法， 其中， 上述肌肉肌醇衍生物为下述结构式所表示 的化合物： 0048 化1 0049 0050 前面已经对合成生物学方法的应用和发酵生产中的原核微生物、 特别是大肠杆菌 的优点进行了叙述。 因而， 本发明的适宜方式包括： 0051 (3)如上述(1)或(2)所述的制造方法

18、， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成 酶的微生物为原核生物； 0052 (4)如上述(1)或(3)的任一项所述的制造方法， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1- 磷酸合成酶的微生物为具有内源性肌醇单磷酸酶基因的微生物； 0053 (5)如上述(1)或(4)的任一项所述的制造方法， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1- 磷酸合成酶的微生物为选自由大肠杆菌、 芽胞杆菌属细菌、 棒状杆菌属细菌、 发酵单胞菌属 细菌组成的组中的细菌； 以及 0054 (6)如上述(5)所述的制造方法， 其中， 上述细菌为大肠杆菌。 0055 无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性， 通过在该细胞内过剩生产

19、肌 醇单磷酸酶， 可增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。 可应用各种公知的技术进行肌醇单磷酸 酶的过剩生产。 因而， 本发明包括以下的方式： 0056 (7)如上述(1)或(6)的任一项所述的制造方法， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的过剩生 产是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的： 0057 a)导入外来肌醇单磷酸酶基因； 0058 b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数； 0059 c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域导入变异； 0060 d)利用高表达诱导性外来调节区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域； 或者 0061 e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失； 以及 0062 (8)如

20、上述(7)所述的制造方法， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上 述微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而诱导的。 0063 此外， 在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下， 也可利用下述方式来 增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。 0064 (9)如上述(1)或(6)的任一项所述的制造方法， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的活化是 通过对上述微生物进行下述操作而诱导的： 0065 f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异； 0066 g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部； 0067 h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失； 说明书 4/21 页 6 CN 105506036 A 6 00

21、68 i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少； 或者 0069 j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。 0070 在本发明的肌肉肌醇的发酵生产中， 使用下述碳源作为培养基材为适宜的， 该碳 源含有适于生成作为肌醇-1-磷酸合成酶底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。 进一步地， 本发 明的制造方法还可以包括下述的附加工序， 在该附加工序中， 从在与该碳源的接触下进行 生长和/或维持的上述转化体的培养物中分离出肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物。 因而， 本发明 的进一步适宜的方式包括： 0071 (10)如上述(1)或(9)的任一项所述的制造方法， 其中， 上述碳源包含可在上述转 化体内转换为葡萄

22、糖-6-磷酸的化合物； 0072 (11)如上述(10)所述的制造方法， 其中， 上述碳源为选自由D-葡萄糖、 蔗糖、 寡糖、 多糖、 淀粉、 纤维素、 米糠、 废糖蜜以及D-葡萄糖的生物物质组成的组中的1种以上； 以及 0073 (12)如上述(1)或(11)的任一项所述的制造方法， 其中， 该方法进一步包括分离肌 肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的工序， 该肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物是在与上述碳源的接触下 进行生长和/或维持的上述转化体的培养物中累积得到的。 0074 此外， 本发明还谋求用于上述肌肉肌醇的制造方法的转化体。 因而， 本发明的第2 方面在于： 0075 (13)一种转化体， 其为不表达

23、内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的转化体， 该转 化体至少含有以能够在该转化体内表达的方式导入的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基 因， 并且具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行 诱导的基因重组或变异。 0076 更特定地说， 上述转化体为具有以能够表达的方式导入到不表达内源性肌醇-1- 磷酸合成酶的微生物内的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因的转化体， 其特征在于， 该转 化体具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组 或变异。 0077 此外， 本发明第1方面中记载的方式也适用于本发明的第2方面。 这些方式包括： 0078 (

24、14)如上述(13)所述的转化体， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微 生物为原核生物； 0079 (15)如上述(13)或(14)所述的转化体， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成 酶的微生物为具有内源性肌醇单磷酸酶基因的微生物； 0080 (16)如上述(13)或(15)的任一项所述的转化体， 其中， 上述不表达内源性肌醇-1- 磷酸合成酶的微生物为选自由大肠杆菌、 芽胞杆菌属细菌、 棒状杆菌属细菌、 发酵单胞菌属 细菌组成的组中的细菌； 0081 (17)如上述(16)所述的转化体， 其中， 上述细菌为大肠杆菌； 0082 (18)如上述(13)或(17)的任一项所

25、述的转化体， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的过剩 生产是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的： 0083 a)导入外来肌醇单磷酸酶基因； 0084 b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数； 0085 c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域导入变异； 0086 d)利用高表达诱导性外来调节区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域； 说明书 5/21 页 7 CN 105506036 A 7 或者 0087 e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失； 0088 (19)如上述(18)所述的转化体， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上 述微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而诱导的； 以及 00

26、89 (20)如上述(13)或(17)的任一项所述的转化体， 其中， 上述肌醇单磷酸酶的活化 是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的： 0090 f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异； 0091 g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部； 0092 h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失； 0093 i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少； 0094 j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。 0095 本发明的第3方面为被发现在上述转化体的培养物中生产出的新颖的肌肉肌醇衍 生物。 因而， 本发明在于： 0096 (21)下述结构式所表示的化合物： 0097 化2 0098 0

27、099 进一步还确认到， 本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物通过能够催化 -糖苷键的水解 反应的酶(EC3.2.1.21等)而容易地分解成葡萄糖与肌肉肌醇。 该酶分解能够通过利用该 酶对上述(1)中得到的培养物进行直接处理、 利用该酶对该培养物的粗制物进行处理、 或者 利用该酶对分离出的本发明的肌肉肌醇衍生物进行处理的任一种手段来达成。 因而， 本发 明的第4方面在于： 0100 (22)一种肌肉肌醇的制造方法， 其特征在于， 利用能够催化 -糖苷键的水解反应 的酶将上述(21)的肌肉肌醇衍生物分解， 生成肌肉肌醇。 0101 进一步地， 本发明谋求含有本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物的组合物。 例如，

28、 肌肉 肌醇作为营养食品、 饲料、 药品等的成分得到广泛利用。 但是， 在环境中， 存在有同化肌肉肌 醇的酵母、 芽孢杆菌属细菌和肠内细菌等。 因而， 将肌肉肌醇作为营养食品、 饲料、 药品等中 所用的组合物加以利用时， 优选保护肌肉肌醇免受上述的肌肉肌醇同化性细菌等的影响直 至发挥出其生理作用。 从而， 本发明的第5方面在于： 0102 (23)一种组合物， 其含有上述(21)的肌肉肌醇衍生物。 0103 发明的效果 0104 根据本发明， 能够利用微生物培养技术有效达成肌肉肌醇的工业生产。 此外， 本发 明提供新颖的肌肉肌醇衍生物。 本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物容易转换为肌肉肌醇， 对 于

29、同化肌肉肌醇的微生物等具有抵抗性。 附图说明 0105 图1示出了INO1基因的编码区域(序列编号1)。 说明书 6/21 页 8 CN 105506036 A 8 0106 图2示出了suhB基因的编码区域(序列编号3)。 0107 图3示出了本发明肌肉肌醇衍生物的生产例。 图中箭头表示含有本发明肌肉肌醇 衍生物的级分。 是利用将KS-G(保护柱)、 SugarKS-801和SugarKS-802(均为商品名， 昭和 电工株式会社制造)联结得到的HPLC(移动相： 水、 柱温度： 70、 流速： 1mL/min、 检测器： RI)进行分析的结果。 0108 图4为本发明肌肉肌醇衍生物的1H-

30、NMR光谱。 0109 图5为本发明的肌肉肌醇衍生物的13C-NMR光谱。 0110 图6示出了本发明肌肉肌醇衍生物利用 -葡糖苷酶进行的分解例。 是利用使用了 ShodexAsahipakNH2P-504E(商品名、 昭和电工株式会社制造)的HPLC(移动相： 水/乙腈 25/75、 柱温度： 40、 流速： 0.8mL/min、 检测器： RI)进行分析的结果。 具体实施方式 0111 本发明的课题是通过在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物内导 入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中、 即在不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿 主微生物中导入该酶的外来基因而得到的转化体中， 增强

31、肌醇单磷酸酶的活性而得到解决 的。 需要说明的是， 在本说明书中，“外来” 或 “外来性” 这一术语表示的是， 在转化前的宿主 微生物不具有要由本发明导入的基因的情况下； 在实质上不表达由该基因编码的酶的情况 下； 以及该酶的氨基酸序列由不同的基因编码、 但在转化后不表达相匹配的内源性酶活性 的情况下， 向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。 0112 如上所述， 对于本发明的宿主微生物的 “不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的” 这 一特性， 由于能够在该宿主细胞内新构建肌肉肌醇生物合成通路(即， 无现有内源性通路的 影响)， 因而在合成生物学方法的应用中是极富魅力的。 所示例出的原核微生物

32、为埃希氏 菌、 假单胞菌、 芽胞杆菌、 地芽胞杆菌、 甲烷单胞菌、 甲基芽孢杆菌、 嗜甲基菌、 精蛋白杆菌、 甲基球菌、 棒状杆菌、 短杆菌、 发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。 工业发酵生产中适宜的 原核微生物的非限定性示例包括大肠杆菌、 芽胞杆菌属细菌、 棒状杆菌属细菌、 发酵单胞菌 属细菌。 大肠杆菌由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性的原因是本发明中特别优选 的宿主微生物的示例。 0113 此外， 能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以为通常含义下的野生型菌 株， 或者也可以为营养要求性变异株、 抗生素耐性变异株。 进一步地， 能够作为本发明的宿 主细胞使用的细胞株可以已经被转化从而

33、使之具有与上述变异相关的各种标记基因。 这些 变异或基因能够提供对于本发明转化体的制作、 维持、 管理有益的性质。 优选的是， 通过使 用显示出对于氯霉素、 氨苄青霉素、 卡那霉素、 四环素等抗生素的耐性的菌株， 能够简便地 进行本发明的肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的生产。 0114 在面向合成生物学的本发明中， 为了在宿主细胞中构建新的肌肉肌醇生物合成通 路， 对于上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿主微生物导入外来肌醇-1-磷酸合成酶 基因。 肌醇-1-磷酸合成酶基因为已知的(例如， 基因库登录号.AB032073、 AF056325、 AF071103、 AF078915、 AF1201

34、46、 AF207640、 AF284065、 BC111160、 L23520、 U32511)， 它们均可 在本发明的目的中使用。 特别是酵母来源的INO1基因(序列编号1)是广为人知的肌醇-1-磷 酸合成酶基因的示例， 也能够在本发明中适宜地使用。 但是， 能够用于本发明的肌醇-1-磷 说明书 7/21 页 9 CN 105506036 A 9 酸合成酶基因并不限于酵母来源的基因， 其可来源于其它真核微生物或此外的生物、 或者 可以为人工合成的基因， 只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合 成酶活性即可。 0115 从而， 对于能够用于本发明目的的肌醇-1-磷酸合成酶

35、基因， 只要在上述宿主微生 物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性， 可以具有能够在自然界发生的全部 变异、 或者具有人工导入的变异和修饰。 例如， 已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在 冗余密码子(redundancy)。 因此， 在本发明中也可利用最终可翻译成相同氨基酸的代替密 码子。 即， 由于基因编码的简并， 因而编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子， 因此 氨基酸序列可利用任意1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码得到。 虽然仅这组唯一的成员与 天然型酶的基因序列相同， 但即便是不匹配的的某DNA低聚核苷酸， 在适当的严谨条件下 (例如， 3xSSC、 68杂交、 2x

36、SSC、 0.1SDS和68清洗)也能够与天然型序列杂交， 能够对编 码天然型序列的DNA进行鉴定、 分离， 进一步还可将这样的基因用于本发明中。 特别是已知 大部分生物优选使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene、 Vol.105、 pp.61-72、 1991等)， 因而根据宿主微生物进行 “密码子最佳化” 在本发明中也是有用的。 0116 并且， 在本发明中， 也可通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因以 “表达盒” 的形式导入到 宿主微生物细胞内来更为稳定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性， 这对本领域技术 人员来说是可以理解的。 在本说明书中，“表达盒” 是指含有与表达对象的核酸或表

37、达对象 的基因功能性结合的对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。 代表性地， 本发明的 表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5 上游含有启动子序列、 在3 下游含有终止子序 列、 根据情况进一步含有通常的调节元件， 在这样的情况下， 表达对象的核酸或表达对象的 基因以 “能够表达的方式导入” 到宿主微生物中。 0117 关于启动子， 不论是结构性启动子还是调节启动子， 均被定义为使RNA聚合酶与 DNA结合、 引发RNA合成的DNA序列。 强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子， 在本发明中 也适于使用。 可根据该宿主细胞的性质等使用lac系、 trp系、 TAC或TRC系、 噬菌体的主

38、要操 纵子和启动子区域、 fd包覆蛋白质的调节区域、 针对糖酵解系酶(例如， 3-磷酸甘油酸激酶、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、 谷氨酸脱羧酶A、 丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。 除了启动子和 终止子序列以外， 可作为其它调节元件的示例举出的序列为选择标记、 扩增信号、 复制起点 等。 适宜的调节序列例如记载于 “GeneExpressionTechnology： MethodsinEnzymology 185” 、 AcademicPress(1990)中。 0118 上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、 噬菌体、 转座子、 IS元件、 噬粒、 粘粒、 或者 线状或环状DNA等构成的载体中， 使

39、其插入到宿主微生物中。 优选质粒和噬菌体。 这些载体 在宿主微生物中可自体复制， 也可通过染色体复制。 适宜的质粒例如为： 大肠杆菌的 pLG338、 pACYC184、 pBR322、 pUC18、 pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHS1、 pKK223-3、 pDHE19.2、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III113-B1、 gt11或pBdCI； 杆菌的pUB110、 pC194或 pBD214； 棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。 除它们以外， 能够使用的质粒等还记载于 “CloningVectors” 、

40、Elsevier、 1985中。 表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限 制酶切割、 克隆化以及连接的惯用方法进行。 0119 如上述那样构建出具有本发明的表达盒的载体后， 作为将该载体导入到宿主微生 物中时能够适用的方法， 例如使用共沉淀、 原生质体融合、 电穿孔、 逆转录病毒转染等惯用 说明书 8/21 页 10 CN 105506036 A 10 的克隆化法和转染法。 它们的示例记载于 “分子生物学的最新实验计划( Current ProtocolsinMolecularBiology)” ， F.Ausubel等， Publ.WileyInterscience， New York，

41、 1997； 或Sambrook等，“分子克隆： 实验室手册” ， 第2版， ColdSpringHarbor Laboratory， ColdSpringHarborLaboratoryPress， ColdSpringHarbor， NY， 1989中。 0120 本发明人令人吃惊地发现， 在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物 内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中， 肌醇单磷酸酶活性具有重大作用。 如上 所述， 在迄今为止的任一研究中， 均未对肌醇单磷酸酶活性予以特別关注。 但是， 出人意料 地， 通过增强肌醇单磷酸酶活性， 这样的转化体的肌肉肌醇生产能力大幅提高。 此外，

42、 这样 的转化体以实质量生产出了本发明的肌肉肌醇衍生物。 0121 因而， 本发明的一个方式包括： 在由上述编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因转化 得到的宿主微生物细胞中进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。 0122 对于本发明中谋求的肌醇单磷酸酶， 除了对肌醇-1-磷酸显示出高底物特异性外， 还显示出了可作用于广泛的底物的磷酸单酯水解酶活性， 从而包括实质上能够水解肌醇- 1-磷酸的蛋白质。 作为代表性的肌醇单磷酸酶， 例如已知有肌醇-1-单磷酸酶， 大量生物来 源的该基因(suhB基因)在基因库登录号ZP04619988、 YP001451848等中公布。 特别是大 肠杆菌来源的的suhB基因(序

43、列编号3： AAC75586(MG1655)的使用在以大肠杆菌为宿主细 胞的情况下较为方便。 0123 本领域技术人员容易理解， 在肌醇-1-磷酸合成酶基因中记载的变异、 修饰和密码 子最佳化及表达盒、 启动子等调节序列和质粒等以及基于此的转化的说明对于本发明的所 有肌醇单磷酸酶基因是适用的。 从而可知， 本发明中的肌醇单磷酸酶的过剩生产可通过利 用外来肌醇单磷酸酶基因的表达盒对上述宿主微生物进行转化而达成。 0124 进一步认为， 大量微生物细胞表达本发明中谋求的肌醇单磷酸酶活性(即， 具有编 码肌醇单磷酸酶活性的内源性基因)。 因而， 本发明中的肌醇单磷酸酶的过剩生产还可通过 进行下述操作

44、而诱导： 增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数； 在内源性肌醇单磷酸酶基 因的调节区域导入变异； 利用高表达诱导性外来调节区域置换内源性肌醇单磷酸酶基因的 调节区域； 以及使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失。 具体地说， 为了达成肌醇单磷 酸酶的过剩表达， 可通过进行下述操作来达成： 利用含有内源性肌醇单磷酸酶基因或含有 在该内源性基因的编码化区域添加了适当的调节区域而得到的表达盒的构建体对上述宿 主微生物进行转化， 使该转化体内的该肌醇单磷酸酶基因的拷贝数与原来的宿主细胞相比 实质上增加； 对于具有内源性肌醇单磷酸酶基因的原来的宿主细胞， 通过公知的基因重组 技术实施染色体的变异、 添加和

45、缺失； 或者使用诱变剂等在染色体中随机导入变异。 可以使 用公知的SDS-PAGE分析法等对肌醇单磷酸酶的过剩生产进行确认。 0125 进一步地， 用于增强肌醇单磷酸酶活性的本发明的其它方式包括： 在由上述编码 肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因转化得到的宿主微生物细胞中诱导肌醇单磷酸酶的活化。 为进行该目的， 可示例出下述的方法： 1)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异； 2)置换内 源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部； 3)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失； 4) 使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少； 和/或5)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物 的生成减少。 0126 关于用于增强上述肌

46、醇单磷酸酶活性的1)5)的方法， 具体地说， 通过在对肌醇 说明书 9/21 页 11 CN 105506036 A 11 单磷酸酶的基因实施变异、 添加或缺失后对该基因所编码的肌醇单磷酸酶的活性进行评 价， 从而得到肌醇单磷酸酶活性得到增强的肌醇单磷酸酶。 0127 对于如上所述得到的转化体、 例如利用具有外来肌醇-1-磷酸合成酶基因的表达 盒和肌醇单磷酸酶基因的表达盒的载体(各表达盒可以配置在不同或相同载体上)进行转 染而得到的转化体， 为了进行本发明肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物生产， 可在适于上述转化 体的生长和/或维持的条件下进行培养和维持。 来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用 的适宜的

47、培养基组成、 培养条件、 培养时间对于本领域技术人员为已知的。 0128 培养基可以为含有1种以上的碳源、 氮源、 无机盐、 维生素以及必要时的微量元素 或维生素等微量成分的天然、 半合成、 合成培养基。 但是， 不消说所使用的培养基必须适当 满足所要培养的转化体的营养要求。 进一步地， 为了使上述转化体与能够由该转化体转换 为肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的碳源进行接触， 本发明的培养基应该含有可最终作为肌肉 肌醇生产的底物使用的碳源、 即可在转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物。 碳源可以为 D-葡萄糖、 蔗糖、 寡糖、 多糖、 淀粉、 纤维素、 米糠、 废糖蜜， 进而可以为含有D-葡萄糖的生

48、物 物质。 作为适宜的生物物质， 可示例出玉米分解液或纤维素分解液。 此外， 在转化体表达有 用附加形状的情况下、 例如在具有针对抗生素的耐性标记的情况下， 培养基可以含有相应 的抗生素。 由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。 0129 在宿主微生物无法同化上述的纤维素或多糖类等碳源的情况下， 可通过实施在该 宿主微生物中导入外来基因等公知的基因工程方法使其适应于使用这些碳源的肌肉肌醇 生产中。 作为外来基因， 可以举出例如纤维酶基因或淀粉酶基因等。 0130 培养可以为分批式也可以为连续式。 并且， 在任一情况下， 均可为在适当的培养时 刻补给所追加的上述碳源等的形式。 此外， 培养应在维

49、持适宜的温度、 氧浓度、 pH等的条件 下继续进行。 来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为1545、 优选为2537的范围。 宿主微生物为好氧性的情况下， 为了确保发酵中的适当的氧浓 度， 需要进行振荡(烧瓶培养等)、 搅拌/通气(发酵罐培养等)。 这些培养条件可由本领域技 术人员容易地设定。 0131 由上述培养物精制肌肉肌醇的方法对于本领域技术人员是公知的。 在为原核微生 物宿主细胞的转化体的情况下， 肌肉肌醇在培养上清中或菌体内存在， 必要时可由培养菌 体进行提取。 在由培养菌体提取的情况下， 例如， 可对培养物进行离心分离、 将上清与菌体 分离， 利用均质器并同时利用表面活性剂、 有机溶剂、 酶等破坏菌体。 作为由培养上清以及 必要时还由菌体提取液精制肌肉肌醇的方法， 可以举出： 在实施了利用通过pH调整等进行 的蛋白质沉淀的除蛋白处理、 通过利用活性炭的杂质吸附进行的去除、 通过利用离子交换 树脂等的离子性物质的吸附进行的去除之后， 将干燥得到的固体从例如水-乙醇系中进行 再结晶。 当然也可根据制品的目的纯度省去部分工序、 或者实施色谱法等追加精制工序， 这 自不言说。 0132 另外， 还可进一步从在适当条件下进行培养得到的上述培养物中得到本发明的新 颖的肌肉肌醇衍生物。 代表性的本发明