艰难梭菌毒素A/B的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610080808.4 (22)申请日 2016.02.04 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州赛哲生物科技股份有限公司 地址 510000 广东省广州市国际生物岛螺旋 四路一号研发 A 区 304-305 (72)发明人 罗宝花 曾宏彬 陈杰 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 宋静娜 (54) 发明名称 艰难梭菌毒素 A/B 的荧光定量 PCR 检测试剂 盒及检测方法 (57) 摘要 本发

2、明公开了的艰难梭菌毒素 A/B 的探针法 荧光定量 PCR 检测试剂盒及检测方法， 其既能检 测艰难梭菌又能检测并定量毒素 A 和毒素 B 基 因。本发明的检测试剂盒主要包括特异性引物和 探针， 所述特异性引物和探针由检测艰难梭菌的 引物对、 检测艰难梭菌毒素 A 的引物对和探针、 检 测艰难梭菌毒素 B 的引物对和探针组成。本发明 操作简单、 报告时间短， 能特异、 灵敏又准确地首 次鉴定艰难梭菌菌株并完成对艰难梭菌关键毒素 A 和 B 的检测及其定量。为艰难梭菌感染的早期 诊断提供了基础， 适用于临床不明原因腹泻病人 的病因筛查。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权

3、局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 序列表8页 附图8页 CN 105525023 A 2016.04.27 CN 105525023 A 1.一种检测艰难梭菌的引物对， 其特征在于： 所述引物对的上游引物具有如SEQID NO： 1所示的序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 2所示的序列。 2.一种检测艰难梭菌毒素A的引物对， 其特征在于： 所述引物对的上游引物具有如SEQ IDNO： 3所示的序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 4所示的序列。 3.一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针， 其特征在于： 所述探针具有如SEQIDNO： 5所示的

4、序列或其互补序列。 4.根据权利要求3所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针， 其特征在于： 在寡核苷 酸的5 末端结合有荧光物质， 在3 末端结合有淬灭物质。 5.根据权利要求4所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针， 其特征在于： 所述荧光 物质为FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 ROX中的至少一种； 所述淬灭物质为TAMRA、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 DABCYL中的至少一种。 6.一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组， 其特征在于： 其具有权利要求2所述的检测 艰难梭菌毒素A的引物对和权利要求3所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针。 7.一种检测艰难梭菌毒素

5、B的引物对， 其特征在于： 所述引物对的上游引物具有如SEQ IDNO： 6所示的序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 7所示的序列。 8.一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针， 其特征在于： 所述探针具有如SEQIDNO： 8所示的序列或其互补序列。 9.根据权利要求8所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针， 其特征在于： 在寡核苷 酸的5 末端结合有荧光物质， 在3 末端结合有淬灭物质。 10.根据权利要求9所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针， 其特征在于： 所述荧光 物质为FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 ROX中的至少一种； 所述淬灭物质为TAMRA、

6、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 DABCYL中的至少一种。 11.一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组， 其特征在于： 其具有权利要求7所述的检测 艰难梭菌毒素B的引物对和权利要求8所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针。 12.一种特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对， 其特征在于： 其具有外侧引物对和 内侧引物对； 所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 9所示的序列， 所述引物对的下游引物 具有如SEQIDNO： 10所示的序列； 所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 11所示的序列， 所述引物对的下游引物 具有如SEQIDNO： 12所示的序列。 13.一种特异性

7、扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对， 其特征在于： 其具有外侧引物对和 内侧引物对； 所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 13所示的序列， 所述引物对的下游引物 具有如SEQIDNO： 14所示的序列； 所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 15所示的序列， 所述引物对的下游引物 具有如SEQIDNO： 16所示的序列。 14.一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于： 其包括权利 要求6所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的 寡核苷酸组。 权利要求书 1/2 页 2 CN 105525023 A 2 15.如

8、权利要求14所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征 在于： 其还包括权利要求1所述的检测艰难梭菌的引物对。 16.如权利要求14所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征 在于： 其还包括艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的阳性质控品， 所述艰难梭菌毒素A的阳性 质控品具有如SEQIDNO： 17所示的序列， 所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品具有如SEQID NO： 18所示的序列。 17.如权利要求16所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征 在于： 所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品和所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品的制备方

9、法 为： A、 从艰难梭菌患者的粪便中提取总基因组DNA； B、 以步骤A)中提取的总基因组DNA为模板， 使用权利要求12所述的特异性扩增艰难梭 菌毒素A基因的引物对和权利要求13所述的特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对， 根据 巢式PCR两步循环法来扩增艰难梭菌毒素A基因和艰难梭菌毒素B基因的目的片段； C、 回收步骤B)中得到的目的片段， 将所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上， 随后转 化至大肠杆菌中， 将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定， 提取经鉴定为阳性样品的质 粒。 18.一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测方法， 其特征在于： 包括以下步 骤： 1)从人粪便

10、样品中提取总基因组DNA； 2)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板， 使用权利要求1所述的引物进行PCR， 检测 PCR扩增产物即可判断所述样品是否携带艰难梭菌； 若所述样品携带艰难梭菌， 则进入步骤 3)； 3)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板， 使用权利要求6所述的检测艰难梭菌毒素A 的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组分别进行qPCR； 4)通过测定DNA的Ct值， 根据标准曲线即可获得DNA的拷贝浓度。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105525023 A 3 艰难梭菌毒素A/B的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明属于

11、生物医学领域， 尤其涉及一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR 检测试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 艰难梭菌(ClostridiumDifficile， C.difficile)是一种革兰阳性、 产毒素或非 产毒素的厌氧芽胞杆菌， 它广泛分布于自然环境、 动物和人的粪便中。 艰难梭菌可以寄生在 在人类的肠道中， 它本身并没有侵袭性， 但研究发现， 长期使用广谱抗生素， 尤其是克林霉 素、 头孢菌素类、 喹诺酮类抗生素后， 引起菌群失调， 使耐药的艰难梭菌被选择出后大量繁 殖， 出现艰难梭菌相关性感染， 导致C.difficile相关性腹泻， 目前已被公认为引起抗菌药 物相关性腹泻

12、(antibioticassociateddiarrhea,AAD)和假膜性肠炎(Pseudo-membrane colitis， PMC)的重要致病菌。 艰难梭菌感染(CDI)患者临床表现轻者自限性腹泻， 重者可出 现伪膜性肠炎及中毒性巨结肠。 CDI具有复发率高、 耐药率高、 难治率高、 死亡率高、 医疗费 用高等特点。 因此， 艰难梭菌的快速鉴定及其毒素检测工作迫在眉睫。 0003 近年来， 艰难梭菌的诊断方法有依赖于厌氧条件的细菌培养、 依赖于抗体制备的 谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA检测法、 依赖于基因组DNA提取的分子诊断技术。 依赖于菌株培养 的毒素测定法鉴定时可获得相应菌株，

13、 方便后续研究， 但艰难梭菌属于厌氧菌， 培养困难， 费时费力。 谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA检测法需要制备抗体， 成本高， 过程繁琐耗时长， 且其 稳定性虽好但特异性差， 无法区分C.difficile产毒株与无毒株。 目前， 检测C.difficile应 用最多的是处于研究前沿的分子生物学检测法， 该方法可以不经培养直接从样品中提取肠 道微生物基因组， 利用分子生物学手段进行分离、 检测和定量， 其结果可以比较准确的反应 肠道微生物中高丰度菌种的组成及其含量。 0004 随着核酸技术发展， 16SrDNA序列分析已成为鉴定细菌的金标准。 利用16SrDNA 序列保守区域设计引物， 此引

14、物几乎能与所有种属的核糖靶位点结合。 能够进行快速鉴定， 从而及时给予抗菌治疗。 然而， 该方法也有局限性， 当不同种细菌16SrDNA序列几乎完全相 同时， 其鉴定能力就受到限制(如葡萄球菌和伯克霍尔德菌的鉴定)。 0005 C.difficile产生的毒素A(tcdA基因编码的产物)又称肠毒素， 导致回肠肠壁中性 粒细胞浸润， 释放淋巴因子， 引起液体大量分泌和出血性坏死； 毒素B(tcdB基因编码的产 物)又称细胞毒素， 能使肌动蛋白解聚， 损坏细胞骨架， 导致细胞固缩坏死， 直接损伤肠壁细 胞。 C.difficile的各菌株根据它们的毒素产生性的不同， 大致分为TcdA产生TcdB产

15、生型(A +B+)、 TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)以及毒素非产生型(A-B-)。 有研究表明， A-B+菌株在中 国具有发病比例高， 隐蔽性强， 耐药性高的特点， 对临床科室的危害性更为严重。 因此， 选择 tcdA和tcdB作为检测艰难梭菌的目的基因， 对艰难梭菌毒性菌株实施简单、 灵敏且快速检 测， 对于临床诊治具有重要意义。 0006 用实时荧光定量PCR的方法来检测外源基因的拷贝数， 是近几年迅速发展起来的 新方法， 它以低成本、 快捷、 高灵敏度等优点， 逐渐取代了价格昂贵、 费时费力的Southern 说明书 1/10 页 4 CN 105525023 A 4 blot

16、法。 根据荧光信号的来源不同对荧光定量的方法进行划分， 主要包括特异性荧光探针 (如TaqMan探针)法和非特异性荧光染料(如SYBRGreen染料)法。 由于SYBRGreen染料能与 所有的dsDNA相结合， 因此由引物二聚体、 错误的扩增产物引起的假阳性， 会增大定量数据 的误差。 目前针对艰难梭菌的定量检测， 已报道比较多的方法是多重实时荧光定量PCR(多 重qPCR)。 虽然该方法可以一次性检测多个靶标基因， 但也存在很多弊端， 例如1)引物设计 难度大： 复杂的多重qPCR引物设计必须依赖于较为大型的数据库和计算机模拟qPCR结果， 以及繁琐的后期验证， 这个过程不是一般小型实验室

17、可以完成的； 2)产物相互抑制： 多重 qPCR副产物焦磷酸的生成， 会抑制qPCR反应的延伸； 3)在一个qPCR反应体系里， dNTP原料的 量是一定的， 所以， 每增加一重引物， 就会使dNTP原料平分到每个靶标的量减少。 发明内容 0007 一方面， 为解决现有技术中存在的问题， 本发明提供了一种检测艰难梭菌的引物 对， 该引物对为用于检测C.difficile的16SrDNA引物， 其能特异地筛选出C.difficile。 0008 一种检测艰难梭菌的引物对， 所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 1所示的 序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 2所示的序列。 0

18、009 另一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的引物对， 所述引物对的上游 引物具有如SEQIDNO： 3所示的序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 4所示的序 列。 0010 又一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针， 所述探针具 有如SEQIDNO： 5所示的序列或其互补序列。 0011 优选地， 在寡核苷酸的5 末端结合有荧光物质， 在3 末端结合有淬灭物质。 0012 更优选地， 所述荧光物质为FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 ROX中的至少一种； 所述淬灭物 质为TAMRA、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 DABCY

19、L中的至少一种。 0013 再一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组， 其具有所述的 检测艰难梭菌毒素A的引物对和所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针。 0014 另一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的引物对， 所述引物对的上游 引物具有如SEQIDNO： 6所示的序列， 所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO： 7所示的序 列。 0015 又一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针， 所述探针具 有如SEQIDNO： 8所示的序列或其互补序列。 0016 优选地， 在寡核苷酸的5 末端结合有荧光物质， 在3 末端结合有淬灭物质。 001

20、7 更优选地， 所述荧光物质为FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 ROX中的至少一种； 所述淬灭物 质为TAMRA、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 DABCYL中的至少一种。 0018 再一方面， 本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组， 其具有所述的 检测艰难梭菌毒素B的引物对和所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针。 0019 另一方面， 本发明还提供了一种特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对， 其具有 外侧引物对和内侧引物对； 0020 所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 9所示的序列， 所述引物对的下游 引物具有如SEQIDNO： 10所示的序

21、列； 说明书 2/10 页 5 CN 105525023 A 5 0021 所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 11所示的序列， 所述引物对的下游 引物具有如SEQIDNO： 12所示的序列。 0022 另一方面， 本发明还提供了一种特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对， 其具有 外侧引物对和内侧引物对； 0023 所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 13所示的序列， 所述引物对的下游 引物具有如SEQIDNO： 14所示的序列； 0024 所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO： 15所示的序列， 所述引物对的下游 引物具有如SEQIDNO： 16所示的序列。

22、0025 另一方面， 本发明还提供了一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂 盒， 其包括所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷 酸组。 0026 优选地， 所述艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒还包括所述的检 测艰难梭菌的引物对。 0027 优选地， 所述艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒还包括艰难梭菌 毒素A和艰难梭菌毒素B的阳性质控品， 所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品具有如SEQID NO： 17所示的序列， 所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品具有如SEQIDNO： 18所示的序列。 0028 优选地， 所述艰难梭菌

23、毒素A的阳性质控品和所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品的 制备方法为： 0029 A、 从艰难梭菌患者的粪便中提取总基因组DNA； 0030 B、 以步骤A)中提取的总基因组DNA为模板， 使用所述的特异性扩增艰难梭菌毒素A 基因的引物对和所述的特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对， 根据巢式PCR两步循环法 来扩增艰难梭菌毒素A基因和艰难梭菌毒素B基因的目的片段； 0031 C、 回收步骤B)中得到的目的片段， 将所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上， 随 后转化至大肠杆菌中， 将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定， 提取经鉴定为阳性样品 的质粒。 0032 再一方面， 本发明还提供了一种艰

24、难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测方 法， 包括以下步骤： 0033 1)从人粪便样品中提取总基因组DNA； 0034 2)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板， 使用权利要求1所述的引物进行PCR， 检 测PCR扩增产物即可判断所述样品是否携带艰难梭菌； 若所述样品携带艰难梭菌， 则进入步 骤3)； 0035 3)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板， 使用权利要求6所述的检测艰难梭菌毒 素A的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组分别进行qPCR； 0036 4)通过测定DNA的Ct值， 根据标准曲线即可获得DNA的拷贝浓度。 0037 相对于现有技术，

25、本发明的有益效果为： 0038 (1)通过艰难梭菌的16SrDNA特异性引物来鉴定待测样品是否为艰难梭菌， 此在 艰难梭菌检测方法上是首次应用； 实验表明优选出来的用于检测C.difficile的16SrDNA 引物能特异地筛选出C.difficile； 0039 (2)通过Taqman探针法实时荧光定量PCR完成A/B毒素含量的绝对定量。 鉴定为艰 说明书 3/10 页 6 CN 105525023 A 6 难梭菌的样品的毒素检测， 可通过绘制A、 B毒素质控品的标准曲线， 来完成该毒素含量的绝 对定量。 既特异、 灵敏又准确。 0040 (3)本试剂盒所筛选的引物检测结果更为可靠。 C.d

26、ifficile在健康人肠道的菌数 水平很低， 我们优化了qPCR反应体系和条件 ,设计了特异性引物和探针 ， 与检测 C.difficile毒素基因tcdA和tcdB的其他文献上的引物检测相比， 扩增效率值E更符合qPCR 扩增效率的标准(90E110)， 结果更为可靠。 为艰难梭菌感染的早期诊断提供了基 础， 适用于临床不明原因腹泻病人的病因筛查。 附图说明 0041 图1显示了tcdB基因的全长序列保守性分析后质控品制备所设计的引物位置； 0042 图2显示了tcdB基因的全长序列保守性分析后qPCR引物和探针所在的位置； 0043 图3为细菌16SrDNA通用引物的PCR检测结果； 0

27、044 图4为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdA目的片段的扩增图； 0045 图5为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdB目的片段的扩增图； 0046 图6为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdA转化后的菌落PCR鉴定图； 0047 图7为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdB转化后的菌落PCR鉴定图； 0048 图8为艰难梭菌tcdA的灵敏度检测扩增曲线； 0049 图9为艰难梭菌tcdA的灵敏度检测标准曲线； 0050 图10为艰难梭菌tcdB的灵敏度检测扩增曲线； 0051 图11为艰难梭菌tcdB的灵敏度检测标准曲线； 0052 图12为利用其它文献上的引物对艰难梭菌tcdA和tcdB的灵敏度检测

28、。 具体实施方式 0053 为更好的说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下列实 施例中未提及的具体实验方法， 通常按照常规实验方法进行。 0054 实施例1 0055 16SrDNA的特异性引物 0056 艰难梭菌16SrDNA的特异性引物设计方法如下： 0057 当不同种细菌的16SrDNA序列几乎完全相同时， 16SrDNA通用引物鉴定细菌种类 的能力有限。 为了解决这个问题， 我们设计出多条引物， 经过数10条引物的筛选， 最终筛选 出仅对C.difficile特异的16SrD

29、NA引物， 依此来鉴定C.difficile。 0058 筛选出的用于检测C.difficile最特异的16SrDNA引物序列如下： 0059 C.diff-16s-F： TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA 0060 C.diff-16s-R： CCATCCTGTACTGGCTCACCT 0061 16SrDNA特异引物检测C.difficile 0062 从234例肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA， 利用筛选出的用于检 测C.difficile最特异的16SrDNA引物， 通过PCR来检测上述样品是否携带艰难梭菌。 0063 其中， PCR反应体系和条件如下： 说

30、明书 4/10 页 7 CN 105525023 A 7 0064 0065 0066 PCR反应程序为： 预变性9830秒， 变性9810秒， 退火6015秒， 延伸721分钟 (变性、 退火和延伸共36个循环)， 终止725分钟。 0067 将以上234例样品的PCR扩增产物， 经琼脂凝胶电泳结果显示， 有131例样品携带艰 难梭菌， 其余103例样品呈阴性。 为了验证上述结果是否存在假阳/阴性， 我们选用细菌16S rDNA通用引物( 引物序列为： 16s-27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； 16S-1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)， 来扩增所述

31、的234例样品。 测序结果经比对， 在上述131例阳性样品 中， 检测出有121例属于艰难梭菌的16SrDNA序列， 其余10例属于梭菌属的其它菌株(副腐 败梭菌3例， 产气夹膜梭菌5例， 多枝梭菌1例和丁酸梭菌1例)。 另外， 在上述103例艰难梭菌 检测结果呈阴性的样品中(如图3所示)， 检测出有8例属于艰难梭菌的16SrDNA序列。 综上， 所述用于检测C.difficile的16SrDNA引物的阳性符合率为92.37， 阴性符合率为 92.23， 表明该引物的特异性是符合要求的。 0068 实施例2 0069 tcdA与tcdB基因质控品的特异性引物、 qPCR检测引物和探针序列的设计

32、方法 0070 通过NCBI数据库和http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线比对软件， 找出tcdA基因和tcdB基因在不同菌株间的保守序列。 tcdB基因在不同菌株间的序列差异性 很大， 部分序列相似率仅为94.9。 图1所示为不同菌株tcdB基因的全长序列保守性分析， 框出来的位置为引物tcdB质控品制备的外、 内侧引物序列位置。 图2框出来的位置为tcdB的 qPCR引物和探针位置， 因此借助了DNAStar软件包中的Saqman软件来选出tcdB基因的保守 序列。 最后用软件PrimerPremier5.0设计引物， 分别得到以下用于制备质控品的

33、特异性 引物， 以及tcdA与tcdB基因的qPCR检测引物和探针序列， 具体如下： 0071 tcdA和tcdB质控品制备所用特异性引物序列分别是： 0072 tcdA的外侧引物 0073 tcdA-out-F： 5 -TTCAAGCAGAAATAGAGCAC-3 0074 tcdA-out-R： 5 -GTCTTCAGAAAGAGATCCACC-3 0075 tcdA的内侧引物 0076 tcdA-in-F:5 -ATGGATAGGTGGAGAAGTCAG-3 0077 tcdA-in-R:5 -GCATAAGCTCCTGGACCAC-3 0078 tcdB的外侧引物 说明书 5/10 页

34、 8 CN 105525023 A 8 0079 tcdB-out-F： 5 -CGATATGTATGGAGTAATGATG-3 0080 tcdB-out-R： 5 -GTATAGTTTATTGATTCTCCCTC-3 0081 tcdB的内侧引物 0082 tcdB-in-F:5 -GGTGTATTTAGTACAGAAGATGG-3 0083 tcdB-in-F:5 -TCATATATCCATCCAGTCTC-3 0084 tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针序列分别是 0085 tcdA-q-F:5 -GCTTTCGCTTTAGGCAGTGT-3 0086 tcdA-q-

35、R:5 -GAGTTTTCTGCGGTAGCTGA-3 0087 tcdA-pro:5 -FAM-CCAACACCTTAACCCAGCCATAGAG-TAMRA-3 0088 tcdB-q-F:5 -GCACCTGCTAATACTGTAAATG-3 0089 tcdB-q-R:5 -GTCTCAATTGTATATGTTTCTCC-3 0090 tcdB-pro:5 -FAM-TACGGACAAGCAGTTGAATATAGTGG-TAMRA-3 0091 其中FAM为荧光报告基团， TAMRA为荧光淬灭基团。 所述引物和探针均由上海捷瑞 生物工程有限公司合成。 0092 C.difficile毒

36、素基因tcdA和tcdB质控品的制备 0093 1.制备阳性质控品： 从C.difficile临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA， 以 所获得的总基因组DNA为模板， 使用本实施例中的tcdA和tcdB质控品制备所用特异性引物， 根据巢式PCR两步循环法来扩增tcdA基因和tcdB基因的目的片段； 回收得到的目的片段， 将 所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上， 随后转化至大肠杆菌中， 将转化后长出的白色菌 落进行PCR菌落鉴定， 提取经鉴定为阳性样品的质粒。 0094 具体步骤为： 首先将细菌总基因组DNA浓度稀释至1ng/ L， 取1 L为模板， 先以tcdA 和tcdB的外侧引物进行

37、第一次扩增； 接着， 以tcdA和tcdB的内侧引物， 对第一次扩增获得的 PCR产物目的片段， 用相同配液体系和反应条件进行第二次扩增， PCR反应体系和条件如下： 0095 0096 PCR反应程序为： 预变性945分钟， 变性9430秒， 退火5630秒， 延伸721分钟 (变性、 退火和延伸共36个循环)， 终止725分钟。 0097 得到的tcdA基因目的片段大小为1122bp， 如图4所示。 在图4中， A显示了tcdA的外 侧引物扩增产物1444bp， M： DNAMarker2000bp； B显示了tcdA的内侧引物扩增产物1122bp， M： DNAMarker2000bp。

38、 0098 tcdB基因目的片段大小为953bp， 如图5所示。 图中， A显示了tcdB的外侧引物扩增 产物1754bp， M： DNAMarker2000bp； B显示了tcdB的内侧引物扩增产物953bp， M： DNA 说明书 6/10 页 9 CN 105525023 A 9 Marker2000bp。 0099 将第二次反应得到的目的片段扩增产物进行回收， 将回收片段连接至即用型蓝白 T载体(A型)上， 连接体系如下(单位： L)： 0100 0101 反应体系混匀后置于金属恒温浴中22孵育30分钟。 接着， 将连接产物通过热激， 转化至大肠杆菌感受态JM109中。 将转化后长出的

39、白色菌落进行PCR菌落鉴定。 鉴定结果显 示， tcdA的转化菌落有9个样品是能扩増出条带的， 如图6所示， 其中7个菌落鉴定PCR产物大 小与目的片段大小一致(即1122bp)； tcdB的转化菌落(见图7)， 也有9个样品能扩增出预期 产物大小一致的条带(953bp)， 从中各选2个经鉴定为阳性的质粒送至生工测序公司进行测 序。 0102 测序结果经与C .difficile毒素基因tcdA和tcdB的参考品(KC292122 .1和 KC292195.1)比对， 显示该质控品序列与参考品序列的同源率高达100， 表明所制备的 tcdA和tcdB质控品序列是属于tcdA和tcdB基因序列的

40、。 所述获得的阳性质控品序列具体如 下： 0103 a.tcdA的质控品序列(1122bp) 0104 ATGGATAGGTGGAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGGGCTGATATTAATGCAGAATATAATA TTAAACTGTGGTATGATAGTGAAGCATTCTTAGTAAATACACTAAAAAAGGCTATAGTTGAATCTTCTACCACTGAA GCATTACAGCTACTAGAGGAAGAGATTCAAAATCCTCAATTTGATAATATGAAATTTTACAAAAAAAGGATGGAATT TATATATGATAGAC

41、AAAAAAGGTTTATAAATTATTATAAATCTCAAATCAATAAACCTACAGTACCTACAATAGATG ATATTATAAAGTCTCATCTAGTATCTGAATATAATAGAGATGAAACTGTATTAGAATCATATAGAACAAATTCTTTG AGAAAAATAAATAGTAATCATGGGATAGATATCAGGGCTAATAGTTTGTTTACAGAACAAGAGTTATTAAATATTTA TAGTCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAATTTAGCTGCAGCATCTGACATAGTAAGATTATTAGCCCTAAAAAATTTTG GC

42、GGAGTATATTTAGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTCACTCTGATTTATTTAAAACAATATCTAGACCTAGCTCT ATTGGACTAGACCGTTGGGAAATGATAAAATTAGAGGCTATTATGAAGTATAAAAAATATATAAATAATTATACATC AGAAAACTTTGATAAACTTGATCAACAATTAAAAGATAATTTTAAACTCATTATAGAAAGTAAAAGTGAAAAATCTG AGATATTTTCTAAATTAGAAAATTTAAATGTATCTGATCTTGAAATTAAAATAGCTTTCGCTTTAGGC

43、AGTGTTATA AATCAAGCCTTGATATCAAAACAAGGTTCATATCTTACTAACCTAGTAATAGAACAAGTAAAAAATAGATATCAATT TTTAAACCAACACCTTAACCCAGCCATAGAGTCTGATAATAACTTCACAGATACTACTAAAATTTTTCATGATTCAT TATTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTTTTAACAAAAATAGCACCATACTTACAAGTAGGTTTTATGCCA GAAGCTCGCTCCACAATAAGTTTAAGTGGTCCAGGAGCTTATGC 0105 b.tcdB

44、的质控品序列(953bp) 0106 说明书 7/10 页 10 CN 105525023 A 10 GGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCCCCAGCTAATACACTTGATGAAAACCTAGAAGGAGAAGC AATTGATTTTACTGGAAAATTAATTATTGACGAAAATATTTATTATTTTGATGATAATTATAGAGGAGCTGTAGAAT GGAAAGAATTAGATGGTGAAATGCACTATTTTAGCCCAGAAACAGGTAAAGCTTTTAAAGGTCTAAATCAAATAGGT GATTATAAATACTAT

45、TTCAATTCTGATGGAGTTATGCAAAAAGGATTTGTTAGTATAAATGATAATAAACACTATTT TGATGATTCTGGTGTTATGAAAGTAGGTTACACTGAAATAGATGGCAAGCATTTCTACTTTGCTGAAAACGGAGAAA TGCAAATAGGAGTATTTAATACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCTCATCATAATGAAGATTTAGGAAATGAAGAA GGTGAAGAAATCTCATATTCTGGTATATTAAATTTCAATAATAAAATTTACTATTTTGATGATTCATTTACAGCTGT AGT

46、TGGATGGAAAGATTTAGAGGATGGTTCAAAGTATTATTTTGATGAAGATACAGCAGAAGCATATATAGGTTTGT CATTAATAAATGATGGTCAATATTATTTTAATGATGATGGAATTATGCAAGTTGGATTTGTCACTATAAATGATAAA GTCTTCTACTTCTCTGACTCTGGAATTATAGAATCTGGAGTACAAAACATAGATGACAATTATTTCTATATAGATGA TAATGGTATAGTTCAAATTGGTGTATTTGATACTTCAGATGGATATAAATATTTTGCACCTGCTAATAC

47、TGTAAATG ATAATATTTACGGACAAGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTGGGGAAGATGTATATTATTTTGGAGAAACA TATACAATTGAGACTGGATGGATATATGA 0107 艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒 0108 本试剂盒由(1)粪便基因组DNA提取液； (2)16SDNA检测体系； (3)qPCR反应液； (4) 阳性质控品； (5)说明书和(6)盒体组成。 0109 其中， (1)粪便基因组DNA提取液用于提取粪便基因组DNA， 能实现此功能的所有提 取液均适用于本发明， 也可选用市场上已有的粪便基

48、因组DNA提取试剂盒中的试剂， 如 TIANGEN公司的DP328； (2)16SDNA检测体系中包含实施例1中的用于检测C.difficile最特 异的16SrDNA引物， 还可包含其他进行PCR反应所需试剂； (3)qPCR反应液中包含本实施例 中tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针， 还包含其他进行qPCR反应所需试剂； (4) 阳性质控品由本实施例中的制备阳性质控品的方法制得。 0110 艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法 0111 利用所述检测试剂盒鉴定艰难梭菌菌株、 并对艰难梭菌关键毒素A和B进行检测和 定量的方法， 所述方法如下： 011

49、2 (1)提取粪便基因组DNA 0113 严格按照粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司DP328)操作说明进行粪便总基 因组DNA的提取， 并针对C.difficile稍微进行了条件优化： 将样品预处理的裂解温度调整 为95孵育5min， 能使较难破壁的革兰氏阳性细菌C.difficile裂解破壁， 同时使DNA结 构完整性保持最佳状态。 0114 (2)艰难梭菌的检测 0115 从肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA(gDNA)， 利用筛选出的用于 检测C.difficile最特异的16srDNA引物来扩增目的片段， 通过琼脂糖凝胶电泳来检测样 品是否携带艰难梭菌。 0116 (3)探针法荧光定量PCR检测艰难梭菌关键毒素A和B， 并进行绝对定量 0117 从肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA(gDNA)， 以提取的DNA为模 板， 使用tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针分别进行qPCR； 通过测定Ct值根据 标准曲线即可获得待测样品DNA的拷贝浓度。 本发明对qPCR反应体系进行了优化， 优化后具 体的qPCR反应体系和条件如下： 说明书 8/10 页 11 CN 105525023 A 11 0118 0119 其反应程序为： 预变性9530秒， 变性9515秒， 退