一种植物乳杆菌及其在天然牧草青贮中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610011898.1 (22)申请日 2016.01.08 CGMCC No. 10474 2015.01.30 C12N 1/20(2006.01) A23K 10/18(2016.01) A23K 30/18(2016.01) C12R 1/25(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 玉柱 张庆 张英俊 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 黄家俊 (54) 发明名称 一种植物乳杆菌及其在天然牧草青贮中的应 用

2、 (57) 摘要 本发明公开了属于牧草饲料加工贮藏技术领 域的一种植物乳杆菌及其在天然牧草青贮中的应 用。所述的植物乳杆菌的菌株为 LP3， 分类命名 为Lactobacillus plantarum， 在中国普通微生物 菌种保藏管理中心的保藏号为 CGMCC No.10474。 所述的植物乳杆菌从天然牧草青贮饲料中分离得 到， 是一株新的植物乳杆菌。 所述的植物乳杆菌能 明显提高天然牧草青贮的发酵品质， 且具有发酵 效率高、 成本低廉等优点， 可应用于优质天然牧草 青贮饲料的生产中。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权

3、利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 105524867 A 2016.04.27 CN 105524867 A 1.一种植物乳杆菌 ， 其特征在于 ， 所述的植物乳杆菌菌株为LP3 ， 分类命名为 Lactobacillusplantarum， 在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10474。 2.根据权利要求1所述的一种植物乳杆菌， 其特征在于， 所述的植物乳杆菌的16SrDNA 基因序列如SEQIDNo.1所示。 3.根据权利要求1所述的一种植物乳杆菌， 其特征在于， 所述的植物乳杆菌的生物学特 性为： 菌株在固体培养基上30培养48h， 生长良好

4、， 可形成边缘整齐的乳白色菌落； 菌株革 兰氏染色呈阳性， 显微镜下的细胞形态为短杆状、 无芽孢； 氧化酶阴性， 具有较强的生长及 产酸性能； 在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能生长， 在10条件下呈现微弱生长， 在15- 40条件下生长状况良好， 在不大于6.5NaCl的条件下生长状况良好。 4.权利要求1-3任一项所述的植物乳杆菌在制备天然牧草青贮饲料中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述天然牧草青贮饲料的制备方法为： 在 天然牧草中接种植物乳杆菌LP3后， 将其在15-25下固体厌氧发酵30-60d即可。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述的

5、植物乳杆菌LP3的接种量为： 每克天 然牧草中接种105-106cfu植物乳杆菌LP3。 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的天然牧草为羊草、 赖草和披碱草中 的一种或一种以上。 8.权利要求1-3任一项所述的植物乳杆菌在制备天然牧草青贮饲料添加剂中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的天然牧草青贮饲料添加剂为制备天 然牧草青贮饲料中添加的菌剂。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述天然牧草青贮饲料添加剂的制备方 法为： 将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中， 在温度为30-37的条件下， 厌氧培养18- 24h； 所述的MRS液体培养基

6、的成分为： 10.0g/L蛋白胨、 10.0g/L牛肉膏、 5.0g/L酵母膏、 2.0g/L柠檬酸氢二铵、 20.0g/L葡萄糖、 1.0g/L吐温-80、 5.0g/L乙酸钠、 2.0g/L磷酸氢二钾、 0.58g/L硫酸镁和0.25g/L硫酸锰； 所述MRS液体培养基的初始pH值为6-7。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524867 A 2 一种植物乳杆菌及其在天然牧草青贮中的应用 技术领域 0001 本发明属于牧草饲料加工贮藏技术领域， 特别涉及一种植物乳杆菌及其在天然牧 草青贮中的应用。 背景技术 0002 我国天然草地面积广阔、 资源丰富， 天然牧草的传统生产方式主要是调

7、制干草， 而 干草调制过程由于雨淋等各种原因造成牧草霉烂变质， 质量下降， 浪费极为严重。 大量实践 资料表明， 青贮饲料不仅可以延长饲料的保存时间， 还可以有效地保持牧草的营养成分。 通 常牧草在成熟和晒干之后， 其营养价值会降低约30-50， 但青贮后牧草的营养价值仅降 低3-10； 青贮不仅会使牧草中的维生素和蛋白质得到有效的保护， 还可以很好地改善 饲草的适口性， 提高饲草的消化利用率。 0003 然而， 天然牧草本身草群构成复杂， 干物质含量较高， 可溶性糖含量低， 茎干中空， 加上缺乏相关机械等问题导致青贮填装过程难以压实， 残留空气较多， 发酵底物不足， 直接 青贮难以获得优质青

8、贮饲料。 乳酸菌制剂的使用可增加青贮初期发酵时的乳酸菌数量， 对 保证青贮饲料尽快进入乳酸发酵阶段非常有效， 可以使pH值迅速下降， 蛋白水解作用减弱， 青贮饲料中氨态氮含量减少， 青贮发酵品质改善。 发明内容 0004 本发明针对现有技术的不足， 其目的在于提供一种植物乳杆菌及其在天然牧草青 贮中的应用。 0005 为了实现上述目的， 本发明采取的技术方案如下： 0006 一种植物乳杆菌， 所述的植物乳杆菌菌株为LP3， 分类命名为Lactobacillus plantarum， 在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCCNo.10474。 0007 所述的植物乳杆菌的16SrDN

9、A基因序列如SEQIDNo.1所示。 0008 所述的植物乳杆菌的生物学特性为： 菌株在MRS固体培养基上30培养48h， 生长 良好， 可形成边缘整齐的乳白色菌落； 菌株革兰氏染色呈阳性， 显微镜下的细胞形态为短杆 状、 无芽孢； 氧化酶阴性， 具有较强的生长及产酸性能； 在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能 生长， 在10条件下呈现微弱生长， 在15-40条件下生长状况良好， 在不大于6.5NaCl 的条件下生长状况良好。 0009 所述的植物乳杆菌在制备天然牧草青贮饲料中应用。 0010 所述天然牧草青贮饲料的制备方法为： 在天然牧草中接种植物乳杆菌LP3后， 将其 在15-25下固

10、体厌氧发酵30-60d即可。 0011 所述的植物乳杆菌LP3的接种量为： 每克天然牧草中接种105-106cfu植物乳杆菌 LP3。 0012 所述的天然牧草为羊草、 赖草和披碱草中的一种或一种以上。 0013 所述的植物乳杆菌在制备天然牧草青贮饲料添加剂中的应用。 说明书 1/5 页 3 CN 105524867 A 3 0014 所述的天然牧草青贮饲料添加剂为制备天然牧草青贮饲料中添加的菌剂。 0015 所述天然牧草青贮饲料添加剂的制备方法为： 将植物乳杆菌接种到MRS液体培养 基中， 在温度为30-37的条件下， 厌氧培养18-24h； 0016 所述的MRS液体培养基的成分为： 10

11、.0g/L蛋白胨、 10.0g/L牛肉膏、 5.0g/L酵母膏、 2.0g/L柠檬酸氢二铵、 20.0g/L葡萄糖、 1.0g/L吐温-80、 5.0g/L乙酸钠、 2.0g/L磷酸氢二钾、 0.58g/L硫酸镁和0.25g/L硫酸锰； 0017 所述MRS液体培养基的初始pH值为6-7。 0018 本发明的有益效果为： 与自然的青贮饲料相比， 每克天然牧草中接种106cfu的植 物乳杆菌LP3后， 天然青贮饲料的pH明显降低， 达到4.0以下， 乳酸含量提高93.5， 氨态氮 降低56.9， 丁酸含量和大肠菌数量均低于检测限， 明显提高了野生牧草青贮的发酵品质； 同时植物乳杆菌LP3具有发酵

12、效率高、 成本低廉等优点， 可应用于绿色环保生物饲料的生产 中。 0019 生物材料保藏说明 0020 分类命名： 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)； 菌株编号： LP3。 0021 保藏机构： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0022 保藏机构简称： CGMCC 0023 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号 0024 保藏日期： 2015年1月30日 0025 保藏中心登记入册编号： CGMCCNo.10474。 附图说明 0026 图1： 植物乳杆菌LP3在MRS液体培养基中生长时MRS液体培养基pH值的变化曲线 图。 具体实施方式 0027 下面

13、结合附图和实施例对本发明做进一步说明， 以下的实施例便于更好地理解本 发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所用的 材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0028 实施例1： 植物如杆菌(Lactobacillusplantarum)LP3的分离与鉴定 0029 取河北地区天然野生牧草青贮20g， 加入180mL蒸馏水， 用震荡器震荡30min， 10-1- 10-6梯度稀释。 分别从各梯度稀释液中取1mL至培养皿中， 加入10-15mL灭菌后的MRS固体培 养基上， 摇匀， 待其冷却凝固， 静置厌氧培养48h， 挑取菌落形态、

14、 大小、 颜色和光泽度有明显 差别的单菌落， 重复划线， 直至得到纯菌落。 0030 对分离筛选得到的菌株进行鉴定， 根据菌株的细胞形态、 生理生化特征和16S rDNA基因序列进行综合分析， 鉴定菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)， 命名为 LP3， 是一株新的植物乳杆菌。 0031 菌株LP3的生物学特性为： LP3菌株在MRS固体培养基上培养24h， 菌株生长良好， 可 形成边缘整齐的乳白色菌落； 菌株革兰氏染色呈阳性， 显微镜下的细胞形态为短杆状、 无芽 孢； 氧化酶阴性， 具有较强的生长及产酸性能。 说明书 2/5 页 4 CN 105524867 A

15、4 0032 将菌株LP3接种于MRS液体培养基中37培养48h后， 按1.5的比例接种到灭菌后 的200mLMRS液体培养基中， 置于37培养箱中培养， 每3h取样测定MRS培养基的pH值， 并在 600nm下测定其吸光度， 结果如图1所示。 从图中可知， 菌株LP3在MRS液体培养基中培养24h 后， MRS液体培养基的pH值低于4.0。 0033 根据GB4789.35-2010对菌株不同碳源的同化能力进行检测， 其对碳源发酵的实验 结果如表l所示； 16SrDNA基因序列如SEQIDNO.1所示。 0034 表1： LP3菌株的碳源发酵实验结果 0035 0036 0037 注： AT

16、CC14917T为植物乳杆菌模式菌株，“+” 为阳性；“-” 为阴性。 0038 实施例2： 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP3在不同pH、 温度及盐浓度环 境条件下的生长测定 0039 用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将MRS培养基的起始pH值分别调至3.0、 3.5、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0， 37恒温静置培养植物乳杆LP324h， 培养过程中不调酸， 用分 光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)， 结果如表2所示。 结果显示， 植物乳杆菌LP3能够在 起始pH3.5-pH8.0的条件下生长。 0040 将

17、活化的植物乳杆菌LP3接种于MRS液体培养基， 分别在温度为10、 15、 20、 30、 40和45的条件下培养24h， 用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)， 结果如 表2所示。 结果显示， 植物乳杆菌LP3在温度为10的环境下呈现微弱生长， 在15-40条 件下生长状况良好。 说明书 3/5 页 5 CN 105524867 A 5 0041 将活化的植物乳杆菌LP3分别接种于含3wt和6.5wtNaCl的MRS液体培养基中 培养24h， 用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)， 结果如表2所示。 结果显示， 植物乳 杆菌LP3能够在含3wt和6.5wtNaCl

18、的条件下生长。 0042 表2： 植物乳杆菌LP3在不同环境条件下的生长情况 0043 项目LP3 来源苜蓿青贮 形状杆状 革兰氏染色+ 发酵类型同质型 过氧化氢酶- 10w 15， 20， 30+ 40+ 45- 3wtNaCl+ 6.5wtNaClw pH3.0- pH3.5w pH4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0+ pH9.0- 0044 注： ATCC14917T为植物乳杆菌模式菌株，“+” 为阳性；“-” 为阴性；“w” 为弱阳性。 0045 实施例3、 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP3制备天然牧草青贮饲料 0046 天然牧草： 为我国草

19、甸草原野生牧草， 刈割时期为7月中旬， 主要由羊草、 赖草、 披 碱草组成。 0047 l、 制备菌粉 0048 无菌条件下， 取植物乳杆菌LP3接种于MRS液体培养基中， 于37下培养18-24h， 得 到植物乳杆菌LP3菌悬液； 离心得到植物乳杆菌LP3菌体后， 加入灭菌的脱脂奶， 混匀后冻 干， 得到LP3含量大于11012cfu/g的菌粉。 0049 取0.1000g左右的菌粉， 加入1mL灭菌后的生理盐水， 10-1-10-11逐级稀释， 分别取 1mL稀释液至培养皿中， 加入灭菌后的MRS固体培养基， 混匀冷却， 凝固后37厌氧培养48h， 计数， 以此计算出每克菌粉的活菌数。 0

20、050 2、 设两个处理(每个处理3次重复， 结果以平均值形式表示) 0051 处理l(天然牧草中接种植物乳杆菌LP3青贮)： 取1000g天然牧草， 按每克天然牧草 加106cfu的植物乳杆菌LP3取适量步骤l制备的LP3菌粉， 加5mL蒸馏水溶解活化20-30min， 均匀喷洒到天然牧草上， 混匀后取300g装入500ml青贮桶， 密封后室温存放。 0052 处理2(天然牧草自然青贮)： 取1000g天然牧草加入与处理l同样体积的不含植物 乳杆菌LP3的蒸馏水， 均匀喷洒到天然牧草上， 混匀后取300g装入500ml青贮桶， 压实密封后 室温存放。 说明书 4/5 页 6 CN 10552

21、4867 A 6 0053 密封45d时开封， 记录各处理发酵产物的pH值， 并采用稀释平板计数法测定发酵产 物中的活菌数； 同时测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成和氨态氮占总氮的百分比。 有机酸组成及含量测定条件为： 采用色谱柱ColumnType： ShodexRSPakKC-811， 柱温： 50 ， 流速： 1.0ml/min， 流动相： 3mmoll-1HClO4， 注入样品量： 5 l， 旋光性： 非极性， UV检测器 210nm。 0054 3、 实验结果 0055 测定结果如表3所示。 结果表明： 与自然青贮相比， 接种植物乳杆菌LP3后天然牧草 青贮的pH明显降低， 达到4

22、.0以下， 乳酸含量提高93.5， 氨态氮降低56.9， 丁酸含量和大 肠菌数量均低于检测限， 明显提高了野生牧草青贮的发酵品质。 0056 表3.自然青贮和接种植物乳杆菌LP3天然牧草青贮的pH值、 有机酸(g/kgDM)、 氨 态氮(g/kgFM)及微生物含量(logcfu/gFM)结果 0057 处理pH乳酸乙酸丁酸乳酸： 乙酸氨态氮大肠菌霉菌和酵母菌 对照4.7418.546.030.542.930.653.223.78 LP33.9435.887.10ND5.300.28NDND 说明书 5/5 页 7 CN 105524867 A 7 0001 序列表 1/2 页 8 CN 105524867 A 8 0002 序列表 2/2 页 9 CN 105524867 A 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 105524867 A 10