-丁内酯的生产方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201180009250.6 (22)申请日 2011.02.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 102781926 A (43)申请公布日 2012.11.14 (30)优先权数据 61/303,584 2010.02.11 US 61/382,855 2010.09.14 US 61/413,195 2010.11.12 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2012.08.10 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2011/024612 2

2、011.02.11 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2011/100601 EN 2011.08.18 (73)专利权人 梅塔玻利克斯公司 地址 美国马萨诸塞州 (72)发明人 J范瓦尔森E安德森 J利卡塔KA斯帕克斯 WR法默C米尔利 JA比克梅尔A达姆布罗索 FA斯克拉利TM拉姆塞尔 MS希瓦苏布拉玛尼安 Y沙布泰 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 陈文平徐志明 (51)Int.Cl. C07D 307/33(2006.01) C12P 7/62(2006.01) (56)对比文件 WO 03051813 A1,2003.06.26, Hideki Ab

3、e.Thermal degradation of environmentally degradable poly （hydroxyalkanoic acid） s. macromolecular bioscience .2006,第6卷 Hideki Abe.Thermal degradation of environmentally degradable poly （hydroxyalkanoic acid） s. macromolecular bioscience .2006,第6卷(续) 审查员 高履桐 (54)发明名称 -丁内酯的生产方法 (57)摘要 本申请涉及用于制备基于生物的-丁

4、内酯 产物的方法， 包括混合含有聚4-羟基-丁酸的遗 传工程化的生物质和催化剂并加热该生物质和 催化剂以将聚4-羟基-丁酸转化为-丁内酯产 物。 转续页 权利要求书3页 说明书53页 序列表9页 附图6页 CN 102781926 B 2016.11.09 CN 102781926 B (56)对比文件 Lei Zhang et al.Microbial production of 4-hydroxybutyrate， poly-4- hydroxybutyrate， and poly （3- hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate） by recombin

5、ant microorganisms. Appl microbial Biotechnol .2009,第84卷(第5期), Hiromichi Morikawa et al.Pyrolysis of bacterial polyalkanostes. Canadian journal of Chemistry .1981,第59卷 2/2 页 2 接上页 CN 102781926 B 1.一种用于生产基于生物的-丁内酯产物的方法， 所述方法包括： a)混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂， 其中所述催化剂是包 含选自钙、 镁和钠的金属离子的化合物； 和 b)将所述生物质与所

6、述催化剂一起加热， 以将所述聚4-羟基丁酸转化成-丁内酯产 物， 其中所述-丁内酯产物包含小于5重量的副产物； 和 其中如按照每克聚-4-羟基丁酸的-丁内酯产物的克数计算的， 所述-丁内酯产物 的产率是85重量或更大。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁 酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因 或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或在两个基 因中具有所述抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多 个基因： 琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶

7、， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化 成琥珀酰-CoA； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成 琥珀酸半醛； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4- 羟基丁酸； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 和 聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚- 4-羟基丁酸。 3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有 稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主： 磷酸烯醇

8、丙酮 酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠 檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所 述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中 所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化 成1,3-二磷酸甘油酸， 形成NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依 赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶

9、能够将甘油醛3-磷酸转化成1,3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H +； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸； 磷酸丁酰基 转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 4.根据权利要求1所述的方法， 其中所述方法另外包括下述初始步骤： 用可再生的原料 培养重组宿主， 以生成聚-4-羟基丁酸生物质。 5.根据权利要求4所述的方法， 其中所述可再生的原料的来源选自： 葡萄糖、 果糖、 蔗 糖、 阿

10、拉伯糖、 麦芽糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组 合。 6.根据权利要求2所述的方法， 其中所述重组宿主是细菌、 酵母、 真菌、 藻类或它们中的 任意2种或更多种的混合物。 7.根据权利要求6所述的方法， 其中所述重组宿主是蓝细菌。 8.根据权利要求6所述的方法， 其中所述重组宿主是细菌。 权利要求书 1/3 页 2 CN 102781926 B 3 9.根据权利要求8所述的方法， 其中所述细菌选自： 大肠杆菌、 真养产碱杆菌、 芽孢杆菌 属、 广泛产碱菌、 固氮菌属、 气单胞菌属、 丛毛平胞菌属、 假单胞菌属、 罗尔斯通氏菌属、 克雷 伯菌属、 聚球藻属

11、PCC7002、 聚球藻属PCC7942、 集胞藻属PCC6803、 嗜热蓝细菌聚球藻BP- I、 微温绿硫菌、 Chloroflexusauranticus、 微温着色菌和酒色着色菌、 深红红螺菌、 荚膜红 细菌和沼泽红假单胞菌。 10.根据权利要求8所述的方法， 其中所述细菌为假单胞菌。 11.根据权利要求6所述的方法， 其中所述重组宿主是藻类。 12.根据权利要求1所述的方法， 其中加热是在100至350的温度下。 13.根据权利要求1所述的方法， 其中所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。 14.根据权利要求12所述的方法， 其中所述催化剂的重量百分比是在4至50的范围 内。 15.根据权利要

12、求1所述的方法， 其中加热将所述生物质的水含量降低至5重量或更 低。 16.根据权利要求1所述的方法， 其中所述加热温度是200至350。 17.根据权利要求16所述的方法， 其中所述加热温度是225至300。 18.根据权利要求1所述的方法， 其中所述加热持续30秒至5分钟的时间段。 19.根据权利要求1所述的方法， 其中所述加热持续5分钟至2小时的时间。 20.根据权利要求1所述的方法， 其另外包括： 回收所述-丁内酯产物。 21.根据权利要求1所述的方法， 其中进一步加工所述-丁内酯， 以形成下述的一种或 多种： 1,4-丁二醇(BDO)、 四氢呋喃(THF)、 N-甲基吡咯烷酮(NMP

13、)、 N-乙基吡咯烷酮(NEP)、 2- 吡咯烷酮、 N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 22.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基 丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主任选地在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱 氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或 在两个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因： 琥珀酰-CoA:辅酶 A转移酶， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； 琥珀酸半醛 脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥

14、珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛； 琥珀酸半醛还 原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸； CoA转移酶， 其中 所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中 所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。 23.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入 的编码下述酶的基因的重组宿主： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化 酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能 够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶，

15、 其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果 酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能 够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖性 的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1,3-二磷酸甘油酸， 形成NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘 油醛3-磷酸转化成1,3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将 权利要求书 2/3 页 3 CN 102781926 B 4

16、4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能 够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任选地在选自下述的一个或多个基 因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 24.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基 丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一 个或多个基因： 琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀 酸转化成琥珀酰-CoA； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能

17、够将琥珀酰-CoA 转化成琥珀酸半醛； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转 化成4-羟基丁酸； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基- CoA； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合 成聚-4-羟基丁酸。 25.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入 的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠檬酸裂合 酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠

18、檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸 合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述琥珀 酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸 脱氢酶， 其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1,3-二 磷酸甘油酸， 形成NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依赖性的甘 油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1,3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H+； 丁酸激 酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁

19、酰基-磷酸； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任选 地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 26.根据权利要求1所述的方法， 其中所述催化剂的重量是在4至50的范围内， 且 所述加热是在300下。 27.根据权利要求1所述的方法， 其中所述催化剂是4重量的氢氧化钙， 且所述加热是 在300的温度下。 权利要求书 3/3 页 4 CN 102781926 B 5 -丁内酯的生产方法 背景技术 0001 随着日益减少的石油资源、 日益增加的能量价格和环境问

20、题， 开发节省能量的生 物精制方法来从可再生的、 低成本的、 碳资源生产基于生物的化学制品， 会提供克服基于石 油的化学制品的日益增加的限制的独特解决方案。 0002 可以使用生物精制方法生产的、 具有广泛工业和制药用途的一种化学制品是- 丁内酯(GBL)。 据估测， GBL的全球市场需求是8.5亿磅/年， 换而言之， 每年的总销售额是10 亿美元。 -丁内酯是一种无色的、 弱气味的液体， 主要用作下述商业上重要的化学制品的 生产的中间体： 诸如1， 4-丁二醇(BDO)、 四氢呋喃(THF)、 N-甲基吡咯烷酮(NMP)、 N-乙基吡咯 烷酮(NEP)、 2-吡咯烷酮、 N-乙烯基吡咯烷酮(

21、NVP)、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)诸如此类。 这些化 学制品可以用于高性能溶剂中， 用于电子学、 润滑油提取、 磁性丝涂层、 工程树脂、 药物中间 体、 化妆品、 喷发剂和高价值的聚合物。 GBL本身具有许多用途， 包括作为用于油漆剥离的溶 剂、 脱脂剂、 聚氨酯的粘度调节剂、 水溶性墨汁的分散剂、 氨基甲酸酯和聚酰胺的固化剂、 包 被金属的塑料的蚀刻剂、 橡胶添加剂和除草剂成分。 0003 通过几种不同的化学方法来生产基于石油的GBL。 例如， 可以通过-羟基丁酸 (GHB)的脱水， 通过乙炔与甲醛的反应或马来酸酐或琥珀酸酐和它们的酯的汽相氢化合成 它。 后两种方法分别称作Reppe方法和

22、Davy方法。 Reppe方法形成于二十世纪四十年代， 在历 史上是制备1， 4-丁二醇的第一种商业途径。 该方法从使乙炔和甲醛一起反应开始， 然后进 行一系列氢化级， 以得到BDO， 最后脱氢， 以产生GBL。 该方法的主要缺点是， 起始反应物是非 常危险的， 通常会带给生产商操作挑战和环境挑战。 另外， 乙炔是相对昂贵的原料。 0004 Davy方法形成于二十世纪九十年代， 该方法使用多级方法， 从使熔化的马来酸酐 与甲醇反应生成马来酸单甲酯开始。 接着， 在有酸性树脂催化剂存在下， 将马来酸单甲酯从 马来酸单甲酯转化成马来酸二甲酯。 使用催化的汽相氢化， 将马来酸二甲酯转化成琥珀酸 二甲

23、酯， 最后通过一系列其它的反应， 转化成GBL。 精制终产物， 以得到高纯度的GBL。 许多专 利描述了用于将马来酸酐或琥珀酸酐转化成GBL的不同类型的氢化催化剂。 这些包括： 亚铬 酸铜(参见美国专利号3,065,243)、 含有镍的亚铬酸铜(美国专利号4,006,165)和氧化铜、 氧化锌或氧化铝的混合物(美国专利号5,347,021)以及还原的氧化铜和氧化铝混合物(美 国专利号6,075,153)。 0005 尽管大量氢化催化剂可用于GBL生产， 存在需要克服的催化剂性能的缺陷， 诸如产 率、 选择性、 产物回收的容易性和成本。 0006 因此， 需要开发新的GBL生产方法， 所述方法不

24、仅解决了产率、 纯度和生产成本的 改进， 而且使用对环境具有更积极影响的可持续的原料。 发明内容 0007 本发明一般地涉及集成的生物精制方法， 所述方法用于从可再生的碳资源生产高 纯度的、 高产率的、 基于生物的-丁内酯(GBL)产物。 在一个方面， 描述了一种从经遗传工 程化的微生物生物质生产-丁内酯(GBL)产物的方法， 所述微生物生物质代谢葡萄糖或任 说明书 1/53 页 5 CN 102781926 B 6 何其它可再生的原料来在微生物细胞内生成4-羟基丁酸同聚物(P4HB)， 随后与催化剂一起 受控地加热含有P4HB的生物质， 形成-丁内酯(GBL)产物。 生物质中P4HB的水平应

25、当大于 总生物质的10重量。 该生物过程的优点是， 它使用可再生的碳源作为原料， 所述经遗传工 程化的微生物以非常高的产率生产P4HB而对宿主细胞没有不利的毒性效应(这会限制过程 效率)， 且当与催化剂相混合并加热时， 能够以高产率生产高纯度的基于生物的GBL。 0008 在某些方面， 来自宿主生物体的重组工程化的P4HB生物质充当可再生源用于将4- 羟基丁酸同聚物转化成有用的中间体GBL。 在有些实施方案中， 可再生原料源选自： 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 阿拉伯糖、 麦芽糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体或这 些中的2种或更多种的组合。 然后在有催化剂存在下处理生

26、产的P4HB生物质， 以生成-丁 内酯(GBL)。 在其它实施方案中， 在与催化剂混合之前， 干燥所述P4HB生物质。 在特定实施方 案中， 所述方法另外包括： 回收-丁内酯产物。 在某些实施方案中， 所述回收是通过浓缩。 0009 在有些实施方案中， 进一步加工所述GBL以用于生产其它希望的商品和专门产品， 例如1， 4-丁二醇(BDO)、 四氢呋喃(THF)、 N-甲基吡咯烷酮(NMP)、 N-乙基吡咯烷酮(NEP)、 2- 吡咯烷酮、 N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。 0010 已经通过如下方式遗传修饰用于生产含有P4HB的生物质的宿主生物体： 在野生型 或经

27、遗传工程化的P4HB生产生物体中导入基因和/或删除基因， 从而建立从廉价的可再生 的原料合成P4HB的菌株。 在图1中提供了用于产生P4HB的一个示例性的途径， 应当理解， 也 可以导入或抑制构成该途径的其它酶学变化以用于希望的P4HB生产。 0011 在一个方面， 本发明提供了一种用于生产基于生物的-丁内酯产物的方法。 在某 些实施方案中， 产物中的-丁内酯具有100的基于生物的碳含量(例如， 基于14C同位素分 析来测定)。 所述方法包括： 混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂； 将 所述生物质与催化剂一起加热， 以将4-羟基丁酸转化成-丁内酯产物。 在某些实施方案 中，

28、 -丁内酯产物的产率是约85重量或更大， 这基于产物中的1克-丁内酯/克聚-4-羟 基丁酸。 所述经遗传工程化的重组宿主生产4-羟基丁酸聚合物。 0012 在另一个方面， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟 基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶 基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或在两 个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多 个基因： 琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化 成琥珀酰-Co

29、A； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成 琥珀酸半醛； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4- 羟基丁酸； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 和 聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚- 4-羟基丁酸。 在另一个方面， 所述宿主具有2个或更多个、 3个或更多个、 4个或更多个或全部 5个稳定掺入的、 编码上面列出的酶的基因。 0013 在本发明的另一个方面， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有 稳定地掺入的编码一种或

30、多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主： 磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠 檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所 说明书 2/53 页 6 CN 102781926 B 7 述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中 所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化 成1， 3-二磷酸甘油

31、酸， 形成NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依 赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H +； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸； 磷酸丁酰基 转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 0014 在另一个方面， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自这样的重组宿 主， 所述重组宿主具有聚-

32、4-羟基丁酸途径， 并稳定地表达编码2种或更多种酶的2个或更多 个基因、 编码3种或更多种酶的3个或更多个基因、 编码4种或更多种酶的4个或更多个基因 或编码5种或更多种酶的5个或更多个基因， 所述酶选自： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠檬酸裂合酶， 其中所 述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸合酶能够 将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸； NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖 性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3二磷酸甘油酸， 形成NADPH+H

33、； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘 油醛3-磷酸转化成1， 3二磷酸甘油酸， 形成NADH+H； 并任选地在选自下述的1个或多个基因、 2个或更多个基因、 3个或更多个基因、 4个或更多个基因、 5个或更多个基因或6个基因中具 有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 0015 在另一个实施方案中， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有 聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半 醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛

34、脱氢酶基因中具有抑制性突 变， 或在两个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因： 琥珀酰- CoA:辅酶A转移酶， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； 琥 珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛； 琥珀 酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸； CoA转移 酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 和聚羟基链烷酸酯合 酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。 0016 在另一个实施方案中

35、， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳 定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸 裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转 化成苹果酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成 ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述 NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成

36、NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢 酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸 激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰 说明书 3/53 页 7 CN 102781926 B 8 基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任选地在选自下述的一 个或多个基因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 0017 在某些实施方案中， 其中用于本发明的方法中的经遗

37、传工程化的生物质来自具有 聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主具有稳定地掺入的、 编码一种或多种选自下 述的酶的一个或多个基因： 琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶， 其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶 能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将 琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥 珀酸半醛转化成4-羟基丁酸； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4- 羟基丁酰基-CoA； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁 酰基-CoA聚合成聚-4-羟

38、基丁酸。 0018 在其它实施方案中， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定 地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主： 磷酸烯醇丙酮酸羧 化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸； 异柠檬酸 裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸； 苹果酸合酶， 其中所述苹 果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA； NADP依赖性的甘油醛-3- 磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱

39、氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成NADPH+H+； NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NAD依赖性 的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H+； 丁 酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸； 磷酸丁酰基转移 酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA； 并任 选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA和maeB。 0019 在本发明的一个特定方面， 使用可再生的原料培养重

40、组宿主， 以生产4-羟基丁酸 生物质， 然后在有催化剂存在下处理生产的生物质， 以生产-丁内酯(GBL)产物， 其中- 丁内酯产物的产率是约85重量。 0020 在某些实施方案中， 可再生的原料源是选自： 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 阿拉伯糖、 麦芽 糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组合。 0021 本发明也涉及通过本文所述的方法生产的基于生物的-丁内酯产物。 在某些方 面， 生产的产物中的-丁内酯的量是85或大于85。 在另一个方面， 本发明涉及从可再 生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质， 所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为用于生产-丁 内酯产物的原料，

41、其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于生物质的50重量。 0022 在本发明的某些实施方案中， 所述生物质宿主是细菌、 酵母、 真菌、 藻类、 蓝细菌或 它们中的任意2种或更多种的混合物。 所述细菌包括、 但不限于： 大肠杆菌、 真养产碱菌 (Alcaligeneseutrophus， 重命名为真养产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)、 芽孢杆菌属 (Bacillusspp.)、 广泛产碱菌(Alcaligeneslatus)、 固氮菌属(Azotobacter)、 气单胞菌 属(Aeromonas)、 丛毛平胞菌属(Comamonas)、 假单胞菌(Pseudomonads)、

42、 假单胞菌属 (Pseudomonas)、 罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、 克雷伯菌属(Klebsiella)、 聚球藻属 (Synechococcussp.)PCC7002、 聚球藻属PCC7942、 集胞藻属(Synechocystissp.)PCC 6803和嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-I(蓝细菌)、 微温绿硫菌 说明书 4/53 页 8 CN 102781926 B 9 (Chlorobiumtepidum)(绿硫细菌)、 Chloroflexusauranticus(绿非硫细菌)、 微温着色菌 (Chromatiumtep

43、idum)和酒色着色菌(Chromatiumvinosum)(紫色硫细菌)、 深红红螺菌 (Rhodospirillumrubrum)、 荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)和沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonaspalustris)。 在其它实施方案中， 所述重组宿主是藻类。 所述藻类包 括、 但不限于： 微小小球藻( Chlorellaminutissima )、 浮水小球藻( Chlorella emersonii)、 富油小球藻(Chlorellasorokiniana)、 椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、 小球藻属(Chlo

44、rellasp.)或原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)。 0023 在本发明的某些实施方案中， 所述加热是在下述温度下： 约100至约350， 或约 200至约350， 或约225至300。 在有些实施方案中， 所述加热会将生物质的水含量降 低至约5重量或更低。 在所述的实施方案中， 所述加热持续约30秒至约5分钟的时间段， 或 是约5分钟至约2小时。 在某些实施方案中， 所述-丁内酯包含小于5的不希望的副产物。 在某些实施方案中， 所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。 催化剂的重量百分比是在约4至约 50的范围内。 在具体实施方案中， 催化剂的重量百分比是在约4至约50的

45、范围内， 且 所述加热是在约300下。 在某些实施方案中， 进一步回收-丁内酯产物。 在有些实施方案 中， 所述催化剂是4重量的氢氧化钙， 且所述加热是在300的温度下。 0024 另外， 已消费的(残余的)PHA减少的生物质进一步用于能源开发， 例如用作燃料， 以产生过程蒸汽和/或热。 附图说明 0025 从在附图中图解的本发明的示例实施方案的以下更具体的描述会明白前述内容， 在所述附图中， 同样的参考符号表示在不同的视图中的相同部分。 所述附图不一定按照比 例绘制， 而是重点在于图解本发明的实施方案。 0026 图1是示例性的大肠杆菌中心代谢途径的示意图， 它显示了在实施例中修饰的或 导入

46、的或者可以修饰的反应。 在图中的编号表示在表1A中的反应编号。 用 “X” 标记通过删除 对应的基因而消除的反应。 缩写：“GA3P” ， D-甘油醛-3-磷酸；“G1， 3P” ， 1， 3-二磷酸甘油酸； “PEP” ， 磷酸烯醇丙酮酸；“PYR” ， 丙酮酸；“AcCoA” ， 乙酰辅酶A；“CIT” ， 柠檬酸；“ICT” ， 异柠檬 酸；“ KG” ， -酮戊二酸；“SUC-CoA” ， 琥珀酰CoA；“SUC” ， 琥珀酸；“Fum” ， 富马酸；“MAL” ， L-苹 果酸；“OAA” ， 草酰乙酸；“SSA” ， 琥珀酸半醛；“4HB” ， 4-羟基丁酸；“4HB-CoA” ，

47、 4-羟基丁酰基 CoA；“P4HB” ， 聚-4-羟基丁酸。 编号的反应：“1” ， 甘油醛-3-磷酸脱氢酶；“2” ， 丙酮酸激酶； “3” ， 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；“4” ， 苹果酸酶；“5” ， 异柠檬酸裂合酶；“6” ， 苹果酸脱氢酶； “7” ， 琥珀酸半醛脱氢酶；“8” ， -酮戊二酸脱羧酶；“9” ， 琥珀酸半醛还原酶；“10” ， CoA转移 酶；“11” ， 聚羟基链烷酸酯合酶；“12” ， 琥珀酸半醛脱氢酶， NADP+依赖性的。 0027 图2根据不同的实施方案从生物质回收GBL而将残余物转化成固体燃料的示意图。 0028 图3是根据不同的实施方案在不加入石灰(实线)

48、和加入5石灰(虚线)时干燥的 P4HB发酵液在300在N2中的重量减轻相对于时间的曲线。 该曲线显示了重量减轻斜率和 重量减轻完成的开始时间。 0029 图4(A-C)是根据一个实施方案在300热解以后的P4HB纯聚合物、 P4HB干燥发酵 液和P4HB干燥发酵液+5石灰(Ca(OH)2)催化剂的一系列气相色谱图。 0030 图5是根据一个实施方案在6.2min处的GC-MS峰与GBL(-丁内酯)的质谱文库匹 说明书 5/53 页 9 CN 102781926 B 10 配。 0031 图6是根据一个实施方案在11.1min处的GC-MS峰与GBL二聚体的质谱文库匹配。 0032 图7是用于P

49、4HB生物质的大规模热解的装置的示意图。 具体实施方式 0033 下面描述了本发明的示例实施方案。 0034 本发明提供了用于从生产聚-4-羟基丁酸聚合物的经遗传工程化的微生物(P4HB 生物质)生产基于生物的-丁内酯(GBL)的工艺和方法。 为了本发明的目的， 将P4HB定义为 也包括4-羟基丁酸与3-羟基丁酸的共聚物， 其中4-羟基丁酸在共聚物中的百分比大于共聚 物中单体的80、 85、 90， 优选地大于95。 在某些实施方案中， 使用本文所述的重组宿 主， 通过改良的P4HB生产工艺来生产P4HB生物质。 通过操纵(例如， 抑制和/或过表达)P4HB 途径中的某些基因来增加P4HB在生物质中的产率， 已经遗传地构建这些重组宿主， 以增加 P4HB的产率。 在发酵过程中生产P4HB生物质， 其中给经遗传工程化的微生物供给可再生底 物。 可再生底物包括： 从植物作物材料生产的发酵原料， 诸如糖类、 植物油、 脂肪酸或合成气 体。 从糖底物生产的生物质中的P4HB水平是生物质的总干重的大于10(例如， 约20、 约 30、 约40、 约50、 约60、 约70、 约80)。 然后将P4HB生物质与催化剂混合， 并加热， 以将P4HB热分解成基于生物的GBL。 0035 本文描述了一种用于生产GBL的替代方法， 所述方法基于使用可再生的碳源来