-丁内酯的生产方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102781926 A (43)申请公布日 2012.11.14 CN 102781926 A *CN102781926A* (21)申请号 201180009250.6 (22)申请日 2011.02.11 61/303,584 2010.02.11 US 61/382,855 2010.09.14 US 61/413,195 2010.11.12 US C07D 307/33(2006.01) C12P 7/62(2006.01) (71)申请人 梅塔玻利克斯公司 地址 美国马萨诸塞州 (72)发明人 J范瓦尔森 E安德森 J利卡塔 KA斯帕克斯 WR法默 C米尔

2、利 JA比克梅尔 A达姆布罗索 FA斯克拉利 TM拉姆塞尔 MS希瓦苏布拉玛尼安 Y沙布泰 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 陈文平 徐志明 (54) 发明名称 - 丁内酯的生产方法 (57) 摘要 本申请涉及用于制备基于生物的 - 丁内酯 产物的方法， 包括混合含有聚 4- 羟基 - 丁酸的遗 传工程化的生物质和催化剂并加热该生物质和催 化剂以将聚 4- 羟基 - 丁酸转化为 - 丁内酯产 物。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.08.10 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/024612 2011.02.11 (8

3、7)PCT申请的公布数据 WO2011/100601 EN 2011.08.18 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 55 页 附图 6 页 按照条约第 19 条修改的权利要求书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 55 页 附图 6 页 按照条约第19条修改的权利要求书 4 页 1/3 页 2 1. 一种用于生产基于生物的 - 丁内酯产物的方法， 所述方法包括 ： a) 混合包含聚 -4- 羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂 ； 和 b)将所述生物质与所述催化剂一起加热， 以将所述聚4-羟基丁酸转化成-丁内酯产

4、物， 其中所述 - 丁内酯的产率 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚 -4- 羟基 丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非 CoA 依赖的 NAD 依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶 基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或在两 个基因中具有所述抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个 或多个基因 ： 琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶能够将琥珀 酸转化成琥珀酰 -CoA ； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰 -CoA

5、转化成琥珀酸半醛 ； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转 化成4-羟基丁酸 ； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰 基-CoA ； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA 聚合成聚 -4- 羟基丁酸。 3. 根据权利要求 1 或权利要求 2 所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具 有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主 ： 磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异 柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸

6、裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中 所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸 ； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖 性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸甘 油酸，

7、形成 NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰 基 - 磷酸 ； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将 4- 羟基丁酰基 - 磷酸转 化成4-羟基丁酰基-CoA ； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其中所述方法另外包括下述初始步骤 ： 用 可再生的原料培养重组宿主， 以生成聚 -4- 羟基丁酸生物质。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其中所述可再生的原料的来源选自 ： 葡萄糖、 果糖、

8、 蔗 糖、 阿拉伯糖、 麦芽糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组 合。 6. 根据权利要求 1-5 中任一项所述的方法， 其中所述生物质宿主是细菌、 酵母、 真菌、 藻类、 蓝细菌或它们中的任意 2 种或更多种的混合物。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其中所述生物质宿主是细菌。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述细菌选自 ： 大肠杆菌、 真养产碱菌 ( 重命名 为真养产碱杆菌 )、 芽孢杆菌属、 广泛产碱菌、 固氮菌属、 气单胞菌属、 丛毛平胞菌属、 假单 胞菌、 假单胞菌属、 罗尔斯通氏菌属、 克雷伯菌属、 聚球藻属的种 PCC7002

9、、 聚球藻属的种 PCC 7942、 集胞藻属的种 PCC 6803、 嗜热蓝细菌聚球藻 BP-I、 微温绿硫菌、 Chloroflexus 权 利 要 求 书 CN 102781926 A 2 2/3 页 3 auranticus、 微温着色菌和酒色着色菌、 深红红螺菌、 荚膜红细菌和沼泽红假单胞菌。 9. 根据权利要求 6 所述的方法， 其中所述重组宿主是藻类。 10. 根据权利要求 1-9 中任一项所述的方法， 其中加热是在约 100至约 350的温度 下。 11. 根据权利要求 1-10 中任一项所述的方法， 其中所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。 12. 根据权利要求 11 所述的方法，

10、 其中所述催化剂的重量百分比是在约 4至约 50 的范围内。 13. 根据权利要求 1-12 中任一项所述的方法， 其中加热将所述生物质的水含量降低至 约 5 重量或更低。 14. 根据权利要求 1-13 中任一项所述的方法， 其中所述加热温度是约 200至约 350。 15. 根据权利要求 14 所述的方法， 其中所述加热温度是约 225至约 300。 16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法， 其中所述加热持续约30秒至约5分钟的 时间段。 17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法， 其中所述时间段是约5分钟至约2小时。 18. 根据权利要求 1-17 中任一项所述的方法， 其另外

11、包括 ： 回收所述 - 丁内酯产物。 19. 根据权利要求 1-18 中任一项所述的方法， 其中所述 - 丁内酯产物包含小于 5 重 量的副产物。 20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法， 其中进一步加工所述-丁内酯， 以形成 下述的一种或多种 ： 1， 4- 丁二醇 (BDO)、 四氢呋喃 (THF)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 N- 乙基 吡咯烷酮 (NEP)、 2- 吡咯烷酮、 N- 乙烯基吡咯烷酮 (NVP) 和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。 21.根据权利要求1所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基 丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主任选地在它的非

12、 CoA 依赖的 NAD 依赖性的琥珀酸半醛 脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或在两个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因 ： 琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； 琥 珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰 -CoA 转化成琥珀酸半醛 ； 琥珀 酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成 4- 羟基丁酸 ； CoA 转 移酶， 其中所述 CoA 转移酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰基

13、 -CoA ； 和聚羟基链烷 酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将 4- 羟基丁酰基 -CoA 聚合成聚 -4- 羟基丁 酸。 22. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺 入的编码下述酶的基因的重组宿主 ： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧 化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶 能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹 果酸和琥珀酸 ； 琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 )， 其中所述琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 AD

14、P 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所 述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷 权 利 要 求 书 CN 102781926 A 3 3/3 页 4 酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所 述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸 ； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述 磷酸

15、丁酰基转移酶能够将 4- 羟基丁酰基 - 磷酸转化成 4- 羟基丁酰基 -CoA ； 并任选地在选 自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 23. 根据权利要求所述的方法 1， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚 -4- 羟 基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的 一个或多个基因 ： 琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶能够 将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀 酰 -CoA

16、转化成琥珀酸半醛 ； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸 半醛转化成4-羟基丁酸 ； CoA转移酶， 其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟 基丁酰基 -CoA ； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将 4- 羟基丁酰 基 -CoA 聚合成聚 -4- 羟基丁酸。 24. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺 入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主 ： 磷酸烯醇丙酮酸羧化 酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠檬酸裂 合酶， 其中所述异柠檬酸裂合

17、酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所述苹果 酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸 ； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所述 琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖性的甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸 转化成 1， 3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成 NADH+

18、H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸 ； 磷 酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将 4- 羟基丁酰基 - 磷酸转化成 4- 羟基 丁酰基 -CoA ； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 25. 根据权利要求 1-24 中任一项所述的方法， 其中所述催化剂的重量是在约 4至 约 50的范围内， 且所述加热是在约 300下。 26. 根据权利要求 1-25 中任一项所述的方法， 其中所述催化剂是约 4 重量的氢氧化 钙， 且所述加热是在 300的温度下。

19、 27. 通过前述权利要求中任一项所述的方法生产的基于生物的 - 丁内酯产物。 28. 根据权利要求 27 所述的产物， 其中所述 - 丁内酯产物包含小于 5 重量的副产 物。 29.从可再生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质， 所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为 用于生产 - 丁内酯产物的原料， 其中所述生物质中的聚 -4- 羟基丁酸水平大于所述生物 质的 50 重量。 30. 根据权利要求 27 所述的基于生物的 - 丁内酯产物， 其中所述产物中的所述 - 丁内酯具有 100的基于生物的碳含量。 31. 根据权利要求 1-26 中任一项所述的方法， 其中基于所述产物中的 1 克 - 丁内酯

20、/ 克聚 -4- 羟基丁酸， 所述产物是约 85 重量或更大。 权 利 要 求 书 CN 102781926 A 4 1/55 页 5 - 丁内酯的生产方法 背景技术 0001 随着日益减少的石油资源、 日益增加的能量价格和环境问题， 开发节省能量的生 物精制方法来从可再生的、 低成本的、 碳资源生产基于生物的化学制品， 会提供克服基于石 油的化学制品的日益增加的限制的独特解决方案。 0002 可以使用生物精制方法生产的、 具有广泛工业和制药用途的一种化学制品是 - 丁内酯 (GBL)。据估测， GBL 的全球市场需求是 8.5 亿磅 / 年， 换而言之， 每年的总销售 额是10亿美元。 -丁

21、内酯是一种无色的、 弱气味的液体， 主要用作下述商业上重要的化学 制品的生产的中间体 ： 诸如 1， 4- 丁二醇 (BDO)、 四氢呋喃 (THF)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 N- 乙基吡咯烷酮 (NEP)、 2- 吡咯烷酮、 N- 乙烯基吡咯烷酮 (NVP)、 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 诸 如此类。 这些化学制品可以用于高性能溶剂中， 用于电子学、 润滑油提取、 磁性丝涂层、 工程 树脂、 药物中间体、 化妆品、 喷发剂和高价值的聚合物。GBL 本身具有许多用途， 包括作为用 于油漆剥离的溶剂、 脱脂剂、 聚氨酯的粘度调节剂、 水溶性墨汁的分散剂、 氨基甲酸酯和聚 酰胺的固化剂

22、、 包被金属的塑料的蚀刻剂、 橡胶添加剂和除草剂成分。 0003 通过几种不同的化学方法来生产基于石油的 GBL。例如， 可以通过 - 羟基丁酸 (GHB) 的脱水， 通过乙炔与甲醛的反应或马来酸酐或琥珀酸酐和它们的酯的汽相氢化合成 它。后两种方法分别称作 Reppe 方法和 Davy 方法。Reppe 方法形成于二十世纪四十年代， 在历史上是制备 1， 4- 丁二醇的第一种商业途径。该方法从使乙炔和甲醛一起反应开始， 然 后进行一系列氢化级， 以得到 BDO， 最后脱氢， 以产生 GBL。该方法的主要缺点是， 起始反应 物是非常危险的， 通常会带给生产商操作挑战和环境挑战。另外， 乙炔是相对

23、昂贵的原料。 0004 Davy 方法形成于二十世纪九十年代， 该方法使用多级方法， 从使熔化的马来酸酐 与甲醇反应生成马来酸单甲酯开始。 接着， 在有酸性树脂催化剂存在下， 将马来酸单甲酯从 马来酸单甲酯转化成马来酸二甲酯。使用催化的汽相氢化， 将马来酸二甲酯转化成琥珀酸 二甲酯， 最后通过一系列其它的反应， 转化成 GBL。精制终产物， 以得到高纯度的 GBL。许多 专利描述了用于将马来酸酐或琥珀酸酐转化成 GBL 的不同类型的氢化催化剂。这些包括 ： 亚铬酸铜(参见美国专利号3,065,243)、 含有镍的亚铬酸铜(美国专利号4,006,165)和氧 化铜、 氧化锌或氧化铝的混合物(美国

24、专利号5,347,021)以及还原的氧化铜和氧化铝混合 物 ( 美国专利号 6,075,153)。 0005 尽管大量氢化催化剂可用于 GBL 生产， 存在需要克服的催化剂性能的缺陷， 诸如 产率、 选择性、 产物回收的容易性和成本。 0006 因此， 需要开发新的 GBL 生产方法， 所述方法不仅解决了产率、 纯度和生产成本的 改进， 而且使用对环境具有更积极影响的可持续的原料。 发明内容 0007 本发明一般地涉及集成的生物精制方法， 所述方法用于从可再生的碳资源生产高 纯度的、 高产率的、 基于生物的 - 丁内酯 (GBL) 产物。在一个方面， 描述了一种从经遗传 工程化的微生物生物质生

25、产 - 丁内酯 (GBL) 产物的方法， 所述微生物生物质代谢葡萄糖 说 明 书 CN 102781926 A 5 2/55 页 6 或任何其它可再生的原料来在微生物细胞内生成 4- 羟基丁酸同聚物 (P4HB)， 随后与催化 剂一起受控地加热含有 P4HB 的生物质， 形成 - 丁内酯 (GBL) 产物。生物质中 P4HB 的水 平应当大于总生物质的 10 重量。该生物过程的优点是， 它使用可再生的碳源作为原料， 所述经遗传工程化的微生物以非常高的产率生产 P4HB 而对宿主细胞没有不利的毒性效应 ( 这会限制过程效率 )， 且当与催化剂相混合并加热时， 能够以高产率生产高纯度的基于生 物的

26、 GBL。 0008 在某些方面， 来自宿主生物体的重组工程化的 P4HB 生物质充当可再生源用于将 4-羟基丁酸同聚物转化成有用的中间体GBL。 在有些实施方案中， 可再生原料源选自 ： 葡萄 糖、 果糖、 蔗糖、 阿拉伯糖、 麦芽糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体 或这些中的 2 种或更多种的组合。然后在有催化剂存在下处理生产的 P4HB 生物质， 以生成 - 丁内酯 (GBL)。在其它实施方案中， 在与催化剂混合之前， 干燥所述 P4HB 生物质。在特 定实施方案中， 所述方法另外包括 ： 回收 - 丁内酯产物。在某些实施方案中， 所述回收是 通过浓缩。 00

27、09 在有些实施方案中， 进一步加工所述 GBL 以用于生产其它希望的商品和专门产 品， 例如 1， 4- 丁二醇 (BDO)、 四氢呋喃 (THF)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 N- 乙基吡咯烷酮 (NEP)、 2- 吡咯烷酮、 N- 乙烯基吡咯烷酮 (NVP)、 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等。 0010 已经通过如下方式遗传修饰用于生产含有 P4HB 的生物质的宿主生物体 ： 在野生 型或经遗传工程化的P4HB生产生物体中导入基因和/或删除基因， 从而建立从廉价的可再 生的原料合成 P4HB 的菌株。在图 1 中提供了用于产生 P4HB 的一个示例性的途径， 应当理 解， 也可以

28、导入或抑制构成该途径的其它酶学变化以用于希望的 P4HB 生产。 0011 在一个方面， 本发明提供了一种用于生产基于生物的 - 丁内酯产物的方法。在 某些实施方案中， 产物中的 - 丁内酯具有 100的基于生物的碳含量 ( 例如， 基于 14C 同 位素分析来测定 )。所述方法包括 ： 混合包含聚 -4- 羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和 催化剂 ； 将所述生物质与催化剂一起加热， 以将 4- 羟基丁酸转化成 - 丁内酯产物。在某 些实施方案中， - 丁内酯产物的产率是约 85 重量或更大， 这基于产物中的 1 克 - 丁 内酯 / 克聚 -4- 羟基丁酸。所述经遗传工程化的重组宿主生产 4

29、- 羟基丁酸聚合物。 0012 在另一个方面， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚 -4- 羟 基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非 CoA 依赖的 NAD 依赖性的琥珀酸半醛脱氢 酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变， 或在 两个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或 多个基因 ： 琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶能够将琥珀酸 转化成琥珀酰 -CoA ； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰 -CoA 转 化成琥珀酸半

30、醛 ； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化 成 4- 羟基丁酸 ； CoA 转移酶， 其中所述 CoA 转移酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰 基-CoA ； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA 聚合成聚 -4- 羟基丁酸。在另一个方面， 所述宿主具有 2 个或更多个、 3 个或更多个、 4 个或 更多个或全部 5 个稳定掺入的、 编码上面列出的酶的基因。 0013 在本发明的另一个方面， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有 稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主 ：

31、磷酸烯醇丙酮 说 明 书 CN 102781926 A 6 3/55 页 7 酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠 檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所 述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸 ； 琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 )， 其中所述琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖 性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1，

32、3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸甘 油酸， 形成 NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰 基 - 磷酸 ； 磷酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将 4- 羟基丁酰基 - 磷酸转 化成4-羟基丁酰基-CoA ； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 0014 在另一个方面， 用于本发明的

33、方法中的经遗传工程化的生物质来自这样的重组宿 主， 所述重组宿主具有聚 -4- 羟基丁酸途径， 并稳定地表达编码 2 种或更多种酶的 2 个或更 多个基因、 编码 3 种或更多种酶的 3 个或更多个基因、 编码 4 种或更多种酶的 4 个或更多个 基因或编码 5 种或更多种酶的 5 个或更多个基因， 所述酶选自 ： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其 中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸合 酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸 ； NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶

34、， 其中所述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3 二磷酸甘油酸， 形 成 NADPH+H ； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸 脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3 二磷酸甘油酸， 形成 NADH+H ； 并任选地在选自下述 的 1 个或多个基因、 2 个或更多个基因、 3 个或更多个基因、 4 个或更多个基因、 5 个或更多个 基因或 6 个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 0015 在另一个实施方案中， 用于本发

35、明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有 聚 -4- 羟基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主在它的非 CoA 依赖的 NAD 依赖性的琥珀酸 半醛脱氢酶基因或它的非 CoA 依赖的 NADP 依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制 性突变， 或在两个基因中具有抑制性突变， 且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因 ： 琥珀 酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀 酰 -CoA ； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰 -CoA 转化成琥珀 酸半醛 ； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成

36、 4- 羟基 丁酸 ； CoA 转移酶， 其中所述 CoA 转移酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰基 -CoA ； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将 4- 羟基丁酰基 -CoA 聚合成 聚 -4- 羟基丁酸。 0016 在另一个实施方案中， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳 定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主 ： 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 其中所述磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠檬酸裂合酶， 其中所述异柠檬酸 裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转 化成苹果酸和

37、琥珀酸 ； 琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 )， 其中所述琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 说 明 书 CN 102781926 A 7 4/55 页 8 其中所述 NADP 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸 甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD 依赖性的甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶能够将甘油醛 3- 磷酸转化成 1， 3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADH+H+

38、； 丁酸激 酶， 其中所述丁酸激酶能够将 4- 羟基丁酸转化成 4- 羟基丁酰基 - 磷酸 ； 磷酸丁酰基转移 酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ； 并 任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 0017 在某些实施方案中， 其中用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有 聚 -4- 羟基丁酸途径的重组宿主， 其中所述宿主具有稳定地掺入的、 编码一种或多种选自 下述的酶的一个或多个基因 ： 琥珀酰 -CoA: 辅酶 A 转移酶， 其中所述琥珀酰 -CoA:

39、辅酶 A 转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； 琥珀酸半醛脱氢酶， 其中所述琥珀酸半醛脱氢酶 能够将琥珀酰 -CoA 转化成琥珀酸半醛 ； 琥珀酸半醛还原酶， 其中所述琥珀酸半醛还原酶能 够将琥珀酸半醛转化成 4- 羟基丁酸 ； CoA 转移酶， 其中所述 CoA 转移酶能够将 4- 羟基丁酸 转化成 4- 羟基丁酰基 -CoA ； 和聚羟基链烷酸酯合酶， 其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将 4- 羟基丁酰基 -CoA 聚合成聚 -4- 羟基丁酸。 0018 在其它实施方案中， 用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定 地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组

40、宿主 ： 磷酸烯醇丙酮酸羧 化酶， 其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸 ； 异柠檬酸 裂合酶， 其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸 ； 苹果酸合酶， 其中所述苹 果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸 ； 琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)， 其中所 述琥珀酸 -CoA 连接酶 ( 形成 ADP 的 ) 能够将琥珀酸转化成琥珀酰 -CoA ； NADP 依赖性的甘 油醛-3-磷酸脱氢酶， 其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸 转化成 1， 3- 二磷酸甘油酸， 形成 NADPH+H+； NAD 依赖性的甘油醛 -3-

41、磷酸脱氢酶， 其中所述 NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1， 3-二磷酸甘油酸， 形成 NADH+H+； 丁酸激酶， 其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸 ； 磷 酸丁酰基转移酶， 其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将 4- 羟基丁酰基 - 磷酸转化成 4- 羟基 丁酰基 -CoA ； 并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏 ： yneI、 gabD、 pykF、 pykA、 maeA 和 maeB。 0019 在本发明的一个特定方面， 使用可再生的原料培养重组宿主， 以生产 4- 羟基丁酸 生物质， 然后在有催化剂存在下处理生产的生物质，

42、 以生产 - 丁内酯 (GBL) 产物， 其中 - 丁内酯产物的产率是约 85 重量。 0020 在某些实施方案中， 可再生的原料源是选自 ： 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 阿拉伯糖、 麦芽 糖、 乳糖、 木糖、 脂肪酸、 植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组合。 0021 本发明也涉及通过本文所述的方法生产的基于生物的 - 丁内酯产物。在某些 方面， 生产的产物中的 - 丁内酯的量是 85或大于 85。在另一个方面， 本发明涉及从 可再生资源生产的聚 -4- 羟基丁酸生物质， 所述聚 -4- 羟基丁酸生物质适合作为用于生产 -丁内酯产物的原料， 其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于生物

43、质的50重量。 0022 在本发明的某些实施方案中， 所述生物质宿主是细菌、 酵母、 真菌、 藻类、 蓝细菌 或它们中的任意 2 种或更多种的混合物。所述细菌包括、 但不限于 ： 大肠杆菌、 真养产碱 菌 (Alcaligenes eutrophus， 重命名为真养产碱杆菌 (Ralstonia eutropha)、 芽孢杆菌 说 明 书 CN 102781926 A 8 5/55 页 9 属 (Bacillus spp.)、 广泛产碱菌 (Alcaligenes latus)、 固氮菌属 (Azotobacter)、 气单 胞菌属 (Aeromonas)、 丛毛平胞菌属 (Comamonas

44、)、 假单胞菌 (Pseudomonads)、 假单胞菌 属 (Pseudomonas)、 罗尔斯通氏菌属 (Ralstonia)、 克雷伯菌属 (Klebsiella)、 聚球藻属 (Synechococcus sp.)PCC7002、 聚球藻属 PCC 7942、 集胞藻属 (Synechocystis sp.)PCC 6803 和嗜热蓝细菌聚球藻 (Thermosynechococcus elongatus)BP-I( 蓝细菌 )、 微温绿硫 菌 (Chlorobium tepidum)( 绿硫细菌 )、 Chloroflexus auranticus( 绿非硫细菌 )、 微温 着色菌

45、(Chromatium tepidum) 和酒色着色菌 (Chromatium vinosum)( 紫色硫细菌 )、 深红 红螺菌 (Rhodospirillum rubrum)、 荚膜红细菌 (Rhodobacter capsulatus) 和沼泽红假 单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)。在其它实施方案中， 所述重组宿主是藻类。所 述藻类包括、 但不限于 ： 微小小球藻 (Chlorella minutissima)、 浮水小球藻 (Chlorella emersonii)、富 油 小 球 藻 (Chlorella sorokiniana)、椭 圆 形 小 球

46、藻 (Chlorella ellipsoidea)、 小球藻属 (Chlorella sp.) 或原始小球藻 (Chlorella protothecoides)。 0023 在本发明的某些实施方案中， 所述加热是在下述温度下 ： 约 100至约 350， 或 约 200至约 350， 或约 225至 300。在有些实施方案中， 所述加热会将生物质的水含 量降低至约 5 重量或更低。在所述的实施方案中， 所述加热持续约 30 秒至约 5 分钟的时 间段， 或是约 5 分钟至约 2 小时。在某些实施方案中， 所述 - 丁内酯包含小于 5的不希 望的副产物。在某些实施方案中， 所述催化剂是碳酸钠或

47、氢氧化钙。催化剂的重量百分比 是在约 4至约 50的范围内。在具体实施方案中， 催化剂的重量百分比是在约 4至约 50的范围内， 且所述加热是在约 300下。在某些实施方案中， 进一步回收 - 丁内酯产 物。在有些实施方案中， 所述催化剂是 4 重量的氢氧化钙， 且所述加热是在 300的温度 下。 0024 另外， 已消费的(残余的)PHA减少的生物质进一步用于能源开发， 例如用作燃料， 以产生过程蒸汽和 / 或热。 附图说明 0025 从在附图中图解的本发明的示例实施方案的以下更具体的描述会明白前述内容， 在所述附图中， 同样的参考符号表示在不同的视图中的相同部分。所述附图不一定按照比 例绘

48、制， 而是重点在于图解本发明的实施方案。 0026 图 1 是示例性的大肠杆菌中心代谢途径的示意图， 它显示了在实施例中修饰的或 导入的或者可以修饰的反应。在图中的编号表示在表 1A 中的反应编号。用 “X” 标记通过删 除对应的基因而消除的反应。 缩写 ：“GA3P” ， D-甘油醛-3-磷酸 ；“G1， 3P” ， 1， 3-二磷酸甘油 酸 ；“PEP” ， 磷酸烯醇丙酮酸 ；“PYR” ， 丙酮酸 ；“AcCoA” ， 乙酰辅酶 A ；“CIT” ， 柠檬酸 ；“ICT” ， 异柠檬酸 ；“KG” ， - 酮戊二酸 ；“SUC-CoA” ， 琥珀酰 CoA ；“SUC” ， 琥珀酸 ；“

49、Fum” ， 富马酸 ； “MAL” ， L- 苹果酸 ；“OAA” ， 草酰乙酸 ；“SSA” ， 琥珀酸半醛 ；“4HB” ， 4- 羟基丁酸 ；“4HB-CoA” ， 4- 羟基丁酰基 CoA ；“P4HB” ， 聚 -4- 羟基丁酸。编号的反应 ：“1” ， 甘油醛 -3- 磷酸脱氢 酶 ；“2” ， 丙酮酸激酶 ；“3” ， 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ；“4” ， 苹果酸酶 ；“5” ， 异柠檬酸裂合酶 ； “6” ， 苹果酸脱氢酶 ；“7” ， 琥珀酸半醛脱氢酶 ；“8” ， - 酮戊二酸脱羧酶 ；“9” ， 琥珀酸半醛 还原酶 ；“10” ， CoA 转移酶 ；“11” ， 聚羟基链烷酸酯合酶 ；“12” ， 琥珀酸半醛脱氢酶， NADP+ 依 赖性的。 说 明 书 CN 102781926 A 9 6/55 页 10 0027 图 2 根据不同的实施方案从生物质回收 GBL 而将残余物转化成固体燃料的示意 图。 0028 图 3 是根据不同的实施方案在不加入石灰 ( 实线 ) 和加入 5石灰 ( 虚线 ) 时干 燥的 P4HB 发酵液在 300在 N2中的重量减轻相对于时间的曲线。该曲线显示了重量减轻 斜率和重量减轻完成的开始时间。 0029 图 4(A-C) 是根据一个实施方案在 300热解以后的 P4HB 纯聚合物、 P4HB 干燥