一种麦角甾醇的制备方法和用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610278263.8 (22)申请日 2016.04.29 (71)申请人 周礼红 地址 550025 贵州省贵阳市贵安新区电子 信息产业园 (72)发明人 周礼红侯素媛 (74)专利代理机构 北京卓唐知识产权代理有限 公司 11541 代理人 龚洁 (51)Int.Cl. C07J 9/00(2006.01) A61K 31/575(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (54)发明名称 一种麦角甾醇的制备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种麦

2、角甾醇的制备方法， 包 括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入提 取溶剂， 采用浸提法提取得到粗提品， 然后采用 柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述 一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶 薄层层析结果的洗脱液合并再次进行柱层析洗 脱得到二次纯化洗脱液， 将所述二次纯化洗脱液 除去溶剂并通过石油醚进行重结晶得到麦角甾 醇。 首次提供了以红曲霉为原料制备麦角甾醇， 本发明先将红曲霉洋品粗提品进行萃取， 进一步 根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选 最佳的柱层析洗脱剂， 使其有效分离纯化出麦角 甾醇。 本发明的制备方法简单、 易实现、 耗时短， 且原料易得成本低， 实现麦

3、角甾醇的批量生产。 权利要求书1页 说明书10页 附图6页 CN 105884850 A 2016.08.24 CN 105884850 A 1.一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的 步骤。 2.根据权利要求1所述的一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发 酵样品， 加入提取溶剂， 采用浸提法提取得到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次 纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱 液合并再次进行柱层析洗脱得到二次纯化洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层 析， 将相同硅胶薄层层析结果的

4、洗脱液合并后除去溶剂并通过重结晶溶剂进行重结晶得到 麦角甾醇。 3.根据权利要求2所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述的提取溶剂为乙 醇， 所述重结晶溶剂为石油醚， 所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为13： 10 12。 4.根据权利要求3所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述的乙醇为体积分 数为90的乙醇； 所述浸提法包括以下步骤： 于12000rmin-1条件下60浸提12h。 5.根据权利要求2所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述的柱层析洗脱的 方法包括以下步骤： 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 采用溶剂

5、充分溶 解， 加入硅胶搅拌至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上； 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱得到硅胶柱； 步骤三： 上样： 将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后， 加入石英砂， 并在柱顶端塞入脱 脂棉； 步骤四： 洗脱： 采用洗脱剂进行洗脱， 收集洗脱液， 所述洗脱剂分别包括石油醚、 乙酸乙 酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂。 6.根据权利要求5所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述步骤一中的溶剂 为石油醚， 加入的所述硅胶与所述浸膏等体积； 湿法装柱包括以下步骤： 称取硅胶悬于石油 醚中， 不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液， 将悬液匀速倒入底部塞有棉花的层析柱中

6、， 打开 底阀使液体流出。 7.根据权利要求5所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述混合溶剂分别包 括石油醚、 乙酸乙酯和甲醇按体积比依次为9:1:0、 7:2:1、 6:3:1、 5:4:1、 4:4:2、 3:6:1、 2:7: 1、 0:9:1、 0:7:3、 0:5:5、 0:3:7、 0:1:9的混合溶剂； 每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。 8.根据权利要求7所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述洗脱剂为石油 醚、 乙酸乙酯和甲醇的体积比为9:1:0的混合溶液。 9.根据权利要求2所述的一种麦角甾醇的制备方法， 其特征在于， 所述的硅胶薄层层析 中的展开剂为体积

7、比为120.5： 1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。 10.一种麦角甾醇的用途， 其特征在于， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药 物中使用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105884850 A 2 一种麦角甾醇的制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及甾醇类化合物提取技术领域， 具体涉及一种麦角甾醇的制备方法和用 途。 背景技术 0002 “麦角甾醇” 又称 “麦角固醇” ， 是甾类化合物之一。 该化合物可用于生化研究， 部分 作用同维生素D2。 麦角固醇是微生物细胞膜的重要组成部份， 对确保细胞膜的完整性， 膜结 合酶的活性， 膜的流动性， 细胞活力以及细胞物质运输等起着重

8、要作用。 生产激素类药物的 中间体， 可用来生产可的松。 有维生素D2的作用。 麦角甾醇具有重要的生理作用， 是食品、 饲 料及医药工业原料。 0003 麦角甾醇工业化生产， 有两个途径微生物生物合成与化学合成。 因甾体化合物分 子含有不对称中心， 合成步骤多， 难度大， 国内外广泛开展微生物发酵合成麦角甾醇的研 究。 目前麦角甾醇生物合成途径的研究取得了很大的进展， 这将为通过基因工程手段获得 高产麦角甾醇菌株和抗真菌药物设计提供理论指导。 例如申请号为CN200410040905.8的发 明专利公开了一种麦角甾醇的制备方法， 将酵母与碱， 氯化钠溶液混合后进行皂化再用甲 苯抽提， 经水洗、

9、 浓缩和精制真空干燥得麦角甾醇成品。 该发明利用常用的上述化工原辅料 和一般化工设备， 实现了麦角甾醇的工业化生产， 生产过程非常简便， 生产成本低， 为大批 量生产维生素D2提供了原料保障。 但该发明的制备方法中需要的反应条件仍不够温和， 且 需要的制备时间长， 选择的菌株在制备麦角甾醇时产量仍不够高。 0004 由此可见， 能否针对上述不足， 提供一种麦角甾醇的制备方法和用途， 使其方法简 单， 易实现， 且原料易得成本低， 实现麦角甾醇的批量生产， 成为本领域技术人员亟待解决 的技术难题。 发明内容 0005 本发明为了解决上述技术问题， 提供一种麦角甾醇的制备方法和用途， 其包括以 下

10、技术方案： 0006 一种麦角甾醇的制备方法， 包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的步骤。 0007 首次提供了以红曲霉为原料制备麦角甾醇的方法， 使其区别于现有技术中的制备 方法， 并且具有制备步骤简单， 有效实现麦角甾醇的批量生产。 0008 进一步的， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入提取溶剂， 采用浸提法 提取得到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱 液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进行柱层析洗脱得到二 次纯化洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗 脱液合并后除去溶剂并

11、通过重结晶溶剂进行重结晶得到麦角甾醇。 0009 浸渍法适用于粘性药材、 无组织结构的药材、 新鲜及易于膨胀的药材、 价格低廉的 芳香性药材的浸提。 而浸渍法中的热浸渍法指将中草药溶解于溶剂中， 有效作用成分通过 说明书 1/10 页 3 CN 105884850 A 3 水浴或蒸汽加热达4060提取出来。 0010 进一步的， 所述的提取溶剂为乙醇， 所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体 积比为13： 1012； 所述浸提法包括以下步骤： 于12000rmin-1条件下60浸提12h。 0011 进一步的， 所述的乙醇为体积分数为90的乙醇。 0012 进一步的， 所述的柱层析洗脱的方法包

12、括以下步骤： 0013 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 采用溶剂充分 溶解， 加入硅胶搅拌至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上； 0014 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱得到硅胶柱； 0015 步骤三： 上样： 将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后， 加入石英砂， 并在柱顶端塞 入脱脂棉； 0016 步骤四： 洗脱： 采用洗脱剂进行洗脱， 收集洗脱液， 所述洗脱剂分别包括石油醚、 乙 酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂。 0017 本发明通过柱层析洗脱及的筛选实验， 得到在粗提品中， 石油醚极性较小， 乙酸乙 酯居中， 甲醇极性较大， 故选用

13、石油醚-乙酸乙酯-甲醇洗脱。 0018 进一步的， 所述步骤一中的溶剂为石油醚， 加入的所述硅胶与所述浸膏等体积； 湿 法装柱包括以下步骤： 称取硅胶悬于石油醚中， 不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液， 将悬液 匀速倒入底部塞有棉花的层析柱中， 打开底阀使液体流出。 0019 进一步的， 所述混合溶剂分别包括石油醚、 乙酸乙酯和甲醇按体积比依次为1:0: 0、 9:1:0、 7:2:1、 6:3:1、 5:4:1、 4:4:2、 3:6:1、 2:7:1、 0:9:1、 0:7:3、 0:5:5、 0:3:7、 0:1:9、 0: 0:1的混合溶剂； 所述每个比例的洗脱剂冲洗5个柱体积。 0020

14、 其中， 柱体积(拌样硅胶+空白硅胶)7/3。 0021 进一步的， 所述洗脱剂为石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的体积比为9:1:0的混合溶液。 0022 采用上述体积比的洗脱剂进行柱层析洗脱时， 能够有效分离纯化出麦角甾醇。 0023 进一步的， 所述的硅胶薄层层析中的展开剂为体积比为120.5： 1的石油醚和乙 酸乙酯的混合溶剂。 0024 当所述展开剂为体积比为120.5： 1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂时， 层析效 果好， 结果清晰， 能够得到各组分带。 0025 一种麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。 0026 氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢

15、过程中起着重要的作用， 正常 情况下两者处于协调与动态平衡状态， 维持着体内许多生理生化反应和免疫反应。 一旦这 种协调与动态平衡产生紊乱与失调， 就会引起一系列的新陈代谢失常和免疫功能降低， 形 成氧自由基连锁反应， 损害生物膜及其功能， 以致形成细胞透明性病变、 纤维化， 大面积细 胞损伤造成进神经、 组织、 器官等损伤。 这种反应就叫脂质过氧化。 0027 脂质过氧化过程中发生的ROS氧化生物膜的过程， 即ROS与生物膜的磷脂、 酶和膜 受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧 化产物(LipidPerOxide,LPO)如丙二醛(Malonaldeh

16、yde,MDA)和4-羟基壬烯酸(4- hydroxynonenal,HNE)， 从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变， 终导致细胞结构和功能 的改变。 0028 本发明所制备的麦角甾醇经过进一步抗脂质过氧化活性检测， 证明麦角甾醇能够 说明书 2/10 页 4 CN 105884850 A 4 在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。 0029 采用上述技术方案， 包括以下有益效果： 本发明首次提出了以红曲霉为原料制备 具有抗脂质过氧化作用的物质， 首次提供了以红曲霉为原料制备麦角甾醇， 本发明先将红 曲霉洋品粗提品进行萃取， 进一步根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选最佳的柱 层析洗脱剂，

17、 使其有效分离纯化出麦角甾醇。 本发明的制备方法简单、 易实现、 耗时短， 且原 料易得成本低， 实现麦角甾醇的批量生产。 附图说明 0030 图1为本发明不同浓度乙醇提取物脂质过氧化抑制率数据图； 0031 图2为本发明萃取的各部分抗脂质过氧化活性数据图； 0032 图3为本发明组分一、 组分二、 组分三薄层层析结果图； 0033 图4为本发明组分三、 组分四、 组分五薄层层析结果图； 0034 图5为本发明柱层析得到的各组分的抗脂质过氧化活性数据图； 0035 图6为本发明分离得到的化合物薄层分析图； 0036 图7为本发明化合物H-1的MS图谱； 0037 图8为本发明化合物H-1的1H

18、-NMR图谱； 0038 图9为本发明化合物H-1的13C-NMR图谱； 0039 图10为本发明化合物H-1的13C-NMR图谱的局部放大图。 具体实施方式 0040 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。 0041 实施例一： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的 步骤。 0042 实施例二： 一种麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药 物中使用。 0043 实施例三： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入提取溶剂， 采用浸提法提取得到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗 脱液， 对所述

19、一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并 再次进行柱层析洗脱得到二次纯化洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将 相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并后除去溶剂并通过重结晶溶剂进行重结晶得到麦角 甾醇。 0044 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0045 实施例四： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入10倍体积的乙醇溶剂， 于12000rmin-1条件下60浸提12h， 提取得到粗提品， 然后采 用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，

20、 将 相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进行柱层析洗脱得到二次纯化洗脱液， 对所述二 次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并后除去溶剂并通 过石油醚进行重结晶得到麦角甾醇。 说明书 3/10 页 5 CN 105884850 A 5 0046 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0047 实施例五： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入乙醇溶剂， 所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为3： 10； 于12000rmin-1 条件下60浸提12h， 提取得到粗提品， 然后采用柱层析

21、洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进 行柱层析洗脱得到二次纯化洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅 胶薄层层析结果的洗脱液合并后除去溶剂并通过石油醚进行重结晶得到麦角甾醇。 0048 所述的柱层析洗脱的方法包括以下步骤： 0049 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 采用溶剂充分 溶解， 加入硅胶搅拌至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上； 0050 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱得到硅胶柱； 0051 步骤三： 上样： 将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后， 加入石英砂，

22、并在柱顶端塞 入脱脂棉； 0052 步骤四： 洗脱： 采用洗脱剂进行洗脱， 收集洗脱液， 所述洗脱剂分别包括石油醚、 乙 酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂。 0053 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0054 实施例六： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入乙醇溶剂， 所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为1： 12， 于12000rmin-1 条件下60浸提12h， 提取得到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅

23、胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进 行柱层析洗脱得到二次纯化洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅 胶薄层层析结果的洗脱液合并后除去溶剂并通过石油醚进行重结晶得到麦角甾醇。 0055 所述的柱层析洗脱的方法包括以下步骤： 0056 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 用石油醚充分 溶解， 置于平皿内， 加入等体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发， 物质均匀吸附在硅胶上， 硅胶颗 粒松散不黏着； 0057 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱， 称取300g硅胶装柱， 所述硅胶的体积一柱的体积比 为1： 20， 悬于1000ml石油醚， 不断搅拌溶胀去除气泡后，

24、将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中， 打开底阀使液体流出， 吸附剂均匀下降， 并适当振动， 利于排气， 避免分层； 0058 步骤三： 上样： 将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中， 使其均匀平整地铺 在柱上， 后加入石英砂， 并在在柱顶端塞入脱脂棉， 以防止溶剂的加入对于样品的冲击； 0059 步骤四： 洗脱： 以石油醚、 乙酸乙酯和甲醇混合溶剂作为洗脱剂按极性由小至大进 行洗脱， 收集洗脱液。 0060 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0061 实施例七： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入

25、10倍体积的体积分数为90的乙醇溶剂， 于12000rmin-1条件下60浸提12h， 提取得 说明书 4/10 页 6 CN 105884850 A 6 到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行 硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进行柱层析洗脱得到二次纯化 洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合 并后除去溶剂并通过石油醚进行重结晶得到麦角甾醇。 0062 所述的柱层析洗脱的方法包括以下步骤： 0063 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 用石油醚充分 溶解，

26、 置于平皿内， 加入等体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发， 物质均匀吸附在硅胶上， 硅胶颗 粒松散不黏着； 0064 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱， 称取300g硅胶装柱， 所述硅胶的体积一柱的体积比 为3： 10， 悬于1000ml石油醚， 不断搅拌溶胀去除气泡后， 将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中， 打开底阀使液体流出， 吸附剂均匀下降， 并适当振动， 利于排气， 避免分层； 0065 步骤三： 上样： 将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中， 使其均匀平整地铺 在柱上， 后加入石英砂， 并在在柱顶端塞入脱脂棉， 以防止溶剂的加入对于样品的冲击； 0066 步骤四： 洗脱： 以石油

27、醚、 乙酸乙酯和甲醇混合溶剂作为洗脱剂按极性由小至大进 行洗脱， 收集洗脱液。 所述洗脱剂包括石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的体积比为9:1:0的混合溶 剂； 所述每个比例的洗脱剂冲洗5个柱体积。 0067 所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤： 0068 步骤一： 点样： 将层析板水平放置， 用内径小于1mm， 管口平整的洁净毛细管将收集 的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上， 样品间距离大于5mm。 0069 步骤二： 饱和： 将预先配好的展开剂适量倒入层析缸， 盖严后静置5-10min， 使层析 缸中溶剂挥发气体饱和均匀。 0070 步骤三： 展开： 将点好样的层析板放入层析缸中展开，

28、使展开剂浸没薄板下端， 但 未达到点样线， 密闭层析缸进行展开， 当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿， 距顶端5 10mm时， 取出层析板， 用铅笔标记溶剂前沿位置。 0071 步骤四： 观察、 显色、 定性： 层析板上溶剂挥干后进行观察， GF254硅胶板可置于紫 外分析仪下直接观察； 有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点， 即均匀喷洒10硫酸乙醇溶 液， 用高温枪烘烤至显色， 标记点的位置， 测量， 计算比移值(Rf值)。 0072 步骤五： 展开剂的选择： 配制不同极性的展开剂， 分别对样品进行薄层层析， 经过 观察和计算Rf值后， 选择展开后组分斑点圆且集中， 不同组分斑点明显分开， Rf

29、值范围为 0.2-0.8的展开剂为最佳。 最终得到体积比为12： l的石油醚和乙酸乙酯、 体积比为1： 2的石 油醚和乙酸乙酯， 经硅胶板薄层层析分析， 10硫酸乙醇显色观察。 0073 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0074 实施例八： 一种麦角甾醇的制备方法， 包括以下步骤： 取干燥的红曲霉发酵样品， 加入10倍体积的体积分数为90的乙醇溶剂， 于12000rmin-1条件下60浸提12h， 提取得 到粗提品， 然后采用柱层析洗脱粗提品得到一次纯化洗脱液， 对所述一次纯化洗脱液进行 硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进行

30、柱层析洗脱得到二次纯化 洗脱液， 对所述二次纯化洗脱液进行硅胶薄层层析， 将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合 并后除去溶剂并通过石油醚进行重结晶得到麦角甾醇。 说明书 5/10 页 7 CN 105884850 A 7 0075 所述的柱层析洗脱的方法包括以下步骤： 0076 步骤一： 拌样： 将所述粗提品或一次纯化洗脱液浓缩后得到的浸膏， 用石油醚充分 溶解， 置于平皿内， 加入等体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发， 物质均匀吸附在硅胶上， 硅胶颗 粒松散不黏着； 0077 步骤二： 装柱： 采用湿法装柱， 称取300g硅胶装柱， 所述硅胶的体积一柱的体积比 为1： 20， 悬于1000ml石油醚，

31、不断搅拌溶胀去除气泡后， 将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中， 打开底阀使液体流出， 吸附剂均匀下降， 并适当振动， 利于排气， 避免分层； 0078 步骤三： 上样： 将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中， 使其均匀平整地铺 在柱上， 后加入石英砂， 并在在柱顶端塞入脱脂棉， 以防止溶剂的加入对于样品的冲击； 0079 步骤四： 洗脱： 以石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱， 收集 洗脱液。 所述混合溶剂包括石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的体积比依次为1:0:0、 9:1:0、 7:2:1、 6:3:1、 5:4:1、 4:4:2、 3:6:1、 2:7:1、 0:

32、9:1、 0:7:3、 0:5:5、 0:3:7、 0:1:9、 0:0:1的混合溶剂； 所述每个比例的洗脱剂冲洗5个柱体积。 0080 所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤： 0081 步骤一： 点样： 将层析板水平放置， 用内径小于1mm， 管口平整的洁净毛细管将收集 的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上， 样品间距离大于5mm。 0082 步骤二： 饱和： 将预先配好的展开剂适量倒入层析缸， 盖严后静置5-10min， 使层析 缸中溶剂挥发气体饱和均匀。 0083 步骤三： 展开： 将点好样的层析板放入层析缸中展开， 使展开剂浸没薄板下端， 但 未达到点样线， 密闭层析缸进行展开，

33、 当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿， 距顶端5 10mm时， 取出层析板， 用铅笔标记溶剂前沿位置。 0084 步骤四： 观察、 显色、 定性： 层析板上溶剂挥干后进行观察， GF254硅胶板可置于紫 外分析仪下直接观察； 有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点， 即均匀喷洒10硫酸乙醇溶 液， 用高温枪烘烤至显色， 标记点的位置， 测量， 计算比移值(Rf值)。 0085 步骤五： 展开剂的选择： 配制不同极性的展开剂， 分别对样品进行薄层层析， 经过 观察和计算Rf值后， 选择展开后组分斑点圆且集中， 不同组分斑点明显分开， Rf值范围为 0.2-0.8的展开剂为最佳。 最终得到体积比为12：

34、 l的石油醚和乙酸乙酯、 体积比为1： 2的石 油醚和乙酸乙酯， 经硅胶板薄层层析分析， 10硫酸乙醇显色观察。 0086 一种上述麦角甾醇的用途， 所述的麦角甾醇在制备抗脂质过氧化活性的药物中使 用。 0087 不同溶剂的脂质过氧化抑制率检测： 0088 一、 实验方法： 0089 1、 粗提品的萃取： 0090 (1)乙酸乙酯萃取醇提物 0091 分别取定量未干燥的红曲霉样品， 加入10倍体积的90乙醇， 60浸提12h， 12000rmin-1， 离心15min， 取上清液200ml置于500mL分液漏斗中， 加入200mL乙酸乙酯， 充 分振摇萃取， 静置， 待溶液完全分层后， 放出上

35、层的萃取液， 下层的浸提液用同法再萃取2 次， 每次加萃取剂200mL， 3次萃取剂合并， 在低于60下减压回收萃取剂， 旋干后， 使溶剂自 然挥干， 得到醇提乙酸乙酯萃取物。 下层的浸提液在低于60下减压回收， 旋干后， 使溶剂 说明书 6/10 页 8 CN 105884850 A 8 自然挥干， 得到乙酸乙酯萃取后剩余的水层。 0092 (2)石油醚进一步萃取乙酸乙酯萃取物 0093 分别取定量未干燥的红曲霉样品， 分别加10倍体积90乙醇， 60浸提12h， 12000rmin-1， 离心15min， 取上清液200ml置于500mL分液漏斗中， 分别加入200mL乙酸乙 酯， 充分振

36、摇萃取， 静置， 待溶液完全分层后， 放出上层的萃取液， 下层的浸提液用同法再萃 取2次， 每次加萃取剂200mL， 3次萃取剂合并， 在低于60下减压回收萃取剂， 再加水充分溶 解定容至200ml。 0094 将用水充分溶解定容的乙酸乙酯萃取物置于500mL分液漏斗中， 分别加入200mL石 油醚， 充分振摇萃取， 静置， 待溶液完全分层后， 放出上层的萃取液， 下层的浸提液用同法再 萃取2次， 每次加萃取剂200mL， 3次萃取剂合并， 在低于60下减压回收萃取剂， 旋干后， 得 到石油醚萃取物。 下层的浸提液在低于60下减压， 旋干后， 得到石油醚萃取后剩余的乙酸 乙酯层。 0095 2

37、、 萃取物的抗脂质过氧化待测样品的制备： 称取0.4mg各部分萃取样品， 用蒸馏水 溶解、 定容至100mL， 此溶液质量浓度为8mg/mL。 吸取8mg/mL溶液25、 12.5、 6.25、 3.13、 1.56、 0.78、 0.39mL， 分别加入蒸馏水定容至25mL， 样品的浓度分别为0.5、 1、 2、 4、 8mg/mL。 0096 3、 脂质过氧化抑制实验： 使用鸡蛋黄匀浆液(10， 体积分数)作为反应的脂质媒 介。 取0.1mL上述制备的待测样品同0.5mL蛋黄匀浆液、 0.4mL纯水及50 L硫酸亚铁溶液 (FeSO47H2O， 70mmol/L)混合， 37孵育30min

38、， 迅速加入1.5mL乙酸溶液(20， 体积分数， pH值3.5)及1.5mL硫代巴比妥酸溶液(0.8， 质量浓度， 用1.1十二烷基硫酸钠溶液配 制)， 高速混匀后95水浴60min。 待反应混合物冷却至室温， 加入5mL正丁醇， 摇匀， 混合物 5000r/min离心15min， 取上清液测定其在532nm处的吸光度， 纯水做空白对照。 0097 计算方法如下式： 0098 脂质过氧化抑制率()(1-实验组吸光度/空白组吸光度)100 0099 二、 实验结果： 0100 1、 检测结果见图1， 结果表明水提物抗脂质过氧化活性最高， 其次为30乙醇提取 物， 随着乙醇浓度的增加， 提取物脂

39、质过氧化抑制率逐渐降低， 30乙醇提取物、 70乙醇 提取物、 90乙醇提取物与水提物抑制率差异具极显著性(p0.01)， 水提物与50醇提物 相比差异具显著性(p0.05)， 而水和90乙醇浓度 相差较大， 提取出的活性物质组成相差也较大。 因此将水和乙醇作为提取剂进行提取所得 到的产物， 均具有抗脂质过氧化的功能。 0101 2、 醇提取的粗提品的萃取： 0102 (1)乙酸乙酯萃取醇提物 0103 红曲霉样品的醇提物经乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物标记为()。 下层得到 乙酸乙酯萃取后剩余的水层标记为()。 如图2所示， 每组柱状部分， 从左至右浓度依次为 8mg/ml、 4mg/ml、

40、 2mg/ml、 1mg/ml、 0.5mg/ml， 从图2中看出， 部分()在浓度为8mg/ml时的脂 质过氧化抑制率达到了96.05， 而部分()几乎无抗脂质过氧化活性。 说明醇提出的活性 物质与乙酸乙酯互溶性较好， 且提取出的活性物质大部分为中等极性的物质。 0104 (2)石油醚萃取乙酸乙酯部() 说明书 7/10 页 9 CN 105884850 A 9 0105 将乙酸乙酯部标记为()用石油醚进一步萃取后得到石油醚萃取物标记为()。 下层得到石油醚萃取后剩余的乙酸乙酯层标记为()。 从图2中看出， 部分()在浓度为 8mg/ml时的脂质过氧化抑制率为73.61， 部分()达到了91

41、.22。 部分()的脂质过氧 化抑制率大于部分()， 差异具极显著性(p0.01)。 经乙酸乙酯层经石油醚进一步萃取后， 大部分活性物质仍在乙酸乙酯层， 也有相当部分萃取到了石油醚层， 说明醇提的活性物质 主要为中等极性的物质， 也有相当一部分极性较小的活性物质。 0106 柱层析洗脱剂的选择： 0107 1、 浸膏在不同溶剂中的溶解情况： 醇提后的浸膏在不同溶剂中的溶解情况： 取少 许红曲霉样品的醇提浸膏分别经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇、 甲醇溶解， 考察浸膏在不 同溶剂中的溶解情况， 结果表明浸膏在乙酸乙酯中的溶解性较好。 0108 2、 样品在TLC展开剂中分离情况： 根据浸膏

42、在不同溶剂中溶解度的考察以及极性 分布情况的考察， 0109 选取不同极性配比的石油醚、 乙酸乙酯和甲醇分别对水提和醇提浸膏进行薄层层 析， 经过多次薄层层析结果分析后， 在不同配比的展开剂比例下， 水提样品和醇提样品的薄 层层析， 表明水提和醇提样品中的物质非常复杂， 不同极性段均有物质。 但在水提和醇提样 品在同一极性条件(石油醚： 乙酸乙酯20： 1)， 比移值范围不同。 0110 3、 柱层析洗脱剂的确定： 红曲霉样品粗提品成分较复杂， 在对其抗脂质过氧化活 性物质进行分离纯化时， 要尽量得到单一组分， 为避免活性物质交叉洗脱下来， 所以采用极 性梯度洗脱。 根据上述抗脂质过氧化活性物

43、质的极性分布情况， 综合考虑样品在溶剂中溶 解度， 样品在TLC展开剂中分离情况， 溶剂的极性等选定洗脱剂。 在水提粗提品中， 甲醇极性 较大， 故采用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。 在醇提粗提品中， 石油醚极性较小， 乙酸乙酯居中， 甲醇极性较大， 故选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。 0111 粗提品首次柱层析纯化结果： 0112 醇提粗提品经硅胶柱层析， 将相同薄层层析洗脱部分合并， 得到组分一、 组分二、 组分三、 组分四、 组分五， 组分一和组分二选用石油醚-乙酸乙酯(12： l)作为展开剂， 组分 三、 组分四和组分五选用石油醚-乙酸乙酯(1： 2)作为展开剂， 经硅胶板薄层层析分析，

44、 10 硫酸乙醇显色观察， 得到各组分带， 结果见图3和图4。 0113 柱层析得到的各组分抗脂质过氧化活性： 0114 柱层析得到的各组分的脂质过氧化抑制率如下图5， 其中， 组分二和组分五无抗脂 质过氧化活性。 图5中每组柱状数据由左至右抗组份二的浓度依次上升， VC组中的柱状数据 从左至右的浓度依次为25 g/ml、 50 g/ml、 100 g/ml， 组分一和组分四组中的柱状数据从左 至右组分一和组分四的浓度依次为12.5 g/ml、 25 g/ml、 50 g/ml、 100 g/ml， 组分三中的柱 状数据从左至右组分散的浓度依次为6.25 g/ml、 12.5 g/ml、 25

45、 g/ml、 50 g/ml、 100 g/ml， 结果表明， 各组分的抗脂质过氧化效果随着各组分浓度的增加而上升， 其中组分三的抗脂 质过氧化效果最强， 在浓度达到100 g/ml时， 脂质过氧化抑制率可达90.54， 其次为组分 一， 最高可达66.32。 这说明药性菌质的抗脂质过氧化活性物质大部分属于中等极性的物 质。 0115 醇提物过柱组分的二次柱层析纯化结果： 0116 将组分一、 组分三、 组分四经二次柱层析纯化后， 组分一析出了白色晶体， 其余组 说明书 8/10 页 10 CN 105884850 A 10 分均未得到纯的化合物。 而组分二呈现的是黄色， 故它里面很可能除白色

46、晶体外， 主要成分 为黄色的部分。 组分一经硅胶柱层析， 将相同薄层层析洗脱部分合并到青霉素瓶内， 待溶剂 渐渐挥干至剩下一点时， 有一瓶内析出白色针状晶体， 将此瓶内物质， 通过石油醚进行重结 晶， 得到化合物H-1， 薄层层析结果见图6。 0117 结果表明， 从组分一90中分离得到的纯化合物的薄层层析来看， 其极性非常小， 从形态来看， 其呈白色针状晶体， 密度极轻。 洗脱处组分一的洗脱剂包括石油醚、 乙酸乙酯 和甲醇的体积比为9:1:0的混合溶液。 0118 化合物H-1结构鉴定： 0119 1、 实验材料、 仪器与试剂 0120 材料:药性菌质中分离得到的一个化合物。 0121 试剂

47、： 甲醇为色谱纯溶剂(天津登科化学试剂有限公司) 0122 仪器： 气相色谱质谱联用仪(HP-5973美国惠普公司)、 液相色谱质谱联用仪(HP- 1100MSD美国惠普公司)、 核磁共振波谱仪(INOVA400MHzVarian公司)。 0123 2、 实验方法： 0124 化合物H-1的MS分析： 将化合物溶于石油醚溶液,进行EI-MS分析。 0125 化合物H-1的H-NMR和13C-NMR分析： 将化合物溶于CD3Cl溶液,进行H-NMR和13C-NMR 谱分析。 0126 3、 结果与分析： 0127 化合物H-1的MS分析： 0128 将化合物H-1溶于石油醚溶液进行MS谱分析，

48、得到的谱图如图7。 EI-MSm/z:396(M +),363(M+-H2O-CH3),337(M+-H2O-CH3-C2H2),271(M+-C9H17),253(M+-C9H17-H20)。 0129 化合物的NMR分析： 0130 溶于CD3Cl溶液,进行H-NMR和13C-NMR谱分析,得到的谱图如图810所示。 0131 1H-NMR(500MzCDCl) :0.63(3H,s),0.83(3H,d ,J6.0Hz),0.84(3H,d ,J 6.8Hz),0.93(3H,d,J6.8Hz),0.94(3H,s),1.03(3H,d,J6.5Hz),3.64(1H,m),5.19(1

49、H, dd,J15.5Hz,6.8HZ),5.22(1H,dd,J15.5Hz,7.0Hz),5.39(1H,d,J6.OHz),5.57(1H, d,J6.2Hz)。 由1H-MR数据可知,化合物结构中有6个甲基,是甾醇类物质的特征信号 0132 13C-NMR(400MHz,CD3Cl) :12.01(C18),16.24(C19),17.57(C28),19.93(C26),19.93 (C27),21.06(Cll),21.06(C11),22.95(C15),28.27(C16),31.93(C2),33.04(C25),36.98(C1O), 38.32(C1),39.02(C12),40.42(C2O),40.73(C4),42.77(C13),42.77(C24),46.18(C9),54.51 (C14),55.65(C17),70.43(C3),116.23(C7),119.54(C6),131.92(C23),135.53(C22),139.74 (C5),141.35(C8)。 依据波谱分析结果,比对文献报道(王剑平， 2010),鉴定化合物为麦角固 醇,分子式为C28H440,分子量为396.34。 0133 麦角甾醇的抗脂质过氧化活性检测： 0134 实验方法： 将分别取得的白色晶体和黄色晶体，