预防和治疗辐射损伤的蛋白CAA及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610196102.4 (22)申请日 2016.03.31 (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院生 物工程研究所 地址 100071 北京市丰台区东大街20号军 事医学科学院生物工程研究所中楼 206室 (72)发明人 赵志虎叶丙雨王洋沈文龙 师明磊张彦何彰华王政 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅何叶喧 (51)Int.Cl. C07K 14/255(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12P

2、21/02(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 39/00(2006.01) (54)发明名称 预防和治疗辐射损伤的蛋白CAA 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种预防和治疗辐射损伤的 蛋白CAA 及其应用。 本发明提供了一种环化蛋白 (命名为蛋白CAA )， 是如下(a1)或(a2)或(a3)或 (a4)： (a1)序列7自N末端第11至305位氨基酸残 基组成的环化蛋白； (a2)序列7自N末端第3至311 位氨基酸残基组成的环化蛋白； (a3)序列7所示 的环化蛋白； (a4)将(a1)或(a2)或(a3)经过一个 或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/

3、或添加 且具有预防和/或治疗辐射损伤功能的环化蛋 白。 本发明还保护蛋白CAA 在制备产品中的应 用； 产品的功能为(f1)和/或(f2)： (f1)预防和/ 或治疗辐射损伤； (f2)活化NF- B信号通路。 本发 明对于辐射损伤的预防和/或治疗具有重大的应 用前景和推广价值。 权利要求书2页 说明书9页 序列表12页 附图3页 CN 105820218 A 2016.08.03 CN 105820218 A 1.一种环化蛋白， 是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)： (a1)序列表中序列7自N末端第11至305位氨基酸残基组成的环化蛋白； (a2)序列表中序列7自N末端第3至311

4、位氨基酸残基组成的环化蛋白； (a3)序列表中序列7所示的环化蛋白； (a4)将(a1)或(a2)或(a3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有预防和/或治疗辐射损伤功能的环化蛋白。 2.编码权利要求1所述环化蛋白的基因。 3.如权利要求2所述的基因， 其特征在于： 所述基因是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或 (b5)： (b1)序列表中序列8自5 末端第31-915位核苷酸所示的DNA分子； (b2)序列表中序列8自5 末端第7-933位核苷酸所示的DNA分子； (b3)序列表中序列8所示的DNA分子； (b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定

5、的DNA序列杂交且编码所述环化蛋白的 DNA分子； (b5)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码编码所述环 化蛋白的DNA分子。 4.一种蛋白， 依次包括如下元件： 内含肽-C片段、 环化蛋白片段、 内含肽-N片段； 所述内含肽-C片段是如下(c1)或(c2)： (c1)序列表中序列3自N末端第3至40位氨基酸残基组成的多肽片段； (c2)将(c1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能 的多肽片段； 所述内含肽-N片段是如下(c3)或(c4)： (c3)序列表中序列3自N末端第354至476位氨基酸残基组成的多肽片段； (c4)

6、将(c3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能 的多肽片段； 所述环化蛋白片段是如下(c5)或(c6)或(c7)或(c8)： (c5)序列表中序列3自N末端第51至345位氨基酸残基组成的多肽片段； (c6)序列表中序列3自N末端第43至351位氨基酸残基组成的多肽片段； (c7)序列表中序列3自N末端第41至353位氨基酸残基组成的多肽片段； (c8)将(c5)或(c6)或(c7)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同功能的多肽片段。 5.编码权利要求4所述蛋白的基因。 6.含有权利要求2或3或5所述基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系

7、或重组菌。 7.如权利要求6所述的重组载体， 其特征在于： 所述重组载体是在表达载体中插入外源 DNA分子形成的具有序列表的序列4所示的DNA分子的重组质粒。 8.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法， 包括如下步骤： 培养重组菌， 得到权利要求1 所述蛋白质； 所述重组菌是在宿主菌中导入权利要求7所述重组载体得到的重组菌。 9.权利要求1所述蛋白质在制备产品中的应用； 所述产品的功能为(f1)和/或(f2)： (f1)预防和/或治疗辐射损伤； 权利要求书 1/2 页 2 CN 105820218 A 2 (f2)活化NF- B信号通路。 10.一种产品， 它的活性成分为权利要求1所述蛋白质；

8、所述产品的功能为(f1)和/或 (f2)： (f1)预防和/或治疗辐射损伤； (f2)活化NF- B信号通路。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105820218 A 3 预防和治疗辐射损伤的蛋白CAA 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种预防和治疗辐射损伤的蛋白CAA 及其应用。 背景技术 0002 大剂量致电离辐射所引发的短期致死效应主要是由于辐射敏感系统如造血系统、 胃肠道系统的大量细胞凋亡所导致的急性辐射并发症ARS(AcuteRadiationSyndrome)的 出现， 而NF- B信号通路的活化可以有效抑制细胞凋亡的进行。 因此直接针对辐射损伤机制 研发高效、 无毒新型

9、辐射防护性药物， 可能是一条新的有效途径。 0003 对辐射极端敏感的小肠内皮细胞表达Toll样的受体5(即TLR5)与细菌鞭毛蛋白结 合， 可以有效活化NF- B信号通路。 沙门氏菌鞭毛蛋白作为目前已知唯一可以与TLR5结合的 特异性激动剂， 在保护小鼠和灵长类动物应对急性辐射中发挥卓越的功效， 但是由于鞭毛 蛋白来源于细菌， 其免疫原性及毒性也很强， 鉴于此相关研究人员对来源于鼠伤寒沙门氏 杆菌(Salmonellaenterica)的鞭毛蛋白做了更深入地研究。 沙门氏菌鞭毛蛋白(又称蛋白 AA)全长共505个氨基酸， 包括N端(1176aa)、 中间多变区(177401aa)及C端(40

10、2505)， 通过对这三个区域的分别研究发现， 当去除中间多变区后， 该鞭毛蛋白的活性及稳定性均 未降低， 更令人惊喜的是截短后其免疫原性和毒性均大大降低(机体最大忍受剂量由12mg/ kg提高到25mg/kg),该研究小组将其命名为CBLB502(也简称为蛋白AA )。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种预防和治疗辐射损伤的蛋白CAA 及其应用。 0005 本发明提供了一种环化蛋白(命名为蛋白CAA )， 是如下(a1)或(a2)或(a3)或 (a4)： 0006 (a1)序列表中序列7自N末端第11至305位氨基酸残基组成的环化蛋白； 0007 (a2)序列表中序列7自N末端第3至

11、311位氨基酸残基组成的环化蛋白； 0008 (a3)序列表中序列7所示的环化蛋白； 0009 (a4)将(a1)或(a2)或(a3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有预防和/或治疗辐射损伤功能的环化蛋白。 0010 所述蛋白CAA 具体可为以下任一所述方法制备得到的蛋白CAA 。 0011 编码所述蛋白CAA 的基因(命名为基因CAA )也属于本发明的保护范围。 0012 所述基因CAA 具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)： 0013 (b1)序列表中序列8自5 末端第31-915位核苷酸所示的DNA分子； 0014 (b2)序列表中序列8自

12、5 末端第7-933位核苷酸所示的DNA分子； 0015 (b3)序列表中序列8所示的DNA分子； 0016 (b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白CAA 的DNA分子； 0017 (b5)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码编码所 说明书 1/9 页 4 CN 105820218 A 4 述蛋白CAA 的DNA分子。 0018 含有所述基因CAA 的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。 0019 本发明还保护一种蛋白(命名为蛋白QCAA ； 蛋白QCAA 是蛋白CAA 的前体，

13、 自剪切 后形成蛋白CAA )， 依次包括如下元件： 内含肽-C片段、 环化蛋白片段、 内含肽-N片段； 0020 所述内含肽-C片段是如下(c1)或(c2)： 0021 (c1)序列表中序列3自N末端第3至40位氨基酸残基组成的多肽片段； 0022 (c2)将(c1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的多肽片段； 0023 所述内含肽-N片段是如下(c3)或(c4)： 0024 (c3)序列表中序列3自N末端第354至476位氨基酸残基组成的多肽片段； 0025 (c4)将(c3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的多肽片段；

14、0026 所述环化蛋白片段是如下(c5)或(c6)或(c7)或(c8)： 0027 (c5)序列表中序列3自N末端第51至345位氨基酸残基组成的多肽片段； 0028 (c6)序列表中序列3自N末端第43至351位氨基酸残基组成的多肽片段； 0029 (c7)序列表中序列3自N末端第41至353位氨基酸残基组成的多肽片段； 0030 (c8)将(c5)或(c6)或(c7)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的多肽片段。 0031 所述蛋白QCAA 具体如序列表的序列3所示。 0032 编码所述蛋白QCAA 的基因(命名为基因QCAA )也属于本发明的保护范围。 0

15、033 所述基因QCAA 中， 编码内含肽-C片段的DNA分子为如下(d1)或(d2)： 0034 (d1)序列表中序列4自5 末端第7至120位核苷酸所示的DNA分子； 0035 (d2)与(d1)限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码编码所述内含肽-C片 段的DNA分子。 0036 所述基因QCAA 中， 编码内含肽-N片段的DNA分子为如下(d3)或(d4)： 0037 (d3)序列表中序列4自5 末端第1060至1428位核苷酸所示的DNA分子； 0038 (d4)与(d3)限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码编码所述内含肽-N片 段的DNA分子。 0039 所述基因QC

16、AA 中， 编码环化蛋白片段的DNA分子为如下(d5)或(d6)或(d7)或 (d8)： 0040 (d5)序列表中序列4自5 末端第151至1035位核苷酸所示的DNA分子； 0041 (d6)序列表中序列4自5 末端第127至1053位核苷酸所示的DNA分子； 0042 (d7)序列表中序列4自5 末端第121至1059位核苷酸所示的DNA分子； 0043 (d8)与(d5)或(d6)或(d7)限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码编码所 述环化蛋白片段的DNA分子。 0044 所述基因QCAA 具体如序列表的序列4所示。 0045 含有所述基因QCAA 的重组载体、 表达盒、 转基

17、因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。 含有所述基因QCAA 的重组载体可为在表达载体中插入外源DNA分子形成的具有 说明书 2/9 页 5 CN 105820218 A 5 序列表的序列4所示的DNA分子的重组质粒。 所述表达载体具体可为载体pET-28a(+)。 含有 所述基因QCAA 的重组载体具体可为： 在载体pET-28a(+)的NcoI和HindIII酶切位点之间 插入了序列表的序列4自5 末端第5至1434位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。 所述重组菌具体可为将所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。 所述宿主菌具体可为大肠 杆菌BL21(DE3)pLysS。 0046

18、 本发明还保护一种制备所述蛋白CAA 的方法， 包括如下步骤： 培养以上任一所述 重组菌， 得到所述蛋白CAA 。 0047 所述方法具体包括如下步骤： 将重组菌培养至OD600nm0.5， 然后加入IPTG进行诱 导， 然后收集菌体沉淀并进行超声破碎， 收集沉淀。 0048 所述方法具体包括如下步骤： 0049 (1)将重组菌接种至LB培养基， 37、 220rpm振荡培养至OD600nm0.5， 加入IPTG(使 其在培养体系中的浓度为0.5mmol/L)， 然后30、 200rpm振荡培养4小时； 0050 (2)取完成步骤(1)的培养体系， 4、 12000rpm离心5分钟， 收集菌体

19、沉淀； 0051 (3)将菌体沉淀进行超声破碎(超声频率30； 超声5秒， 停5秒， 共50分钟)， 然后4 、 12000rpm离心20分钟， 收集沉淀。 0052 所述方法还包括如下步骤(4)： 将步骤(3)得到的沉淀用2M尿素水溶液洗涤， 然后 加入2M尿素水溶液并室温放置30分钟， 然后12000rpm离心30分钟， 收集上清液并进行阴离 子交换层析。 阴离子交换层析的具体参数： 层析柱为GEHiTrapQFF1ml(GE公司， 货号： 17-5053-01)； 柱直径/柱高： 7mm/25mm； A液： pH7.5、 50mM的Tris-HCl缓冲液； B液： 含1MNaCl 的pH

20、7.5、 50mM的Tris-HCl缓冲液。 上样后， 先用10倍柱体积A液进行洗脱； 然后进行10个柱 体积的梯度洗脱， 梯度洗脱的过程中， A液在洗脱液中的体积比由100线性下降到0， 相 应的B液在洗脱液中的体积由0线性上升到100， 流速为1ml/min， 共洗脱10分钟， 收集本 洗脱过程中第3-5毫升的过柱后溶液。 0053 所述方法还包括如下步骤(5)： 将步骤(4)得到的过柱后溶液进行Ni柱亲和层析。 Ni柱亲和层析的具体参数： 层析柱为GEHisTrapFF5ml(GE公司， 货号17-5319-01)； 结合 缓冲液： 含0.5MNaCl、 20mM咪唑的pH7.4、 20

21、mM的磷酸盐缓冲液； 洗脱缓冲液： 含0.5MNaCl、 500mM咪唑的pH7.4、 20mM的磷酸盐缓冲液。 上样后， 先用10倍柱体积的结合缓冲液进行洗 脱； 然后用洗脱缓冲液进行洗脱， 流速为2ml/min， 收集本步骤中第2-3个柱体积的过柱后溶 液。 0054 所述方法还包括如下步骤(6)： 将步骤(5)得到的过柱后溶液进行Strep-Tag/ 亲和层析。 Strep-Tag/亲和层析的具体参数： 层析柱为是 IBA公司的1ml,货号是2-1207-001； BufferW： 含1mMEDTA、 150mMNaCl的pH8.0、 100mM的Tris-HCl缓冲液； BufferE

22、： 含1mMEDTA、 150mMNaCl、 2.5mM 脱硫生物素的pH8.0、 100mM的Tris-HCl缓冲液。 上样后， 先用5倍柱体积的BufferW进行洗 脱； 然后用BufferE进行洗脱， 本步骤中每0.5柱体积的过柱后溶液收集一管， 收集并合并 第2至5管过柱后溶液。 0055 所述方法还包括如下步骤(7)： 将步骤(6)得到的过柱后溶液进行分子筛层析。 分 子筛层析的具体参数： 层析柱为GESuperdex75prepgrade25ml(GE公司， 货号： 17-1044- 10)。 上样后， 采用含0.5MNaCl的pH7.4、 0.02M的PBS缓冲液进行洗脱， 流速

23、为0.35ml/min, 说明书 3/9 页 6 CN 105820218 A 6 收集第1.5-2.5个柱体积的过柱后溶液(即为CAA 蛋白液)。 0056 本发明还保护所述蛋白CAA 在制备产品中的应用； 所述产品的功能为(f1)和/或 (f2)： (f1)预防和/或治疗辐射损伤； (f2)活化NF- B信号通路。 所述辐射的辐射源具体可 为60Co射线。 0057 本发明还保护一种产品， 它的活性成分为所述蛋白CAA ； 所述产品的功能为(f1) 和/或(f2)： (f1)预防和/或治疗辐射损伤； (f2)活化NF- B信号通路。 所述辐射的辐射源具 体可为60Co射线。 0058 本发

24、明对于辐射损伤的预防和/或治疗具有重大的应用前景和推广价值。 附图说明 0059 图1为采用重组质粒甲进行实施例2的步骤二过程中的SDS-PAGE图。 0060 图2为采用重组质粒乙进行实施例2的步骤二过程中的SDS-PAGE图。 0061 图3为CAA 蛋白液和Tag-AA 蛋白液的SDS-PAGE图。 0062 图4为通过双荧光素酶报告基因系统检测蛋白活性的结果。 0063 图5为照射后小鼠存活率的统计比较。 具体实施方式 0064 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明

25、， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0065 蛋白AA 如序列表的序列1所示(由296个氨基酸残基组成)， 其编码基因(基因AA ) 如序列表的序列2所示。 0066 载体pET-28a(+)： Novagen公司， 目录号： 69864-3。 大肠杆菌BL21(DE3)pLysS： 天根 生化科技(北京)有限公司， 目录号： CB106-01。 载体pSFBAD09： addgene公司， 目录号为 11963。 载体pJJDuet30： addgene公司， 目录号为11962。 载体pNF- B-Luc： 安捷伦科技

26、有限公 司， 目录号为219078。 载体pRL-SV40： 美国普洛麦格公司， 目录号为E2231。 HEK293细胞： 美国 ATCC公司， 目录号为CRL-1573。 DMEM培养基： 美国Hyclone公司， 货号SH30243.01B。 0067 实施例1、 蛋白CAA 的发现 0068 在蛋白AA 序列以及大量实验的基础上， 选择将SspDnaE内含肽与蛋白AA 进行融 合， 并在进一步进行大量实验的基础上， 设计得到蛋白QCAA 。 0069 蛋白QCAA 如序列表的序列3所示， 其编码基因(基因QCAA )如序列表的序列4所 示。 0070 蛋白QCAA 自N末端第1位氨基酸残

27、基为起始密码子编码的甲硫氨酸， 第3至40位氨 基酸残基为内含肽的C末端片段(内含肽-C片段)， 第41至第42位氨基酸残基为限制性内切 酶NdeI的识别序列编码的氨基酸残基(HM)， 第43至50位氨基酸残基为亲和纯化标签Strep- TagII(WSHPQFEK)， 第51至345位氨基酸残基为去除第一位甲硫氨酸后的蛋白AA (由295个 氨基酸残基组成)， 第346至351位氨基酸残基为His-Tag标签(HHHHHH)， 第352至353位氨基 酸残基为限制性内切酶BamHI的识别序列编码的氨基酸残基(GS)， 第354至476位氨基酸残 说明书 4/9 页 7 CN 10582021

28、8 A 7 基为内含肽的N末端片段(内含肽-N片段)。 蛋白QCAA 为前体形式， 在菌体内， 由内含肽-C片 段和内含肽-N片段介导自我剪接， 从而发生环化， 形成蛋白CAA (蛋白CAA 为环化蛋白， 其 氨基酸序列如序列表的序列7所示)。 0071 基因QCAA 自5 末端第1至3位核苷酸为起始密码子， 第7至120位核苷酸为内含肽- C片段的编码序列， 第121-126位核苷酸为限制性内切酶NdeI的识别序列(CATATG)， 第127至 150位核苷酸为亲和纯化标签Strep-TagII的编码序列， 第151至1035位核苷酸为去除第一 位甲硫氨酸后的蛋白AA 的编码序列， 第103

29、6至1053位核苷酸为His-Tag标签的编码序列， 第1054至1059位核苷酸为限制性内切酶BamHI的识别序列(ggatcc)， 第1060至1428位核苷 酸为内含肽-N片段的编码序列， 第1429至1434位核苷酸为两个终止密码子。 0072 实施例2、 蛋白的活性 0073 一、 重组质粒的构建 0074 1、 重组质粒pET/SspDnaEintein-28a(+)的构建 0075 (1)以载体pSFBAD09为模板， 用CF和CR组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产 物。 0076 CF： 5 -TAACCATGGGCgttaaagttatcggtc-3 ； 0077

30、CR： 5 -TAACATATGATTGAAACAATTTGCAGC-3 ； 0078 CF中， 下划线标注NcoI酶切识别序列。 CR中， 方框标注的是一段Linker区(具有 KpnI酶切识别序列、 BamHI酶切识别序列)， 下划线标注NdeI酶切识别序列。 0079 (2)用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物， 回收酶切产物。 0080 (3)用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切载体pET-28a(+)， 回收载体骨架(约 5300bp)。 0081 (4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接， 得到重组质粒。 0082 (5)以载体pJJ

31、Duet30为模板， 用NF和NR组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增 产物。 0083 NF： 5 -AAAggatcctgcttaagtttcggtact-3 ； 0084 NR： 5 -ATGAAGCTTTCATTATTTGATAGTACCAGCGTCC-3 。 0085 NF中， 下划线标注BamHI酶切识别序列。 NR中， 下划线标注HindIII酶切识别序 列。 0086 (6)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤(5)的PCR扩增产物， 回收酶切 产物。 0087 (7)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤(4)得到的重组质粒， 回收载体 骨架

32、(约5420bp)。 0088 (8)将步骤(6)的酶切产物和步骤(7)的载体骨架连接， 得到重组质粒pET/Ssp DnaEintein-28a(+)。 0089 2、 重组质粒甲的构建 0090 (1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。 0091 (2)以步骤1合成的双链DNA分子为模板， 用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增， 得 到PCR扩增产物。 说明书 5/9 页 8 CN 105820218 A 8 0092F1： 5 -AAACATATGgcacaagtcattaatacaaacAG-3 ； 0093R1： 5 -AAAGGATCCACGCAGTAAAGAGAGGACG

33、T-3 。 0094 F1中， 下划线标注NdeI酶切识别序列， 方框标注亲和纯化标签Strep-TagII的编 码序列。 R1中， 下划线标注BamHI酶切识别序列， 方框标注His-Tag标签的编码序列。 0095 (3)用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切步骤(2)的PCR扩增产物， 回收酶切产物。 0096 (4)用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切重组质粒pET/SspDnaEintein-28a (+)， 回收载体骨架(约5800bp)。 0097 (5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接， 得到重组质粒甲。 根据测序 结果， 对重组质粒甲进行结构描述如下：

34、在载体pET-28a(+)的NcoI和HindIII酶切位点之 间插入了序列表的序列4自5 末端第5至1434位核苷酸所示的双链DNA分子。 重组质粒甲中， 插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合， 形成序列表的序列4所示的开放阅读框 (基因QCAA )， 表达序列表的序列3所示的蛋白质(蛋白QCAA )， 自剪切后形成序列表的序列 7所示的环化蛋白(蛋白CAA )。 0098 3、 重组质粒乙(对照质粒)的构建 0099 (1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。 0100 (2)以步骤1合成的双链DNA分子为模板， 用F1和R2组成的引物对进行PCR扩增， 得 到PCR扩增产物。

35、 0101F1： 5 AAACATATGGCACAAGTCATTAATACAAACAG-3 ； 0102R2： 5 AAAGGATCCTCATTAACGCAGTAAAGAGAGGACGT-3 。 0103 (3)用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切步骤(2)的PCR扩增产物， 回收酶切产物。 0104 (4)用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切载体pET-28a(+)， 回收载体骨架(约 5300bp)。 0105 (5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接， 得到重组质粒乙。 根据测序 结果， 对重组质粒乙进行结构描述如下： 在载体pET-28a(+)的NdeI和BamH

36、I酶切位点之间 插入了序列表的序列6自5 末端第4至936位核苷酸所示的双链DNA分子。 重组质粒乙中， 插 入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合， 形成序列表的序列6所示的开放阅读框(基 因Tag-AA )， 表达序列表的序列5所示的蛋白(蛋白Tag-AA )。 0106 二、 蛋白的表达 0107 将步骤一构建的重组质粒甲、 步骤一构建的重组质粒乙和载体pET-28a(+)分别进 行如下平行操作： 0108 1、 将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS， 得到重组菌。 0109 2、 将重组菌接种至LB培养基， 37、 220rpm振荡培养至OD600nm0.5， 加入IPT

37、G(使 其在培养体系中的浓度为0.5mmol/L)， 然后30、 200rpm振荡培养4小时。 0110 3、 取完成步骤2的培养体系， 4、 12000rpm离心5分钟， 收集菌体沉淀。 0111 4、 将菌体沉淀进行超声破碎(超声频率30； 超声5秒， 停5秒， 共50分钟)， 然后4 、 12000rpm离心20分钟， 分别收集上清和沉淀。 0112 采用重组质粒甲进行以上步骤过程中的SDS-PAGE见图1。 图1中， 泳道M为分子量标 说明书 6/9 页 9 CN 105820218 A 9 记， 泳道1为采用IPTG诱导前的培养体系上清， 泳道2为采用IPTG诱导后的菌体沉淀， 泳道

38、3 为超声破碎后的上清， 泳道4为超声破碎后的沉淀。 结果表明， 基因QCAA 在菌体内表达后， 在内含肽的作用下发生环化， 形成蛋白CAA (约33.73kDa)。 0113 采用重组质粒乙进行以上步骤过程中的SDS-PAGE见图2。 图2中， 泳道M为分子量标 记， 泳道1为采用IPTG诱导前的培养体系上清， 泳道2为采用IPTG诱导后的菌体沉淀， 泳道3 为超声破碎后的上清， 泳道4为超声破碎后的沉淀。 结果表明， 基因Tag-AA 在菌体内表达 后， 形成蛋白Tag-AA 。 0114 综合比较图1和图2， 蛋白CAA 在电泳中显示的分子量反而小于蛋白Tag-AA ， 这恰 恰是由于环

39、化蛋白结构更为紧密所以泳动速度更快造成的。 0115 三、 蛋白的纯化 0116 将采用重组质粒甲进行步骤二得到的超声破碎后的沉淀和采用重组质粒乙进行 步骤二得到的超声破碎后的沉淀分别进行以下平行操作： 0117 1、 将超声破碎后的沉淀用2M尿素水溶液洗涤， 然后加入2M尿素水溶液并室温放置 30分钟， 然后12000rpm离心30分钟， 收集上清液。 0118 2、 将步骤1得到的上清液进行阴离子交换层析。 0119 阴离子交换层析的层析柱为GEHiTrapQFF1ml(GE公司， 货号： 17-5053-01)； 柱 直径/柱高： 7mm/25mm； 0120 A液： pH7.5、 50

40、mM的Tris-HCl缓冲液； 0121 B液： 含1MNaCl的pH7.5、 50mM的Tris-HCl缓冲液。 0122 上样后， 先用10倍柱体积A液进行洗脱， 以去除未结合的杂蛋白； 然后进行10个柱 体积的梯度洗脱， 梯度洗脱的过程中， A液在洗脱液中的体积比由100线性下降到0， 相 应的B液在洗脱液中的体积由0线性上升到100， 流速为1ml/min， 共洗脱10分钟， 收集本 洗脱过程中第3-5毫升的过柱后溶液。 0123 3、 将步骤2得到的过柱后溶液进行Ni柱亲和层析。 0124 Ni柱亲和层析的层析柱为GEHisTrapFF5ml(GE公司， 货号17-5319-01)；

41、 0125 结合缓冲液： 含0.5MNaCl、 20mM咪唑的pH7.4、 20mM的磷酸盐缓冲液； 0126 洗脱缓冲液： 含0.5MNaCl、 500mM咪唑的pH7.4、 20mM的磷酸盐缓冲液。 0127 上样后， 先用10倍柱体积的结合缓冲液进行洗脱， 以去除杂蛋白； 然后用洗脱缓冲 液进行洗脱， 流速为2ml/min， 收集本步骤中第2-3个柱体积的过柱后溶液。 01284、 将步骤3得到的过柱后溶液进行Strep-Tag/(链亲和素)亲和层 析。 0129采用的层析柱为是IBA公司的1ml,货号是2-1207- 001； 0130 BufferW： 含1mMEDTA、 150mM

42、NaCl的pH8.0、 100mM的Tris-HCl缓冲液； 0131 BufferE： 含1mMEDTA、 150mMNaCl、 2.5mM脱硫生物素的pH8.0、 100mM的Tris-HCl 缓冲液。 0132 上样后， 先用5倍柱体积的BufferW进行洗脱； 然后用BufferE进行洗脱， 本步骤 中每0.5柱体积的过柱后溶液收集一管， 收集并合并第2至5管过柱后溶液。 0133 5、 将步骤4得到的过柱后溶液进行分子筛层析。 说明书 7/9 页 10 CN 105820218 A 10 0134 采用的层析柱为GESuperdex75prepgrade25ml(GE公司， 货号：

43、17-1044-10)。 0135 上样后， 采用含0.5MNaCl的pH7.4、 0.02M的PBS缓冲液进行洗脱， 流速为0.35ml/ min,收集第1.5-2.5个柱体积的过柱后溶液。 0136 步骤5收集的过柱后溶液即为目标蛋白液。 将重组质粒甲步骤二得到的超声破碎 后的沉淀进行上述步骤得到的目标蛋白液命名为CAA 蛋白液。 将重组质粒乙步骤二得到的 超声破碎后的沉淀进行上述步骤得到的目标蛋白液命名为Tag-AA 蛋白液。 0137 CAA 蛋白液和Tag-AA 蛋白液的SDS-PAGE照片见图3。 图3中， M1和M2分别为不同的 蛋白分子量标准， 泳道1为采用载体pET-28a(

44、+)进行步骤二时未加入IPTG诱导前的全菌对 照， 泳道2为采用重组质粒乙进行步骤二时采用IPTG诱导后的菌体， 泳道3为Tag-AA 蛋白 液， 泳道4为CAA 蛋白液。 0138 四、 蛋白的活性检测(细胞试验) 0139 通过双荧光素酶报告基因系统进行检测， 具体步骤如下： 0140 1、 在细胞培养板中加入HEK293细胞， 然后共转染载体pNF- B-Luc和载体pRL-SV40 (每105个细胞转染100ng载体pNF- B-Luc和2ng载体pRL-SV40)， 然后静置孵育6小时。 0141 2、 完成步骤1后， 取所述细胞培养板， 吸弃培养上清， 加入含待测蛋白的DMEM培养

45、 基， 然后静置孵育30小时。 0142 3、 完成步骤1后， 取所述细胞培养板， 加入待测蛋白， 然后静置孵育6小时进行活性 检测。 待测蛋白为步骤三制备的蛋白CAA 或蛋白Tag-AA (加入形式为CAA 蛋白液或Tag- AA 蛋白液)， 各设置三个处理浓度(10-1 mol/L、 10-3 mol/L或10-5 mol/L)， 每个处理浓度设 置4个重复。 设置用等体积PBS缓冲液代替待测蛋白液的对照处理。 0143 将对照处理的荧光素酶活性变化倍数设置为1， 不同待测蛋白的不同处理浓度下 的相对值见图4。 蛋白CAA 和蛋白Tag-AA 的活性在不同浓度下均显示了较好的梯度， 且活

46、性均 1。 结果表明， 蛋白CAA 和蛋白Tag-AA 均可有效活化NF- B信号通路， 且蛋白CAA 的活 性显著大于蛋白Tag-AA 。 0144 五、 蛋白的活性检测(动物试验) 0145 试验动物： C57BL/6小鼠， 雄性， 68周龄， 体重1822g。 0146 将72只试验动物随机分为六组(每组12只)， 分别处理如下： 0147 第一组： 试验第1天， 给试验动物皮下注射200微升CAA 蛋白液(用PBS缓冲液调整 蛋白浓度， 给药剂量为0.2mg蛋白/kg体重)， 完成皮下注射30分钟后采用60Co射线照射源 对试验动物进行全身照射(照射剂量为9Gy)； 0148 第二组：

47、 用Tag-AA 蛋白液代替CAA 蛋白液， 其他同第一组； 0149 第三组： 用PBS缓冲液代替CAA 蛋白液， 其他同第一组； 0150 第四组： 照射剂量为14Gy， 其他同第一组； 0151 第五组： 照射剂量为14Gy， 其他同第二组； 0152 第六组： 照射剂量为14Gy， 其他同第三组。 0153 试验第1-30天， 每天统计各组试验动物的存活率。 0154 结果见图5。 试验第10天， 第三组试验动物的存活率为0， 第二组试验动物的存活 率为90， 第一组试验动物的存活率为100； 试验第17天， 第二组试验动物的存活率为 70， 第一组试验动物的存活率为90。 试验第9天

48、， 第六组试验动物的存活率为0， 第五 说明书 8/9 页 11 CN 105820218 A 11 组试验动物的存活率为0， 第四组试验动物的存活率为30。 结果表明， 蛋白CAA 对辐射 损伤的预防治疗效果显著优于蛋白Tag-AA 。 说明书 9/9 页 12 CN 105820218 A 12 0001 序列表 1/12 页 13 CN 105820218 A 13 0002 序列表 2/12 页 14 CN 105820218 A 14 0003 序列表 3/12 页 15 CN 105820218 A 15 0004 序列表 4/12 页 16 CN 105820218 A 16 0

49、005 序列表 5/12 页 17 CN 105820218 A 17 0006 序列表 6/12 页 18 CN 105820218 A 18 0007 序列表 7/12 页 19 CN 105820218 A 19 0008 序列表 8/12 页 20 CN 105820218 A 20 0009 序列表 9/12 页 21 CN 105820218 A 21 0010 序列表 10/12 页 22 CN 105820218 A 22 0011 序列表 11/12 页 23 CN 105820218 A 23 0012 序列表 12/12 页 24 CN 105820218 A 24 图1 图2 说明书附图 1/3 页 25 CN 105820218 A 25 图3 图4 说明书附图 2/3 页 26 CN 105820218 A 26 图5 说明书附图 3/3 页 27 CN 105820218 A 27