一种病毒通用PCR检测方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102628088 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 102628088 B (21)申请号 201210128889.2 (22)申请日 2012.04.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 肇庆大华农生物药品有限公司 地址 526000 广东省肇庆市大旺经济开发区 丰盈工业园内 专利权人 广东大华农动物保健品股份有限 公司 (72)发明人 谢小雨 邵定勇 陈瑞爱 黄红亮 唐兆新 任常宝 (74)专利代理机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所 ( 普通合伙 ) 44288 代理人 汤喜友

2、 (54) 发明名称 一种病毒通用 PCR 检测方法 (57) 摘要 本发明涉及病毒检测方法， 具体涉及一种病 毒通用的PCR检测方法。 其包括样品处理、 提取核 酸、 扩增处理、 电泳观测、 扩增产物克隆、 基因组测 序分析等步骤。本发明所述的病毒通用的 PCR 检 测方法， 避免宿主基因组、 细菌或外源病毒感染， 具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于 快速鉴别诊断不同病毒， 解决了特异性 PCR 逐个 筛选鉴别病原的繁琐性， 并可用于生产中快速检 测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒 或基因变异大的病毒毒株。 (51)Int.Cl. 审查员 高欣 权利要求书 2 页 说明书 1

3、0 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书10页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102628088 B CN 102628088 B 1/2 页 2 1. 一种病毒通用的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 取植物组织样品 100-200mg 在液氮中 研磨至匀浆， 匀浆液在液氮中或 -80温度下反复冻融三次， 10000-12000rpm 离心 10min， 取上清为样品 ； 还包括以下步骤 ； 1） 样品处理 将样品用 0.2-0.25um 滤器过滤， 滤液经 30-30K 超滤管 5000rpm 离心 20-30 分钟， 浓

4、缩 至 1-2ml， 余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液， 合并后得到浓缩病毒液， 浓缩病毒液中 分别加入2-5l的DNase 2-5l的RNase及5-10l10 Buffer， 37消化1.5小时后， 80 5min 终止消化 ； 2） 提取核酸 消化好的病毒液， 用总核酸试剂盒分别提取病毒 DNA 和 RNA ； 3） 扩增处理 取病毒 DNA 或 RNA 提取液 10l， 2ul 10M 的随机引物， 加入到反应体系中， 离心混匀 后， 进行 PCR 或 RT-PCR 扩增处理 ； 4） 电泳观测 ： 取上述扩增处理后的样品5-10l， 用含有0.5-1.0g/ml溴化锭的0.8-1%

5、w/v琼脂糖 凝胶， 经过 10-20min 电泳和显色， 5） 扩增产物克隆 将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收， 回收产物连接于 T 载体， 加入到连接体 系中， 于 10-16过夜连接 ； 连接产物加入至 50-100l 的 DH5 感受态中， 冰浴 30min 后， 于 40-42水浴热激 80-90s， 置冰上 3 5min 后， 加入 300-500l 的 LB 培养基， 37振荡 培养 1h， 将培养液于 2000-3000rpm 离心 3min， 弃去培养基， 剩余培养基重新与样品处理中 过滤后沉淀混合， 混合液涂布于AMP+ LB固体培基， 充分吸收后， 于37倒置培养1

6、216h ； 取 5-10 个克隆， 分别于 AMP+LB 培养基培养 3 6 小时， 试剂盒提取质粒后， 于 37对质粒 进行双酶切 1-2h ； 6） 基因组测序分析 取上述双酶切后的样品5-10l， 与2-6l 的0.25%w/v溴酚蓝上缓冲液混合， 在含有 0.5-1.0g/ml溴化锭的0.8-1%w/v琼脂糖凝胶， 经过10-20min电泳和显色， 在投射紫外灯 下观察酶切结果阳性的样品进行测序。 2. 根据权利要求 1 所述的病毒通用的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 所述 3） 步骤中， 取 DNA 提取液时， 采用一次 PCR 扩增， 即将 10l DNA 提取液， 2ul

7、 10M 的随机引物， 加 入 PCR 反应体系中， ddH2O 补足 50l， 离心混匀后， 通过 94-95解链 2min ； 然后 94-95 变性 30-40s ； 退火复性 30 2min ， 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s， 再 72延伸 2min， 经过 30-35 个循环， 最后 72延伸 5-10min ； 4冷却保存 10min， 得到扩增样品。 3. 根据权利要求 2 所述的病毒通用的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 所述 PCR 反应体系 成分

8、为 2PCR Master Mix 25l。 4. 根据权利要求 1 所述的病毒通用的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 所述 3） 步骤中， 取 RNA 提取液时， 采用一次 RT-PCR 扩增， 即将 10l RNA 提取液， 2ul 10M 的随机引物， 加入 RT-PCR反应体系中， RNase free dH2O补足50l， 离心混匀后进行通过94-95解链2min ； 权 利 要 求 书 CN 102628088 B 2 2/2 页 3 然后 94-95变性 30-40s ； 退火复性 30 2min ； 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s

9、 ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s， 再 72延伸 2min， 经过 30-35 个循环， 最 后 72延伸 5-10min ； 4冷却保存 10min， 得到扩增样品。 5. 根据权利要求4所述的病毒通用的PCR检测方法， 其特征在于 ： 所述RT-PCR反应体 系成分为 Prime Script1 step Enzyme Mix 2l， 21 step Buffer 25l。 6. 根据权利要求 1 所述的病毒通用的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 所述随机引物的 DNA 碱基序列为 VVVVVVVVAA， 其中 V 为 T、 G、 C 中

10、的任一种。 权 利 要 求 书 CN 102628088 B 3 1/10 页 4 一种病毒通用 PCR 检测方法 技术领域 0001 本发明涉及病毒检测方法， 具体涉及一种病毒通用的 PCR 检测方法。 背景技术 0002 近年来， 传染病日益严重， 且传染途径复杂， 病原变异性大， 这些毫无疑问都给临 床检测带来了巨大挑战。传统的病原检测方法如通过临床症状、 病理变化、 病毒分离、 人工 致病试验等试验诊断病原， 血清分离、 电镜观察等， 工作量大， 技术复杂， 耗时长， 不适宜现 在传染病的有效监测和防控。这就需要一种快速灵活的方法来检测病原核酸， 以严格控制 传染病的发生。 0003

11、1990年， 美国学者Welsh与Williams等分别同时建立了一种能够应用于不同的病 原微生物的临床诊断技术。Welsh 等将随机引物与 PCR 技术相结合、 建立了用于杂交基因 组 DNA 指纹分析的任一引物 PCR 方法 (arbitrary primer， AP PCR)， Williams 等创造了名 为随机扩增 DNA 的多态性 PCR 的方法 (random amplified poly morph DNA， RAPD)， 两种方 法区别在于前者的引物较长， 多为 20 个左右碱基的单条或双条引物， 而后者多选用 9 10 个碱基的单条引物。后国际上统称其为随机 PCR 技术。

12、 0004 随机PCR技术因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而迅速渗透 到分子生物学研究领域的各个方面， 在建立后的短短几年内， 它已在微生物、 植物、 动物及 人类研究等领域显示出广泛的应用前景。 0005 随机 PCR 技术是指在实验室检测中不知样本病原序列的情况下， 利用一系列的随 机引物， 在 PCR 反应体系中， 首先在不严格条件下使引物与模板 DNA 中许多序列通过错配 而复性。理论上， 不一定要求整个引物都与模板复性， 而只要引物的一部分特别是 3 端有 3-4 个以上碱基与模板互补复性， 既可使引物延伸， 一旦在两条单链上相距一定距离且有反 向复性引物存在， 则

13、可在Taq DNA聚合酶的作用下进行DNA片段的扩增， 经一至数轮不严格 条件下的 PCR 循环后， 再于严格条件下进行扩增。经对 PCR 扩增产物回收克隆后测序已检 测病原的一种检测技术。 0006 随机引物是指使用非特异序列的寡聚核苷酸 ( 长度为 5 10 个碱基 ) 作 DNA 合 成过程中的引物， 它与一般常用引物的区别在于其随机性或是与特异性相对的概念， 包括 两方面的含义 ： (1)核苷酸的排列顺序是随机的 ； (2)所有引物的的序列无直接相关性 ； (3) 随机引物可用于所有物种。 0007 而后， 由于国际各类传染病以病毒性传染疾病最为严重， 为更快、 更好的检测病毒 感染样

14、品， 国内外研究者对随机 PCR 技术进行了大量改进， 建立了多种病毒检测 PCR 方法。 0008 1991 年， Reyes G R 和 Kim J P 于建立了非依赖性基因扩大法 (SISPA)， 该方法在 DNA 模板钝末端连接一非对称引物， 经过若干循环的变性、 退火和延伸后， 模板的数量得到 扩增， 后经克隆、 测序、 分析得到基因序列。Allander T、 Zhang T 等人采用 SISPA 技术测定 了未知 DNA 及 RNA 病毒的序列， 研究证实应用这一方法对于不同类型和来源的病毒均有效 果， 所获得的病毒全基因序列大小从 3000bp-15kb 不等， 但该方法所得产

15、物杂质较多， 容易 说 明 书 CN 102628088 B 4 2/10 页 5 扩增到宿主染色体序列。随后 Allander T、 Breitbart M、 Jones M S、 v an derHoek L 等 人在 SISPA 基础上， 应用 DNase 处理样品后再进行 SISPA(DNase SISPA)， 从临床样品中鉴 定出牛和人的新病毒。Djikeng A 等人 (2008) 在 DNase SISPA 基础上进行了新的改进， 将 RNase 酶处理加入到 SISPA 技术的程序中， 以清除外源 RNA 的污染如核糖体 RNAs。2007 年， Clem AL 等建立了多重随

16、机 PCR， 对快速监测和鉴定病毒有很强的实用性。 0009 研究证明， 目前所采用的病毒通用 PCR 方法可快速有效的检测临床上未知病原感 染样品， 对生产、 传染病监测具有重大意义 ； 但该方法存在一定的局限性， 因为来自宿主的 染色体 DNA 相对含量较高， 对病毒样品的质量要求高， 且由于该方法的可重复性不高， 应用 该技术直接发现或鉴定新病毒方面还没有得到很好的推广。 发明内容 0010 为了克服现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种病毒通用的 PCR 检测方 法， 避免宿主基因组、 细菌或外源病毒感染， 较好的特异性和重复性。 0011 为解决上述问题， 本发明所采用的技术方案

17、如下 ： 0012 一种病毒通用的 PCR 检测方法， 其包括以下步骤 0013 1) 样品处理 0014 将样品用 0.2-0.25um 滤器过滤， 滤液经 30-30K 超滤管 5000rpm 离心 20-30 分钟， 浓缩至 1-2ml， 余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液， 合并后得到浓缩病毒液， 浓缩病毒 液中分别加入 2-5l 的 DNase 2-5l 的 RNase 及 5-10l 10Bufier， 37消化 1.5 小 时后， 80 5min 终止消化 ； 0015 2) 提取核酸 0016 消化好的病毒液， 用总核酸试剂盒分别提取病毒 DNA 和 RNA ； 0017 3)

18、 扩增处理 0018 取 DNA 或 RNA 提取液 5-10l， 2-52ul 5-10M 的随机引物， 加入到反应体系中， 离心混匀后， 进行扩增处理 ； 0019 4) 电泳观测 ： 0020 取上述扩增处理后的样品 5-10l， 用含有 0.5-1.0g/ml 溴化锭的 0.8-1 w/v 琼脂糖凝胶， 经过 10-20min 电泳和显色， 0021 5) 扩增产物克隆 0022 将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收， 回收产物连接于 T 载体， 加入到连 接体系中， 于 10-16过夜连接 ； 连接产物加入到 50-100l 的 DH5 感受态中， 0冰浴 30min 后， 于 4

19、0-42水浴热激 80-90s， 置冰上 3 5min 后， 加入 300-500l 的 LB 培养基， 37振荡培养 1h， 将培养液于 2000-3000rpm 离心 3min， 弃去培养基， 剩余培养基重新与样 品处理中过滤后沉淀混合， 混合液涂布于 AIX+LB 固体培基， 充分吸收后， 于 37倒置培养 12 16h ； 取 5-10 个克隆， 分别于 AMP+LB 培养基培养 3 6 小时， 试剂盒提取质粒后， 于 37对质粒进行双酶切 1-2h ； 0023 6) 基因组测序分析 0024 取上述克双酶切后的样品 5-10l， 与 2-6l 的 0.25 w/v 溴酚蓝上缓冲液混

20、 合， 在含有 0.5-1.0g/ml 溴化锭的 0.8-1 w/v 琼脂糖凝胶， 经过 10-20min 电泳和显色， 说 明 书 CN 102628088 B 5 3/10 页 6 在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行进行测序。 0025 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法还包括样品前处理步骤， 所述样品来 源于细胞， 前处理步骤为取细胞 5-10106个， 液氮中或 -80温度下反复冻融三次于 10000-12000rpm 离心 5-10min， 取上清为样品， 开始 1) 样品处理步骤 ； 或者， 所述前处理步 骤为将细胞进行单层培养， 细胞长满培养瓶后， 用胰蛋白酶消化细胞

21、， 细胞从培养瓶表面脱 落后， 收集细胞液， 液氮或 -80中反复冻融三次， 12000rpm 离心 10min， 取上清为样品， 开 始 1) 样品处理步骤。 0026 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法还包括样品前处理步骤， 所述样品来源于 动植物组织， 前处理步骤为取组织样品 100-200mg 在液氮中研磨至匀浆， 匀浆液在液氮中 或 -80温度下反复冻融三次， 10000-12000rpm 离心 10min， 取上清为样， 品开始 1) 样品处 理步骤。 0027 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法还包括样品前处理步骤， 所述样品来 源于全血， 前处理步骤为将全血于 37

22、溶解， 加入 3-5 倍全血体积于红细胞裂解液， 10000-12000rpm 离心 10min， 吸取中间白膜层为样品， 开始 1) 样品处理步骤。 0028 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法还包括样品前处理步骤， 所述样品来源于 血清或血浆， 前处理步骤为直接将血清或血浆与 37溶解得样品， 开始 1) 样品处理步骤。 0029 上 述 方 法 中， 所 述 3) 步 骤 中， 取 DNA 提 取 液 时， 采 用 一 次 PCR 扩 增， 即 将 5-10lDNA 提取液， 2-52ul5-10M 的随机引物， 加入 PCR 反应体系中， ddH2O 补足 50l， 离心混匀后，

23、 通过94-95解链2min ； 然后94-95变性30-40s ； 退火复性302min ； 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s， 72延伸 2min， 经过 30-35 个循环， 最后 72延伸 5-10min ； 4， 10min， 得到扩增样品。 0030 其中所述 PCR 反应体系成分为 ： PCR Master Mix(2)25l。 0031 上述方法中， 所述 3) 步骤中， 取 RNA 提取液时， 采用一次 RT-PCR 扩增， 即将 5-10lDNA 提取液

24、， 2-52ul5-10M 的随机引物， 加入 RT-PCR 反应体系中， RNase free dH2O 补足 50l， 离心混匀后， 通过 94-95解链 2min ； 然后 94-95变性 30-40s ； 退火复 性 30 2min ； 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s， 再 72延伸 2min， 经过 30-35 个循环， 最后 72延伸 5-10min ； 4保存 10min， 得到扩增样品。 0032 其中所述 RT-PCR 反应体系成分为 PrimeScri

25、pt 1 step Enzyme Mix 2l， 21step Buffer 25l。 0033 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法中， 所述的随机引物的 DNA 碱基序列为 VVVVVVVVAA， 其中 V 为 T、 G、 C 中的任一种。 0034 本发明中， 1)步骤中所用的DNase(脱氧核糖核酸酶)和RNase(核糖核酸酶)购自 TaKaRa 公司 ； 2) 步骤中所用的总核酸试剂盒为购自 TaKaRa 公司的 Mini BEST Viral RNA/ DNA Extraction Ver.4.0。 0035 本发明的有益效果在于 ： 本发明所述的病毒通用的 PCR 检测方法，

26、 避免宿主基因 组、 细菌或外源病毒感染， 具有较好的特异性和重复性。 本发明的方法用于快速鉴别诊断不 同病毒， 解决了特异性 PCR 逐个筛选鉴别病原的繁琐性， 并可用于生产中快速检测临床未 知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。 说 明 书 CN 102628088 B 6 4/10 页 7 0036 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 附图说明 0037 图 1、 九份病料 PCR 检测结果， 泳道 1 ： 分子量标准， 泳道 2 ： H9N1， 泳道 3 ： PRRSV， 泳 道 4 ： PRV， 泳道 5 ： IBV， 泳道 6 ： NDV， 泳

27、道 7 ： EDS， 泳道 8 ： PRRSV&PRV， 泳道 9 ： 正常细胞， 泳道 10 ： 正常鸡胚尿囊液 ； 0038 图2、 九份病料RT-PCR检测结果， 泳道1 ： 分子量标准， 泳道2 ： H9N1， 泳道3 ： PRRSV， 泳道 4 ： PRV， 泳道 5 ： IBV， 泳道 6 ： NDV， 泳道 7 ： EDS， 泳道 8 ： PRRSV&PRV， 泳道 9 ： 正常细胞， 泳 道 10 ： 正常鸡胚尿囊液 ； 0039 图3、 敏感性试验电泳图， 泳道1 ： 病毒浓度为107.0， 泳道2 ： 病毒浓度为106.0， 泳 道3 ： 病毒浓度为105.0， 泳道4 ：

28、 病毒浓度为104.0， 泳道5 ： 病毒浓度为103.0， 泳道6 ： 病毒 浓度为 102.0， 泳道 7 ： 病毒浓度为 101.0 ； 0040 图4、 未知病毒感染CEF切片电镜观察， 图A箭头处为100nm左右病毒样颗粒， 颗粒 表面有较明显囊膜结构。图 B 箭头处为 20nm 左右二十面体病毒颗粒。图 C 箭头处为丝状 不明物 ； 0041 图5、 尿囊液接种CEF细胞病变观察 ； A为病变细胞， 梭状CEF细胞在中心部位或两 端出现一个或数个空泡， 随后细胞逐步萎缩、 变圆， 最后形成一个大的空泡。 B为正常细胞对 照。 具体实施方式 0042 在本发明中中， 如无特别说明，

29、本发明的都使用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的常规技术， 这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下 了文件中有详细描述 ： Sambrook 等人编著的 Molecular Cloning ： Alaboratory Mannual， 第 二 版 (1989) ； Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames 和 S.J.Higgin 编 著， 1984) ； Immnochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Academic Press， London)。 0043 本发明中所

30、出现的 T 载体选自18-T Vector， 所述连接体系为 18-TVector*1 1l、 insert DNA 0.3pmol， Solution I 5l， ddH2O( 经过两次蒸馏的蒸 馏水 ) 补足 10l。其中18-T Vector、18-Tvector*1 均购自宝生物工程有 限责任公司 (TaKaRa BIOTECHNOLOGYCO.， LTD)。本发明中出现的One Step RT-PCR Kit Ver.2.0、 DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、 DnaseI、 Rnase、 Kpn I、 HindIII 均购自宝生物工程有限

31、责任公司 (TaKaRa BIOTECHNOLOGYCO.， LTD)， 一步法质粒 DNA 抽提试剂盒购自生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ； 胎牛血清、 MEM 培养基购自 GIBCO 公 司。 0044 实施例 1 ： 病毒通用 PCR 方法特异性试验 0045 5. 材料 0046 毒株、 细胞 ： 特异性试验检测病毒(如下表所示)毒株由广东大华农动物保健品股 份有限公司生药研发中心并保存。 说 明 书 CN 102628088 B 7 5/10 页 8 0047 0048 菌株 ： DH5 菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存。 0049 随机引物 ： VVVV

32、VVVVAA， 其中V为T、 G、 C任意一种， 由TaKaRa公司合成 ； 经过测序， 各病毒相应对应的随机引物分别为 ： H9N1 ： TTGGGGCGAA ； 0050 PRRSV ： GCTGCCTTAA/CGTCTGCTAA ； PRV ： CTGCTGCTAA ； 0051 IBV ： TTGGTGGCAA ； EDS ： TGTTTCTCAA ； NDV ： TTTCTCGGAA ； PRRSV-PRV ： GGCGTGTGAA/ CTTGGGGCAA。 0052 2、 方法步骤 0053 病毒增殖培养如下表所示 ： 0054 0055 细胞毒液样品前处理 ： 上述 1-3 病毒

33、细胞培养至 CPE 达 90， 再用胰酶消化细 胞， 收集细胞毒液 ； 4-7 鸡胚培养的病毒， 收集致死鸡胚的尿囊液， 正常细胞 90贴壁， 正常 鸡胚收集鸡胚尿囊液待用 ； 对上述 9 份样品的增殖液各取 10ml， 反复冻融三次， 12000rpm， 10min， 取上清为样品 ； 0056 样品处理 ： 上述 9 种样品分别 0.22um 滤器过滤， 滤液经 30K 超滤管 5000rpm 离 心 30 分钟， 浓缩至 1ml， 余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液后合并 ； 浓缩病毒液中 分别加入 5l 的 Dnase I( 脱氧核糖核酸酶 ) 和 5l 的 Rnase( 核糖核酸酶

34、)， 及 5l 10Buffer， 37消化 1.5 小时后， 80 5min 终止消化 ； 0057 病毒总核酸提取 ： 处理好的病毒液， 用总核酸提取试剂盒(Mini BEST Viral RNA/ DNA Extraction Ver.4.0)， 分别提取病毒 DNA 和 RNA 病毒液各 300l， 用分光光度计测核 酸浓度 ； 0058 一次 PCR 扩增 ( 病毒 DNA) ： PCR Master Mix(2)25l， 病毒 DNA 提取液 10l， 浓度为 10M 的 primer 2ul， ddH2O 补足 50l 反应体系， 离心混匀后， 通过 94-95解 链 2min

35、； 然后 94-95变性 30-40s ； 退火复性 30， 2min ； 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s， 72延伸 2min， 经过 30-35 个循环， 最后 72延伸 5-10min ； 4保存 10min， 得到扩增样品。 0059 RT-PCR 一步法 ( 病毒 RNA) ： 用 TaKaRa 公司的One Step RT-PCR Kit Ver.2 进行， PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2l， 21step Buffer 25l

36、， primer(10M)2l， 病毒 RNA 提取液 10l， Rnase free dH2O 补足 50l 体系进行 cDNA 说 明 书 CN 102628088 B 8 6/10 页 9 合成， 合成反应条件为 30， 30min ； 37， 30min ； 50， 30min。随后反应条件同 PCR ； 0060 电泳观测 ： 取上述扩增处理后的样品 5-10l， 用含有 0.5-1.0g/ml 溴化锭的 0.8-1 w/v 琼脂糖凝胶， 经过 10-20min 电泳和显色， 0061 PCR 产物克隆测序 ： 对对电泳观测结果为阳性的扩增产物 PCR 产物纯化回收， 回收 试剂盒为

37、 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0， 并使用分光光度计测核酸浓 度 ； 回收产物连接于18-T Vector， 连接体系为18-TVector*1 1l， insert DNA 0.3pmol， Solution I 5l， ddH2O 补足 10l， 16过夜连接 ； 连接产物加入至 100l 的 DH5 感受态中， 冰浴 30min 后， 于 42水浴热激 90s， 置冰上 3 5min 后， 加入 500l 的 LB 培养基， 37振荡培养 1h。将培养液 3000rpm 离心 3min， 弃去 200l 培养基。剩余 培养基重新与

38、离心细菌沉淀混合。混合液涂布于 AMP+LB 固体培基。充分吸收后， 于 37倒 置培养 12 16h ； 0062 随机挑选10个克隆， 分别于AMP+LB培养基培养3-6小时， 试剂盒(一步法质粒DNA 抽提试剂盒， 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ) 提取质粒后， 选用 Kpn I 酶和 Hind III 对 质粒进行双酶切， 37 1h， 电泳观测结果， 酶切结果阳性的送测序公司进行测序。 0063 3. 实验结果 0064 电泳结果 ： 本研究以 H9N1、 PRRSV、 PRV、 IBV、 NDV、 EDS、 PRRSV&PRV1 1 混合样品 为材料建立了病毒通用 PCR

39、方法的特异性试验， 电泳观察结果显示 ( 图 2， 图 3)PCR 检测 PRV、 EDS和PRRSV&PRV结果为阳性， 其他六份样品的检测结果为阴性 ； 而RT-PCR检测H9N1、 PRRSV、 IBV、 NDV、 PRRSV&PRV 结果阳性， 均可得到单一的目的条带， 检测 PRV、 EDS、 正常细胞 液、 正常鸡胚尿囊液结果为阴性。 0065 测序结果 ： 测序结果与已知各病毒序列一致。 0066 4. 结论 0067 该实施例中， 以 H9N1、 PRRSV、 PRV、 IBV、 NDV、 EDS、 PRRSV&PRV1 1 混合样品为材料 建立了病毒通用PCR方法的特异性试验

40、。 用该方法对这7份病毒液进行检测， 均可得到各自 的目的条带， 而对正常细胞液和鸡胚尿囊液的检测结果均为阴性， 对 PCR 产物克隆后测序， 测序结果显示， 各 PCR 检测到的序列与已知各病毒序列一致， 未见宿主基因组、 细菌或外源 病毒感染， 表明该方法具有较好的特异性。 0068 实施例 2 ： 病毒通用 PCR 方法敏感性试验 0069 5. 材料 0070 毒株、 细胞 ： PRV-Ra株的TK基因缺失的PRV重组病毒PRV/TK-： 由广东大华农动物 保健品股份有限公司生药研发中心构建并保存 ； BHK21 细胞购自中国兽药监察所。 0071 菌株 ： DH5 菌株由广东大华农动

41、物保健品股份有限公司生药研发中心保存。 0072 随机引物 ： VVVVVVVVAA， 其中 V 为 T、 G、 C 任意一种， 由 TaKaRa 公司合成。 0073 2. 方法步骤 0074 病毒增殖 ： BHK21 细胞按常规方法培养， 以 5-10PFU/ 细胞感染病毒， 当细胞病变 (CPE) 达 90左右收获病毒， 计算病毒的 TCID50 ； 0075 细胞毒液样品前处理 ： 取 107.0TCID50 的细胞病毒液， 反复冻融三次， 12000rpm， 10min， 取上清为样品 ； 0076 样品处理 ： 上述样品 0.22um 滤器过滤， 滤液经 30K 超滤管 5000r

42、pm 离心 30 分钟， 说 明 书 CN 102628088 B 9 7/10 页 10 余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液， 取 1ml 的浓缩病毒液中分别加入 5l 的 DnaseI 和 5l 的 Rnase， 及 10l 10Buffer， 37消化 1.5 小时后， 80 5min 终止消化 ； 0077 病毒总核酸提取 ： 处理好的病毒液， 用总核酸提取试剂盒 (TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Ver.4.0)， 分别提取病毒核酸 DNA 和 RNA 各 300l， 用分光光 度计测核酸浓度 ； 0078 RT-PCR 一步法 (

43、病毒 RNA) ： 上述 RNA 提取液 10 倍系列稀释后， 取各浓度的 10l 核酸液分别进行RT-PCR ； 用TaKaRa公司的One StepRT-PCR Kit Ver.2进行， Prime Script 1 step Enzyme Mix 2l， 21step Buffer 25l， primer(10M)2l， RNA 模板 10l， Rnase free dH2O 补足 50l 体系， 进行 cDNA 合成， 合成条件为 30， 30min ； 37， 30min ； 50， 30min ； 通过 94-95解链 2min ； 然后 94-95变性 30-40s ； 退 火

44、30 2min ； 经过 33， 20s ； 36， 20s ； 39， 20s ； 42， 20s ； 45， 20s ； 48， 20s ； 51， 20s ； 54， 20s的复性， 72延伸2min， 经过30-35个循环， 最后72延伸5-10min ； 4冷却 保存 10min， 得到扩增样品 ； 0079 电泳观测 ： 取上述扩增处理后的样品 5-10l， 用含有 0.5-1.0g/ml 溴化锭的 0.8-1 w/v 琼脂糖凝胶， 经过 10-20min 电泳和显色， 0080 PCR 产物克隆测序 ： 对电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收， 回收试剂盒为 TaKaRa DNA

45、 Fragment Purification Kit Ver.2.0， 并使用分光光度计测核酸浓度 ； 回收 产物连接于18-T Vector， 连接体系为18-T Vector*1 1l， insert DNA 0.3pmol， Solution I 5l， ddH2O 补足 10l， 16过夜连接 ； 连接产物加入至 100l 的 DH5 感受态中， 冰浴 30min 后， 于 42水浴热激 90s， 置冰上 3 5min 后， 加入 500l 的 LB 培养基， 37振荡培养 1h。将培养液 3000rpm 离心 3min， 弃去 200l 培养基。剩余培养 基重新与离心细菌沉淀混合 ；

46、 混合液涂布于 AMP+LB 固体培基。充分吸收后， 于 37倒置培 养 12 16h ； 0081 随机挑选 10 个克隆， 分别于 AMP+LB 培养基培养 3-6 小时， 试剂盒 ( 一步法质粒 DNA 抽提试剂盒， 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ) 提取质粒后， 选用 Kpn I 酶和 Hind III 对质粒进行双酶切， 37 1h， 电泳观测结果， 酶切结果阳性的送测序公司进行测序。 0082 3 实验结果 0083 电泳结果 ： 用病毒通用 PCR 方法检测 PRV 重组病毒 PRV/TK-， 原始浓度为 107.0个 TCID50 的细胞病毒液 10 倍系列后分别进行

47、RT-PCR， 敏感性试验表明， 病毒通用 PCR 方法检 测 PRV 重组病毒 PRV/TK- 最低量为 104.0个 TCID50。 0084 测序结果 ： 测序结果为 PRV 基因序列。 0085 4. 结论 0086 本研究以 PRV-Ra 株的重组病毒 PRV/TK- 为材料， 用随机引物 V8A2 建立了病毒通 用 PCR 方法的敏感性试验 ； PRV/TK- 的最低检出量为个 104.0TCID50， 表明该方法具有较高的 敏感性。 0087 实施例 3 ： 未知微生物鉴定 0088 某鸡场用病死鸡肝脏悬液接种鸡胚， 鸡胚全身出血严重， 尿囊膜上出现水泡样物 质， PCR、 血清

48、学等多种方法无法鉴别尿囊液中未知微生物 ； 特进行本试验鉴定该未知微生 物。 说 明 书 CN 102628088 B 10 8/10 页 11 0089 2. 材料 0090 鸡胚 ： 购自广东大华农 0091 随机引物 ： VVVVVVVVAA， 其中 V 为 T、 G、 C 任意一种， 由 TaKaRa 公司合成。 0092 3. 方法步骤 0093 1)微生物扩繁 ： 鸡胚尿囊腔接种 ： 含未知微生物的鸡胚尿囊液0.1um滤器过滤， 10 日龄 SPF 鸡胚尿囊腔接种， 观察 3-5 天， 收集鸡胚尿囊液 ； 0094 2) 鸡胚成纤维细胞 (CEF) 接种 ： 含未知微生物的鸡胚尿囊

49、液 0.1um 滤器过滤， 接 种 CEF， 观察 2-4 天， 完全病变后收毒， 得到细胞液 ； 0095 3) 上述细胞液反复冻融后 10000rpm 离心 10min， 取上清为样 1， 样 1 与氯仿 1 1 混合， 充分振荡静置 10min， 12000rpm 离心 10min， 吸取上清为样 2， 样 1 和样 2 分别用 0.22m 的滤器过滤后接种两组 CEF， 观察 2-4 天。 0096 鸡胚尿囊液病毒纯化及电镜观察 ： 取上述1)中鸡胚尿囊液15ml于10000rpm离心 30 分钟， 上清 0.1um 滤器过滤后 30KDa 超滤管 5000rpm 超滤 30 分钟， 取尿囊余液蔗糖密度 梯度离心 (15、 30、 50三个梯度， 30000rpm 离心 2h)， 对可见条带、 不同梯度离心液及 尿囊液负染观察。再取 15ml 上述 1) 中的鸡胚尿囊液 30000rpm 离心 2h， 取沉淀及上清负染 观察。 0097 鸡胚切片观察 ： 对上述 1) 中的病变鸡胚做超薄切片电镜观察。 0098 CEF 切片观察 ： 对上述 2) 中病变 CEF 收毒后的细胞液进行电镜观察。 0099 样品前处理 ： 将 10ml 上述 1) 中的鸡胚尿囊液、 2) 中细胞液的反复冻融 3 次， 10000rpm 离