CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102676652 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676652 A *CN102676652A* (21)申请号 201210065451.4 (22)申请日 2012.03.09 2011-051631 2011.03.09 JP C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 爱科来株式会社 地址 日本京都府 (72)发明人 井口亚希 平井光春 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强 (54) 发明名称

2、 CYP3A基因的多态性检测用探针、 多态性检测 方法、 药效评价方法以及多态性检测用试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了 CYP3A 基因的多态性检测用探 针、 多态性检测方法、 药效评价方法以及多态性检 测用试剂盒。本发明的多态性检测用探针能高灵 敏度且简便地检测 CYP3A 基因多态性。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 37 页 序列表 11 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 37 页 序列表 11 页 附图 4 页 1/3 页 2 1. 一种多态性检测用探针， 用于检测 CY

3、P3A 基因的多态性， 所述多态性检测用探针是 从包括下述 P1、 P1 、 P2、 P2 、 P3、 P3 、 P4、 P4 、 P5 和 P5 的组中选择的一种荧光标记寡核 苷酸 ： (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 1 所示的序列中第 401 位第 411 位的碱基 的碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为胞嘧啶 之外， 相对于具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且其 中与序列号 1 所示的序列中的第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号

4、 1 所示的序列中第 401 位第 411 位的碱 基的碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为胞嘧 啶之外， 与具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且其中 与序列号 1 所示的序列中的第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； (P2) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 2 所示的序列中第 201 位第 205 位的碱基 的碱基长为 5 50 的序列， 其除了与序列号 2 中的第 205 位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之 外， 相对于具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且其中

5、 与序列号 2 所示的序列中的第 205 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； (P2 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 2 所示的序列中第 201 位第 205 位的碱 基的碱基长为 5 50 的序列， 其除了与序列号 2 中的第 205 位的碱基对应的碱基为胞嘧啶 之外， 与具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且其中与 序列号 2 所示的序列中的第 205 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； (P3) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中的第 190 位第 201 位的 碱基的碱基长为1250的序列互补的序列， 其除了与序列号2中的

6、第190位的碱基互补的 碱基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 2 的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少 80 以上的同一性， 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 190 位的碱基互补的碱基用荧光染 料标记 ； (P3 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中第 190 位第 201 位的 碱基的碱基长为 12 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 190 位的碱基互补 的碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交， 并且 其中与序列号 2 所示的序列中的第 190 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记 ； (P4) 荧光标记

7、寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中第 186 位第 201 位的碱 基的碱基长为 16 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 186 位的碱基互补的 碱基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 2 的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少 80 以上的同一性， 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 186 位的碱基互补的碱基用荧光染 料标记 ； (P4 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中的第 186 位第 201 位 的碱基的碱基长为 16 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 186 位的碱基互 补的碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序

8、列号 2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交， 并 且其中与序列号 2 所示的序列中的第 186 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记 ； (P5) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 3 所示的序列中第 496 位第 501 位的碱 基的碱基长为 6 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 3 中的第 496 位的碱基互补的碱 权 利 要 求 书 CN 102676652 A 2 2/3 页 3 基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 3 的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少 80以 上的同一性， 并且其中与序列号 3 所示的序列中的第 496 位的碱基互补的碱基用荧光染料 标记 ； (P5

9、 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 3 所示的序列中第 496 位第 501 位的 碱基的碱基长为 6 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 3 中的第 496 位的碱基互补的 碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序列号 3 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交， 并且其 中与序列号 3 所示的序列中的第 496 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。 2. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸识别序列 号 1 中的第 401 位的碱基的多态性。 3. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在从 3 末 端起数第 1 3 位

10、具有用所述荧光染料标记的所述碱基。 4. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在 3 末端 具有用所述荧光染料标记的所述碱基。 5. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在未与靶 标序列杂交时发出荧光， 并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。 6. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在未与靶 标序列杂交时发出荧光， 在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。 7. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述 P1 和 P1 的荧光标记寡核苷酸的碱基长为 15 30 碱基

11、长， 所述 P2 和 P2 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 10 30 碱基长， 所述 P3 和 P3 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 12 40 碱基长， 所述 P4 和 P4 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 16 40 碱基长， 所述 P5 和 P5 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 10 40 碱基长。 8. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述 P1 和 P1 的荧光标记寡核苷酸的碱基长为 15 20 碱基长， 所述 P2 和 P2 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 10 20 碱基长， 所述 P3 和 P3 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 15 30 碱基长， 所述 P4 和 P4 荧光标记

12、寡核苷酸的碱基长为 20 30 碱基长， 所述 P5 和 P5 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 20 30 碱基长。 9. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用探针是用于分 析熔解曲线的探针。 10. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用探针具有序列 号 37、 序列号 38、 序列号 39、 序列号 41、 序列号 43 或序列号 45 所示的碱基序列。 11. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用探针具有序列 号 4、 序列号 6、 序列号 8、 序列号 10、 序列号 44 或序列号 12 所示的

13、碱基序列。 12.一种多态性检测方法， 通过使用权利要求1所述的多态性检测用探针来检测CYP3A 基因的多态性。 13. 根据权利要求 12 所述的多态性检测方法， 包括 ： (I) 使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触， 从而使所述多态性检测用探 权 利 要 求 书 CN 102676652 A 3 3/3 页 4 针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体 ； (II) 通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度， 来使所述杂交体形成体解离， 并 测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动 ； (III) 基于所述荧光信号的变动来测定 Tm 值， 该 Tm 值是杂交体形成体的解离温度

14、 ； 以 及 (IV) 基于所述 Tm 值来检测所述试样中的单链核酸中的 CYP3A 基因的多态性的存在。 14. 根据权利要求 13 所述的多态性检测方法， 其中， 还包括 ： 在所述 (I) 之前或者与 (I) 同时扩增核酸。 15. 一种药剂的药效评价方法， 包括 ： 利用权利要求 12 所述的多态性检测方法来检测 CYP3A 基因的多态性 ； 以及 基于检测的多态性的有无来评价对药剂的耐性或者药剂的药效。 16. 一种多态性检测用试剂盒， 用于检测 CYP3A 基因的多态性， 所述多态性检测用试剂 盒包括权利要求 1 所述的多态性检测用探针。 17. 根据权利要求 16 所述的多态性检

15、测用试剂盒， 还包括 ： 用于扩增含有与所述多态性检测用探针杂交的序列的区域的引物。 权 利 要 求 书 CN 102676652 A 4 1/37 页 5 CYP3A 基因的多态性检测用探针、 多态性检测方法、 药效评 价方法以及多态性检测用试剂盒 0001 相关申请的交叉引用 0002 本申请主张以 2011 年 3 月 9 日申请的日本申请特愿 2011-051631 为基础的优先 权， 将其全部公开并入本文。 技术领域 0003 本发明涉及 CYP3A 基因的多态性检测用探针、 多态性检测方法、 药效评价方法以 及多态性检测用试剂盒。 背景技术 0004 CYP( 细胞色素 P450)

16、 为与类固醇激素等的生物物质的代谢、 药物以及环境污染物 质等的氧化解毒反应相关的氧化酶。CYP 形成含有多种分子种的超家族， 其中， 已知 CYP3A4 和CYP3A5存在例如影响医药的代谢的多态性(Human Mutation， 2004年， Vol.23， Issue 1， p.100-108)。 0005 编码 CYP3A5 的 CYP3A5 基因位于人的第 7 染色体。并且， 例如已知 CYP3A5 基因 的部分序列 ( 序列号 1) 中的第 401 位的碱基 (r) 存在从腺嘌呤 (a) 向鸟嘌呤 (g) 的突变 (CYP3A5*3) 等 (Clin.Pharmacol.Ther.

17、， 2006 年， Vol.80， p.179-191 等 )。由于该碱基的 突变而产生剪接异常， CYP3A5 的表达大幅降低。 0006 另外， 编码 CYP3A4 的 CYP3A4 基因位于人的第 7 染色体。并且例如已知 CYP3A4 基 因的部分序列 ( 序列号 2) 中的第 201 位的碱基 (s) 存在从胞嘧啶 (c) 向鸟嘌呤 (g) 的突 变 (CYP3A4*16) 等 (Clin.Pharmacol.Ther.， 2006 年， Vol.80， p.179-191 等 )。由该碱基的 突变， CYP3A4 的第 185 位的苏氨酸 (T) 突变为丝氨酸 (S)。 0007

18、例如报告了这些突变与免疫抑制剂他克莫司 (tacrolimus) 等药物代谢的关联 (Clin.Pharmacol.Ther.， 2006 年， Vol.80， p.179-191)。因此， 通过检测 CYP3A 基因中的这 些多态性， 例如有可能能够以更高的灵敏度预测耐药性。 0008 现在， 作为检测基因的多态性的方法， 例如， 已知有 PCR( 聚合酶链式反 应 )-RFLP( 限制性片段长度多态性 ) 法等 (Genet.Mol.Res.， 2010 年， 第 9 卷， 第 1 号， p.34-40)。 该方法使用设计为扩增含有检测目标碱基的部分的引物进行PCR， 使用因所述特 定碱基

19、中的突变的有无而切断与否不同的限制性内切酶切断， 之后通过电泳检测有没有被 切断的方法。 0009 另外， 还已知在用 PCR 法扩增含有突变的区域之后， 使用荧光染料标记的核酸探 针进行熔解曲线分析， 并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变的方法 ( 参见专 利文献 2 ： 日本特开 2002-119291)。 发明内容 0010 但是， CYP3A基因的突变中如前所述， 存在各种突变。 因此， PCR-RFLP法需要在PCR 说 明 书 CN 102676652 A 5 2/37 页 6 反应之后， 提取扩增产物， 进行限制性内切酶处理。因此， 所述扩增产物有可能混入到之后 的反应系

20、统中， 并由此有时会得到假阳性和假阴性的结果。另外， 在 PCR 结束之后， 用限制 性内切酶进行处理， 之后再进行电泳， 因此存在到检测为止需要的时间非常长的情况。另 外， 由于操作复杂， 难以自动化。根据这些现状， 为了检测 CYP3A 基因的多态性， 期待进一步 的技术开发。 0011 本发明的课题为提供一种能够以高灵敏度简便检测 CYP3A 基因的多态性的多态 性检测用探针， 使用该探针的多态性检测方法。 另外， 本发明的课题为提供使用了所述多态 性检测方法的药效评价方法。而且， 本发明的课题为提供使用了所述多态性检测用探针的 多态性检测用试剂盒。 0012 本发明如下所述。 0013

21、 一种多态性检测用探针， 用于检测 CYP3A 基因的多态性， 所述多态性检测用探 针是从包括下述 P1、 P1 、 P2、 P2 、 P3、 P3 、 P4、 P4 、 P5 和 P5 的组中选择的一种荧光标记 寡核苷酸 ： 0014 (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 1 所示的序列中第 401 位第 411 位的 碱基的碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为胞 嘧啶之外相对于具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且 其中与序列号 1 所示的序列中的第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ；

22、0015 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 1 所示的序列中第 401 位第 411 位 的碱基的、 碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为 胞嘧啶之外， 与具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且 其中与序列号 1 所示的序列中第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 0016 (P2) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 2 所示的序列中第 201 位第 205 位的 碱基的碱基长为 5 50 的序列， 其除了与序列号 2 中的第 205 位的碱基对应的碱基为胞嘧 啶之外， 相对于具有与序

23、列号 2 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且 其中与序列号 2 所示的序列中的第 205 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 0017 (P2 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 2 所示的序列中第 201 位第 205 位 的碱基的碱基长为 5 50 的序列， 其除了与序列号 2 中的第 205 位的碱基对应的碱基为胞 嘧啶之外， 与具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且其 中与序列号 2 所示的序列中的第 205 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 0018 (P3) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中的第 1

24、90 位第 201 位的碱基的碱基长为 12 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 190 位的碱基 互补的碱基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 2 的互补链相同的碱基的碱基序列具有至 少 80以上的同一性， 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 190 位的碱基互补的碱基用 荧光染料标记 ； 0019 (P3 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中第 190 位第 201 位的碱基的碱基长为 12 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 190 位的碱基 互补的碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，

25、 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 190 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记 ； 0020 (P4) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 2 所示的序列中第 186 位第 201 位 说 明 书 CN 102676652 A 6 3/37 页 7 的碱基的碱基长为 16 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 186 位的碱基互 补的碱基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 2 的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 186 位的碱基互补的碱基用荧 光染料标记 ； 0021 (P4 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有

26、序列号 2 所示的序列中的第 186 位第 201 位的碱基的碱基长为 16 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 2 中的第 186 位的碱基 互补的碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序列号 2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交， 并且其中与序列号 2 所示的序列中的第 186 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记 ； 0022 (P5) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 3 所示的序列中第 496 位第 501 位 的碱基的碱基长为 6 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 3 中的第 496 位的碱基互 补的碱基为胞嘧啶之外， 相对于具有与序列号 3 的互补链相同的碱基的碱基序列具

27、有至少 80以上的同一性， 并且其中与序列号 3 所示的序列中的第 496 位的碱基互补的碱基用荧 光染料标记 ； 0023 (P5 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是与含有序列号 3 所示的序列中第 496 位第 501 位的碱基的碱基长为 6 50 的序列互补的序列， 其除了与序列号 3 中的第 496 位的碱基互 补的碱基为胞嘧啶之外， 与具有与序列号 3 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交， 并 且其中与序列号 3 所示的序列中第 496 位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。 0024 根据 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸识别序列号 1 中的第 401 位的碱基的多态

28、性。 0025 根据 或 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在从 3 末端起数第 1 3 位具有用所述荧光染料标记的所述碱基。 0026 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡 核苷酸在 3 末端具有用所述荧光染料标记的所述碱基。 0027 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡 核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光， 并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增 加。 0028 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡 核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光， 在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。 002

29、9 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述 P1 和 P1 荧 光标记寡核苷酸的碱基长为 15 30 碱基长， 所述 P2 和 P2 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 10 30 碱基长， 所述 P3 和 P3 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 12 40 碱基长， 所述 P4 和 P4 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 16 40 碱基长， 所述 P5 和 P5 荧光标记寡核苷酸的碱 基长为 10 40 碱基长。 0030 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述 P1 和 P1 的 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 15 20 碱基长， 所述 P2 和 P2 荧光标记寡核苷酸的碱基长

30、 为 10 20 碱基长， 所述 P3 和 P3 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 15 30 碱基长， 所述 P4 和 P4 荧光标记寡核苷酸的碱基长为 20 30 碱基长， 所述 P5 和 P5 荧光标记寡核苷酸的 碱基长为 20 30 碱基长。 0031 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测 说 明 书 CN 102676652 A 7 4/37 页 8 用探针是用于分析熔解曲线的探针。 0032 根据中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测 用探针具有序列号 37、 序列号 38、 序列号 39、 序列号 41、 序列号 43 或序列号 45 所

31、示的碱基 序列。 0033 根据 中任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 具有序列号 4、 序列号 6、 序列号 8、 序列号 10、 序列号 44 或序列号 12 所示的碱基序列。 0034 一种多态性检测方法， 通过使用中任意一项所述的多态性检测用 探针来检测 CYP3A 基因的多态性。 0035 根据 所述的多态性检测方法， 包括 ： 0036 (I) 使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触， 从而使所述多态性检测 用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体 ； 0037 (II) 通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度， 来使所述杂交体形成体解 离， 并测定基于所述杂交体形

32、成体的解离的荧光信号的变动 ； 0038 (III) 基于所述荧光信号的变动来测定 Tm 值， 该 Tm 值是杂交体形成体的解离温 度 ； 以及 0039 (IV) 基于所述 Tm 值来检测所述试样中的单链核酸中的 CYP3A 基因中的多态性的 存在。 0040 根据所述的多态性检测方法， 其中， 还包括 ： 在所述(I)之前或者与(I) 同时扩增核酸。 0041 一种药剂的药效评价方法， 包括 ： 利用 所述的多态性检测方法来检测 CYP3A 基因的多态性 ； 以及基于检测的多态性的有无来评价对药剂的耐性或者药剂的药 效。 0042 一种多态性检测用试剂盒， 用于检测 CYP3A 基因的多态

33、性， 所述多态性检测 用试剂盒包括 中任意一项所述的多态性检测用探针。 0043 根据 所述的多态性检测用试剂盒， 还包括用于扩增含有与所述多态性 检测用探针杂交的序列的区域的引物。 0044 根据本发明， 能够提供可高灵敏度且简便地检测 CYP3A 的多态性的多态性检测用 探针、 使用该探针的多态性检测方法。 另外， 本发明能够提供使用了该多态性检测方法的药 效评价方法。 而且， 本发明能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。 此 外， 本发明例如不局限于医疗领域， 能够应用于生物化学等广泛领域中的 CYP3A 基因的多 态性检测。 附图说明 0045 图 1A 和 1B 是本

34、发明的实施例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0046 图 2A 和 2B 是本发明的实施例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0047 图 3A 和 3B 是本发明的实施例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0048 图 4 是本发明的实施例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0049 图 5A 和 5B 是本发明的实施例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0050 图 6A 和 6B 是本发明的实施例 2 涉及的试样的熔解曲线 ； 说 明 书 CN 102676652 A 8 5/37 页 9 0051 图 7A 和 7B 是本发明的实施例 3 涉及的试样的熔解曲线 ； 0052 图 8A 和 8B 是比较

35、例 1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0053 图 9A 和 9B 是比较例 2 涉及的试样的熔解曲线 ； 0054 图 10A 10C 是本发明的实施例 4 涉及的试样的熔解曲线 ； 0055 图 11A 和 11B 是本发明的实施例 4 涉及的试样的熔解曲线 ； 0056 图 12A 12C 是本发明的实施例 4 涉及的试样的熔解曲线 ； 0057 图 13A 和 13B 是本发明的实施例 5 涉及的试样的熔解曲线 ； 0058 图 14 是比较例 3-1 涉及的试样的熔解曲线 ； 0059 图 15 是比较例 3-2 涉及的试样的熔解曲线。 具体实施方式 0060 本发明涉及的CYP3A基因

36、的多态性检测用探针(以下， 有时仅称 “多态性检测用探 针” ) 为用于检测 CYP3A 基因的多态性的多态性检测用探针， 所述多态性检测用探针为从包 括所述 P1、 P1 、 P2、 P2 、 P3、 P3 、 P4、 P4 、 P5 和 P5 的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸。 0061 本发明涉及的 CYP3A 基因多态性检测方法为包括使用至少一种用于检测所述 CYP3A 基因的多态性的多态性检测用探针来检测 CYP3A 基因的多态性的方法。 0062 本发明涉及的药剂的药效评价方法为包括通过所述 CYP3A 基因多态性检测方法 检测 CYP3A 基因的多态性、 以及基于检测的多态性的有

37、无来评价对药剂的耐性或者药剂的 药效的方法。 0063 本发明涉及的多态性检测用试剂盒含有用于检测 CYP3A 基因的多态性的多态性 检测用探针。 0064 本发明涉及的 “CYP3A 基因” 已经是公知的。CYP3A5 基因的碱基序列是指 NCBI 的 登录号 No.NC000007.13 的 99245813 99277621 的序列。表示 CYP3A5 基因的部分序列的 序列号1为NCBI的dbSNP的登录号No.NG007938的66837483的序列。 CYP3A4基因的碱 基序列是指 NCBI 的登录号 No.NC000007.13 的 99354583 99381811 的序列。

38、表示 CYP3A4 基因的部分序列的序列号 2 为 NCBI 的 dbSNP 的登录号 No.NG008421 的 15519 15928 的 序列， 表示 CYP3A4 基因的部分序列的序列号 3 为 NCBI 的 dbSNP 的登录号 No.NT007933.14 的 24616172 24616872 序列。序列号 1 3 的碱基序列中， r 表示 a 或 g， s 表示 c 或 g， w 表示 a、 t 或 u， v 表示 g、 a 或 c。 0065 CYP3A5 基因的野生型中， 与序列号 1 所示的序列中第 401 位对应的碱基 (r) 为 A( 腺嘌呤 )， 突变型中， 所述碱

39、基 (s) 突变成 G( 鸟嘌呤 )。以下， 将序列号 1 的 CYP3A5 基因 的所述多态性称为 “CYP3A5*3 多态性” 。CYP3A4 基因的野生型中， 与序列号 2 所示的序列中 第 201 位对应的碱基 (s) 为 C( 胞嘧啶 )， 突变型中， 所述碱基 (s) 突变为 G( 鸟嘌呤 )。以 下， 将序列号 2 的 CYP3A4 基因的所述多态性称为 “CYP3A4*16 多态性” 。 0066 CYP3A4 基因的野生型中， 与序列号 3 所示的序列中的第 501 位对应的碱基 (r) 为 A( 腺嘌呤 )， 突变型中， 所述碱基 (r) 突变为 G( 鸟嘌呤 )。以下，

40、将序列号 3 的 CYP3A4 基因 的所述多态性称为 “CYP3A4*1B 多态性” 。 0067 在CYP3A基因中， 若所述3处的多态性中至少一处为前述那样的突变型， 则可以判 断为例如存在免疫抑制剂 tacrolimus 等的药物代谢降低的可能性。 说 明 书 CN 102676652 A 9 6/37 页 10 0068 本发明中， 关于作为检测对象的试样中的试样核酸、 多态性检测用探针或者引物 的每个的序列， 基于它们的相互互补的关系所记述的事项， 只要不特别指出， 也适用于各个 序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列 时， 由该互补的序列识别

41、的序列， 在本领域技术人员的技术常识的范围内， 视为将说明书全 体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。 0069 本发明中，“Tm 值” 是指双链核酸解离的温度 ( 解离温度 ： Tm)， 一般定义为 260nm 处的吸光度达到吸光度总上升量的50时的温度。 即， 当加热含有双链核酸、 例如双链核酸 DNA 的溶液时， 260nm 处的吸光度上升。这是因为双链核酸 DNA 中的两条双链之间的氢键由 于加热而断裂， 解离成单链 DNA(DNA 的熔解 )。并且， 全部双链核酸 DNA 解离成单链 DNA 时， 其吸光度显示为加热开始时的吸光度 ( 仅双链核酸 DNA 的吸光度 ) 的约

42、 1.5 倍左右， 由此 可以判断熔解完成。Tm 值基于该现象而设定。本发明中的 Tm 值只要不特别指出， 均是指吸 光度达到吸光度总上升量的 50时的温度。 0070 本说明书中 “步骤” 一词， 不仅包含独立的步骤， 而且例如在不能与其他的步骤明 确区别的情况下， 只要达到了本步骤预期的效果， 则包含在本术语之内。 另外， 本说明书中， 使用 “” 表示的数值范围为分别包含 “” 的前后记载的数值作为最小值和最大值的范 围。另外， 在本发明中， 组成物中的各成分的量， 在所述组成物中存在多种相当于各成分的 物质的情况下， 只要不特别指出， 意思是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。 本

43、发 明中， 关于寡核苷酸的序列， 当称为 “从 3 末端起数的第 1 3 位” 时为以寡核苷酸链的 3 末端为第 1 位起数的。 0071 0072 本发明涉及的CYP3A基因的多态性检测用探针为用于检测CYP3A基因的多态性的 多态性检测用探针， 该多态性检测用探针为从包括所述 P1、 P1 、 P2、 P2 、 P3、 P3 、 P4、 P4 、 P5 和 P5 的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸。 0073 CYP3A5 基因的野生型中， 与序列号 1 所示的序列中的第 401 位对应的碱基 (r) 为 A( 腺嘌呤 )， 突变型中， 所述碱基 (r) 突变成 G( 鸟嘌呤 )。以下， 将

44、序列号 1 的 CYP3A5 基因 的所述多态性称为 “CYP3A5*3 多态性” 。以下也将检测该多态性的探针称为 CYP3A5*3 用探 针。 0074 本发明中， 从包括所述 P1 和 P1 的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸 ( 以下也称 为 “所述 (P1) 或 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸” 。) 为能够检测序列号 1 所示的碱基序列的第 401 位的碱基中的多态性的探针。 0075 本发明的所述 P1 的荧光标记寡核苷酸具体而言为含有序列号 1 所示的序列中的 第 401 位第 411 位的碱基的序列。在所述 P1 荧光标记寡核苷酸中， 例如与序列号 1 所示 的碱基序列的第 40

45、1 位的碱基对应的碱基 (r) 可以为 A， 也可以为 G。 0076 (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 1 所示的序列中第 401 位第 411 位的 碱基的碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为胞 嘧啶之外， 相对于具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并 且与序列号 1 所示的序列中第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 0077 本发明的所述 P1 的荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基 对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外， 相对于具有与序列号 1 相同的碱基

46、的碱基序列具有同一 说 明 书 CN 102676652 A 10 7/37 页 11 性。具体而言， 本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对 应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外， 相对于具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列， 显示出 80 以上的同一性。另外， 从检测灵敏度的观点来说， 例如， 也可以显示出 85以上的同一性， 90以上的同一性， 95以上的同一性， 96以上的同一性， 97以上的同一性， 98以上 的同一性或者 99以上的同一性。另外， 所述 P1 荧光标记寡核苷酸进一步优选如下 ： 其除 了与序列号 1 中的第 411 位的碱基

47、对应的碱基为 C( 胞嘧啶 )， 并且与第 401 位的碱基对应 的碱基为r(A或G)之外， 相对于具有与序列号1相同的碱基的碱基序列具有同一性。 这里， “具有与序列号相同的碱基的碱基序列” 是指， 改变了的所述探针中出现的所述序列号中的 序列中的区域。 0078 本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸例如在与序列号 1 的第 401 位的碱基对应的 碱基为突变型的 G 的情况下， 例如可以说 ： 在本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸和除了与 序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外具有与序列号 1 相同的碱基 的碱基序列进行比较时其同一性低于 80的情况下，

48、 对于含有突变型的 CYP3A5 基因的试 样核酸的检测灵敏度变低。 0079 作为本发明涉及的所述P1荧光标记寡核苷酸， 例如也可以是识别序列号1中的第 401 位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基 序列之外， 还具有识别序列号 1 中的第 401 位的碱基的多态性的功能。因此所述荧光标记 寡核苷酸例如在与序列号 1 的第 401 位的碱基对应的碱基为突变型 G 的情况下， 具有针对 含有突变型的 CYP3A5 基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。 0080 本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对 应的碱基

49、为 C( 胞嘧啶 ) 之外， 还与具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨 条件下杂交。在所述 P1 荧光标记寡核苷酸中， 例如与序列号 1 所示的碱基序列的第 401 位的碱基对应的碱基 (r) 可以为 A， 也可以为 G。 0081 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其是含有序列号 1 所示的序列中第 401 位第 411 位 的碱基的碱基长为 11 50 的序列， 其除了与序列号 1 中的第 411 位的碱基对应的碱基为 胞嘧啶之外， 与具有与序列号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且 其中与序列号 1 所示的序列中第 411 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 0082 所述杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法， 例如 Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab.Press， 2001) 中记载的方法 等来进行。该文献通过参照并入本说明书。 0083 严谨条件是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨 条件例如可以举出在钾浓度约 25mmol/L 约 50mmol/L 以及镁浓度约 1.0mmo