耐热性相关蛋白及其编码基因与应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101585871 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101585871 B *CN101585871B* (21)申请号 200910087896.0 (22)申请日 2009.06.25 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/81(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100094 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (

2、72)发明人 孙其信 秦丹丹 彭惠茹 倪中福 姚颖垠 梁荣奇 解超杰 刘志勇 杜金昆 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 CN 101434645 A,2009.05.20, 全文 . 张毅等 . 条锈菌诱导的小麦 MBF1 转录辅 激活因子基因的克隆及其特征分析 .作物学 报 .2009, 第 35 卷 ( 第 1 期 ),11 17. FJ800577.1.Triticum aestivum multiprotein bridging factor1(MBF1)mRNA, complete cds.Genbank .2009, Danda

3、n Qin,etc.Heat stress-responsive transcriptome analysis in heat susceptible and tolerant wheat (Triticum aestivum L.) by using Wheat Genome Array.BMC Genomics .2008,432. (54) 发明名称 耐热性相关蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种耐热性相关的蛋白及其编 码基因。本发明所提供的耐热性相关的蛋白， 名 称为TaMBF1c(Triticum aestivum Multiprotein Binding Fac

4、torlc)， 来源于普通小麦 (Triticum aestivum L.)， 是如下1)或2)的蛋白质 ： 1)由序 列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个 或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且与耐热性相关的由1)衍生的蛋白质。 耐热相关 蛋白 TaMBF1c 及其编码基因对于培育抗逆性提高 的作物、 林草等新品种具有重要的理论及实际意 义， 可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植 物品种的培育与鉴定。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 毛颖 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 (19)中

5、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种蛋白， 是由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 2. 权利要求 1 所述蛋白的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述蛋白的编码基因为序列表中序 列 1 的自 5末端第 1095-1565 位脱氧核糖核苷酸所示的编码区。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的重组载体或重组菌。 5. 根据权利要求 4 所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为在 pYES2 的多克隆 位点间插入权利要求 2 或 3 所述编码基因

6、得到的重组表达载体。 权 利 要 求 书 CN 101585871 B 2 1/8 页 3 耐热性相关蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种与抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一种与耐 热性相关的蛋白及其编码基因 TaMBF1c 与应用。 背景技术 0002 随着全球人口的增加， 对粮食的需求日益增加。 作为世界范围内主要的粮食作物， 小麦生育后期的高温胁迫严重影响着其产量和品质， 给人们的生活带来了很大的影响， 因 此我们迫切需要研究小麦耐热性的机理， 开发耐热相关基因， 并将它们应用到小麦育种， 从 而培育出耐热品种。 0003 Multiprotein

7、bridging factor 1(MBF1)， 作为一种转录共激活子， 可以通过连 接TATA-Box Binding Protein(TBP)和某种转录因子激活依赖于该转录因子的下游基因的 表达。虽然 MBF1 家族基因最早在蚕中发现， 但对这类基因的特性以及功能的研究主要集中 在植物， 特别是拟南芥中。而拟南芥中的研究表明 AtMBF1c 基因可能通过影响体内乙烯途 径、 水杨酸途径以及海藻糖途径提高植株的耐热性。在小麦中仅有关于 TaMBF1a 基因的表 达受病原菌侵染诱导的报道， 还未有关于小麦该家族基因与耐热性关系的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种耐热性相关的蛋白

8、及其编码基因。 0005 本 发 明 所 提 供 的 耐 热 性 相 关 的 蛋 白，名 称 为 TaMBF1c(Triticum aestivumMultiprotein Bridging Factorlc)， 来源于普通小麦 (Triticum aestivum L.)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ： 0006 1) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0007 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加且与耐热性相关的由 1) 衍生的蛋白质。 0008 为了使 1) 中的 TaMBF1c 便于纯化， 可在由序列表

9、中序列 2 所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0009 表 1. 标签的序列 0010 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK 说 明 书 CN 101585871 B 3 2/8 页 4 c-myc 10 EQKLI SEEDL 0011 上述2)中的TaMBF1c可人工合成， 也可先合成编码基因， 在进行生物表达得到。 上 述2)中的TaMBF1c的编码基因可通过将

10、序列表中序列1自5末端第1095-1565位碱基所 示的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错 义突变， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0012 上述与抗逆性相关蛋白的 DNA 基因也属于本发明的保护范围。 0013 与耐热性相关的蛋白的 DNA 基因为如下 1)-4) 中任一所述的基因 ： 0014 1) 其编码序列是序列表中序列 1 的自 5末端第 1095-1565 位脱氧核糖核苷酸 ； 0015 2) 其核苷酸序列是序列表中的序列 1 ； 0016 3) 在严格条件下与序列表中序列 1 的自

11、5末端第 1095-1565 位脱氧核糖核苷酸 杂交且编码权利要求 1 所述蛋白的 DNA 分子 ； 0017 4) 与 1) 或 2) 的基因具有 90以上的同源性且编码权利要求 1 所述蛋白的 DNA 分子。 0018 序列表中的序列 1 由 1761 个碱基组成， 其开放阅读框架 (ORF) 为自 5末端第 1095-1565 位碱基， 编码具有序列表中序列 2 的氨基酸序列的 TaMBF1c 蛋白。 0019 上述严格条件可为用0.1SSPE(或0.1SSC)， 0.1SDS的溶液， 在DNA或者RNA 杂交实验中 65下杂交并洗膜。 0020 序列表中的序列 1 由 1761 个脱氧

12、核苷酸组成。自 5端第 1 位至 1094 位脱氧核 苷酸为启动子区， 自 5端第 1095 位至 1565 位脱氧核苷酸为编码框序列， 编码具有序列表 中序列 2 的氨基酸残基序列的蛋白质。自 5端第 1566 位至 1761 位脱氧核苷酸为 3端 非翻译区序列。 0021 序列表中的序列 2 由 156 个氨基酸残基组成， 含有两个结构域， 其中 N 端 ( 序列 2 的自氨基端第 12 位至 83 位氨基酸残基 ) 编码 Multiprotein Bridging Factor 1(MBF1) 结构域， C 端 ( 序列 2 的自氨基端第 90 位至 142 位氨基酸残基 ) 编码螺旋

13、- 转角 - 螺旋 (Helix-Turn-Helix_XRE， HTH_XRE) 结构域。 0022 扩增上述 TaMBF1c 基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 0023 含有上述与抗逆性相关蛋白编码基因的重组载体、 转基因细胞系和重组菌也属于 本发明的保护范围。 0024 其中， 上游引物和下游引物之间的距离在 50 到 5000 个碱基之间 ； 该引物对中的 每一个引物的长度为 15 到 30 个碱基。如， 引物 1 ： 5 -AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3 ； 引物 2 ： 5 -ACCACAAAGCAACCCGAGA-3 。 0025 使用 TaMB

14、F1c 基因构建重组表达载体时， 可在其转录起始核苷酸前加上任何一种 增强型、 组成型、 组织特异型或诱导型启动子， 如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 泛素 (Ubiquitin) 基因启动子 (pUbi) 等， 它们可单独使用或与其它的启动子结合使用 ； 此外， 使 用本发明的基因构建表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增 强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相 同， 以保证整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是 天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起

15、始区域或结构基因。 说 明 书 CN 101585871 B 4 3/8 页 5 0026 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS 基因、 GFP 基因、 萤光素酶基因等 )、 具有抗性的抗生素标记物 ( 庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等 ) 或是 抗化学试剂标记基因 ( 如抗除莠剂基因 ) 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选 择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。 0027 所述重组表达载体具体可为在植物表达载体 pYES2 的多克隆位点间插入上述与 抗逆性相关蛋白的编码

16、基因得到的重组表达载体， 如 TaMBF1c-pYES2。 0028 携带有本发明的与耐热性相关蛋白编码基因 TaMBF1c 的植物表达载体可通过 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方 法转化到植物细胞或组织中。 被转化的植物宿主可以是水稻、 小麦、 拟南芥、 非洲菊、 矮牵牛 或马铃薯等。 0029 本发明还提供了上述与耐热性相关蛋白编码基因 TaMBF1c 在制备耐热重组酵母 中的应用。 0030 利用可以引导外源基因在酵母中表达的载体， 将本发明的 TaMBF1c 基因导入酵母 细胞， 将 TaMBF1c 基因过表

17、达， 酵母表现为对高温胁迫的抗性增强。说明 TaMBF1c 是与耐热 性相关的蛋白。与耐热相关蛋白 TaMBF1c 及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、 林草 等新品种具有重要的理论及实际意义， 可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种 的培育与鉴定。 0031 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 附图说明 0032 图 1 为 TaMBF1c 基因在热胁迫下的诱导表达模式。 0033 图 2 为 TaMBF1c 基因在其它非生物胁迫及激素处理下的诱导表达模式。 0034 图 3 为 TaMBF1c 与 GFP 的融合蛋白在热胁迫前后的亚细胞定位结果。 0035 图 4 为转化 T

18、aMBF1c-pYES2 和 pYES2 的酵母细胞在热胁迫条件下的生长状况。 具体实施方式 0036 下述实验方法如无特别说明均为常规方法。 0037 实施例 1、 TaMBF1c 基因的克隆 0038 (1) 小麦 TaMBF1c 基因序列的电子克隆 0039 以Affymetrixwheat Genome array中探针号为Ta.12225.1.S1_x_at 的序列为基础序列， 在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上进行ORF finder分析， 发现该 序列已包含完整的 ORF 序列， 以此序列为基础设计基因特异引物。 0040 (2) 小麦 TaMBF1c

19、基因的 cDNA 及非翻译区序列克隆 0041 根 据 电 子 克 隆 得 到 的 序 列 设 计 引 物，所 用 引 物 对 为 TaMBF1c-1 ： 5 -AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3 和 TaMBF1c-2 ： 5 -ACCACAAAGCAACCCGAGA-3 。 0042 实验材料为普通小麦品种 TAM107(Triticum aestivum L)， 即 5 分钟， 再用蒸馏 水冲洗 3 遍， 置于常温萌动 24 小时。挑选萌动一致的种子转移至铺有三层湿润滤纸的培 养皿中， 置于培养箱中 ( 正常生长条件为白天 / 晚上， 22/18， 12h/12h， 湿度 60

20、 ) 生长 说 明 书 CN 101585871 B 5 4/8 页 6 10 天。将生长十天的幼苗转移至 40的培养箱中， 处理 1 个小时后， 取叶片迅速置于液氮 中， -80保存， 待用。 0043 以上述叶片为材料进行 RNA 提取并反转录为 cDNA 作为模板进行 PCR 扩增， PCR 产物经过测序验证后， 得到 TaMBF1c 基因的 ORF 区段。利用 BD GenomeWalkerTM UniversalKit( 购自 Clontech 公司 ) 得到 5 端的启动子区域 1094bp， 全序列信息见序列 分析表中的序列 1， 登录 Plantcare(http:/bioin

21、formatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/) 网站对该区域所包含的顺式作用成分进行了分析， 见表 2 ； TaMBF1c 的 ORF 序列编码的蛋白质序列如序列表中的序列 2， 共含有两个保守的结构域， 其中 N 端 ( 序列 2 的自氨基端第 12 位至 83 位氨基酸残基 ) 编码 Multiprotein Bridging Factor 1(MBF1) 结构域， C 端 ( 序列 2 的自氨基端第 90 位至 142 位氨基酸残基 ) 编码螺旋 - 转 角 - 螺旋 (Helix-Turn-Helix_XRE， HLH_XRE) 结构

22、域。并且 TaMBF1c 基因是一个不含有内 含子的转录共激活子。 0044 表 2 TaMBF1c 启动子区域所包含的顺式作用元件及其数目 0045 0046 实施例 2、 TaMBF1c 基因在高温胁迫下的诱导表达模式 0047 将如上所述在正常条件下生长十天的小麦幼苗进行如下的热胁迫处理 ： (1) 直接 在 40高温条件处理 0.25、 0.5、 1、 2、 12 和 24 小时， 分别命名为 0.25h、 0.5h、 1h、 2h、 12h 和 24h ； (2)34热锻炼 3 小时后 40高温处理 0.25、 0.5、 1 和 2 小时， 分别命名为 0.25sh、 0.5sh、

23、1sh 和 2sh ； (3)34热锻炼 3 小时后， 正常条件下恢复生长 0、 1、 2 和 12 小时， 分别命 名为3s、 1sc、 2sc和12sc， 未进行任何高温处理的材料命名为ck。 取处理后的叶片， 提取RNA 进行 Northern 杂交。用引物对 TaMBF1c-1 ： 5 -AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3 和 TaMBF1c-3 ： 0048 5 -CGGAGGCATTCTTGTTCGTC-3 扩增 TaMBF1c 基因的片段并回收， 利用 Takara 公 司的探针标记试剂盒进行探针标记， 用于 Northern 杂交。 0049 结果如图 1 所示， 在

24、正常条件下 (ck)TaMBF1c 不表达或者表达很弱， 而热处理 15 分钟 (0.25h) 便可以诱导它的表达， 且在直接热处理 2 小时达到最高 (2h)。直接热胁迫处 理 (h 系列 ) 比经过热锻炼后处理 (sh 系列 ) 上调明显， 34热锻炼 3 小时 (3s) 可以轻微 诱导它的表达， 且一旦恢复到正常条件 (sc)， 该基因的表达即恢复到正常水平。 0050 实施例 3、 TaMBF1c 基因在其它胁迫下的诱导表达模式 说 明 书 CN 101585871 B 6 5/8 页 7 0051 以 20 PEG-6000、 250mM NaCl、 氧化胁迫 (100M H2O2)

25、 处理， 以及植物激素 ACC(200M)、 ABA(100M)、 MeJA(100M) 分别处理小麦幼苗， 并取不同处理时间的小麦叶 片， 提取 RNA 进行 Northern 杂交， 所用探针以及标记方法同上。其中胁迫处理的具体方法 为如下 ： 0052 高盐处理 ： 在培养瓶中加入 NaCl 溶液至终浓度为 250mM。 0053 PEG 处理 ： 在培养瓶中加入 PEG-6000 溶液至终浓度为 20 ( 质量百分含量 )。 0054 ABA处理 ： 把ABA(分析纯， 购自Sigma-aldrich)溶解在DMSO中制成10mM贮存液， 然后加入到培养瓶中至终浓度为 100uM。 0

26、055 ACC 处理 ： 把 ACC 溶解在水中制成 10mM 母液， 然后加到培养瓶中至终浓度 200uM。 0056 MeJA 处理 ： 吸取一定体积的 MeJA( 分析纯， 购自 Sigma-aldrich) 加入水中制成 10mM 母液， 然后加入到培养瓶中至终浓度 100uM。 0057 H2O2处理 ： 吸取一定体积的30的H2O2(购自北京化工厂)加入水中制成100uM的 工作液。 0058 在加入上述溶液以后， 分别在处理 0、 0.5、 1、 6、 12 小时选取小麦的叶片， 迅速置于 液氮中， 于 -80冰箱中保存， 待用。其中 0 小时的样品为每种处理的对照 CK， 同时

27、以未处 理的小麦叶片 ( 即只生长在水中 )， 作为对光周期响应的对照组 CK。 0059 Northern 结果如图 2 所示， TaMBF1c 的表达受干旱胁迫快速且短暂诱导， 在处理 30 分钟时即达到最高， 1 小时后开始减弱。TaMBF1c 可以轻微应答氧化胁迫 (H2O2， 0.5h)、 ABA(1h) 和乙烯合成前体 ACC(0.5h 和 1h)。 0060 实施例 4、 TaMBF1c 基因所编码蛋白在热胁迫前后的亚细胞定位 0061 为验证 TaMBF1c 基因在细胞以及高温胁迫中的作用部位， 将 TaMBF1c 的编 码 区 (5 端 第 1095 位 至 1565 位 脱

28、 氧 核 苷 酸 ) 插 入 pEGAD(Sean R.Cutler， David W.Ehrhardt， Joel S.Griffitts， and Chris R.Somerville Random GFP:cDNA fusions enablevisualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a highfrequency， PNAS， 2000， (97)3718-3723) 的 35S 启动子和绿色荧光蛋白 GFP 基因之 间得到含有 TaMBF1c-GFP 融合基因的重组表达载体 TaMBF1c-p

29、EGAD， 通过 GFP 表达部位确 定蛋白在细胞内的定位情况， 将上述重组质粒转化农杆菌菌株 EHA105， 经叶盘法将包含有 TaMBF1c-pEGAD 转入烟草品种 NC98， 利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光所处的位置。结 果如图3所示， 在正常条件下(图中A)， 可以在细胞膜和细胞壁以及气孔保卫细胞上观察到 荧光， 而经过 37高温处理后 ( 图中 B)， 只能在保卫细胞处观察到荧光。 0062 构建方法如下 ： 以上述叶片的 cDNA 为模板， 利用引物 TaMBF1c-6 ： 0063 5 -TACTGGGTACCATGGAAGGAGCAATGCCGACGG-3 和 TaMBF1

30、c-7 ： 0064 5 -TACTGGGATCCACCACAAAGCAACCCGAGA-3 ， 将得到的TaMBF1c片段插入pYES2(购 自 Invitrogen 公司 ) 的限制型内切酶 kpn I 和 BamHI( 购自 Takara 公司 ) 酶切位点之间， 得到含有 TaMBF1c 编码区片段的重组表达载体 TaMBF1c-pYES2。 0065 实施例 5、 TaMBF1c 基因的表达增强真核生物酵母细胞的抗逆性 0066 为了验证 TaMBF1c 在真核生物耐热性中的作用， 将其与 pYES2 载体 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 进行连接构建了酵母表达载体 TaM

31、BF1c-pYES2。构建方法如下 ： 以上述 叶片的 cDNA 为模板， 利用引物 TaMBF1c-6 ： 说 明 书 CN 101585871 B 7 6/8 页 8 0067 5 -TACTGGGTACCATGGAAGGAGCAATGCCGACGG-3 和 TaMBF1c-7 ： 0068 5 -TACTGGGATCCACCACAAAGCAACCCGAGA-3 ， 将得到的TaMBF1c片段插入pYES2(购 自Invitrogen公司)的限制型内切酶kpn I和Bam HI(购自Takara公司)酶切位点之间， 得到含有 TaMBF1c 编码区片段的重组表达载体 TaMBF1c-pYE

32、S2。 0069 利用醋酸锂法制备转化了重组表达载体TaMBF1c-pYES2的酵母菌株INVSc1(购自 Invitrogen 公司 )， 作为实验组。挑选在缺失培养基 SD-Ura(Minimal SD Base 和 -UraDO supplement 均购自 Clontech 公司 ) 上表现为阳性的克隆， 按照 Invitrogen 公司提供的技 术手册进行基因的诱导表达 20 小时后， 各取 1ml 在水浴锅中分别进行 30、 45和 48 的高温胁迫处理 1 小时， 将不同温度处理后的酵母细胞分别稀释 1、 10、 100 和 1000 倍， 取 20l 点于缺失培养基 SD-Ur

33、a(Clontech) 上， 在 30倒置培养 2-3 天待出现克隆， 观察并 记录结果， 从而进行酵母的耐热性评价。同时， 利用醋酸锂法制备转空载体 (pYES2) 的酵母 菌株 INVSc1 作为对照组， 进行与实验组相同的耐热胁迫处理。 0070 结果如图 4 所示， 在正常生长条件下 (30 )， 转空载体 (pYES2) 对照组及转重组 表达载体 TaMBF1c-pYES2 的酵母的生长趋势没有显著差别 ； 在温度提高到 45后， 两者的 生长趋势仍没有显著差别 ； 而进行 1 小时的 48热胁迫后， 转空载体 (pYES2) 酵母的生长 明显受到抑制， 而转重组表达载体 TaMBF

34、1c-pYES2 的酵母虽然生长较温度 30、 45有所 抑制， 但是与转空载体 (pYES2) 的对照组相比， 还是具有明显的生长优势。说明转重组表达 载体 TaMBF1c-pYES2 的酵母比转空载体 (pYES2) 的酵母具有更高的耐热性。 0071 序列表 0072 中国农业大学 0073 耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用 0074 1 0075 1 0076 1761 0077 DNA 0078 小麦 (Triticum aestivum L.) 0079 1 0080 actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtaaaa ttttgccaag g

35、aagtttgat 60 0081 gcacctgtag cactgaatgg cccgttgcac cagatacgtt ctcgtctcga acctccctcc 120 0082 tcattttgct ggacatgcag acgtaggcga ctacatcaca tagagtttga agagtccgtc 180 0083 gagctcctcc cttcgccgcc ccgacctcct ccctccgctg cacctgtgat tctcaagtga 240 0084 tgagctcatt cgccaacctc atacgactca tcccccctat ccctgagctc ca

36、cacctccg 300 0085 ccgactttcg ggatcgactc tctgtccgcc cccgcgcttc tcccgtgccc tccgaactcc 360 0086 tggtcacctt cctacccaag gcctaggccc tcgacctcga ctcgccccgt caactcctcc 420 0087 ttcaagcagc aagctagttt gcctgaacat ttttcctaaa aaacgtaata atctgaaaca 480 0088 tcaccattct tatgtttggg agtgaataca gtaaatcttt gtacttgcta aa

37、ttttatct 540 0089 tctttttttg cgggtgaaat tttatctttt tgtacagaag aagaagacta ctctctctgt 600 0090 aaattaatat aagagcgttt agatcactaa aatagtaatc taaacgctct tatattagtt 660 0091 tatggaggga gtacaaatca acgaattcca gtttcgtgcc gcgcactgaa tttgtttttt 720 说 明 书 CN 101585871 B 8 7/8 页 9 0092 ttaataggaa aggtcacaga attt

38、gaatga gtagtgcgtg accgccaagt accctctcct 780 0093 aggtttaccg tggtatccaa gtttttagac ccatctgcag ccgtccgttc ccctgaactg 840 0094 cctacaatcg acggtgcgca aacaactgac ctctctccca gaaccttcca gaccacacga 900 0095 gtgcacgagc gcgttcagga accttcccga accgcctccc aaccgtcatc gtccacctcc 960 0096 accgtccacg ccctctatat atgc

39、gtcccc accaaaccca atggcacgag aaatgagaaa 1020 0097 gacagaggcg aggagaagaa aaaaatctac aggaaaaaca ggggagaggc agagagaaca 1080 0098 gaagcgaagg agcaatgccg acgggcagga tgagcggcaa catcacgcag gactgggagc 1140 0099 cggtggtgct gcggcgggcg aagcccaagg cggccgacct caagtccgcc aaggcggtga 1200 0100 accaggcgct gcggacgggc

40、gcgccggtgg agacggtgcg caaggcggcg gcggggacga 1260 0101 acaagaatgc ctccgccgcg gccgtggcgg cgcccgcgcg gaagctggac gagatgacgg 1320 0102 agcctgcggg gctggggcgc gtgggcggcg acgtgcgcgc ggccatccag aaggcgcgcg 1380 0103 tggcgaaagg atggagccag gcggagctgg ccaagcgcat caacgagcgg gcgcaggtgg 1440 0104 tgcaggagta cgagagc

41、ggc aaggccgtcc ccgtccaggc cgtgctcgcc aagatggagc 1500 0105 gcgccctcga ggtcaagctc cgcggcaagg cggttggggc gcccgcgccc gccgggacaa 1560 0106 agtgatggtc cgtggggaca tatcctttcc tgtgaatttg tgatgaatgg tagtaaatca 1620 0107 gatctgtaaa tctcgggttg ctttgtggtg gatkgggttg taagtcgtgc aaagkgataa 1680 0108 atctccatgt gaa

42、atttgat gtcaaatcct aaatcctatt gtgagctgat ttgcaatttt 1740 0109 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1761 0110 2 0111 156 0112 PRT 0113 小麦 (Triticum aestivum L.) 0114 2 0115 Met Pro Thr Gly Arg Met Ser Gly Asn Ile Thr Gln Asp Trp Glu Pro 0116 1 5 10 15 0117 Val Val Leu Arg Arg Ala Lys Pro Lys Ala Ala Asp Leu Lys S

43、er Ala 0118 20 25 30 0119 Lys Ala Val Asn Gln Ala Leu Arg Thr Gly Ala Pro Val Glu Thr Val 0120 35 40 45 0121 Arg Lys Ala Ala Ala Gly Thr Asn Lys Asn Ala Ser Ala Ala Ala Val 0122 50 55 60 0123 Ala Ala Pro Ala Arg Lys Leu Asp Glu Met Thr Glu Pro Ala Gly Leu 0124 65 70 75 80 0125 Gly Arg Val Gly Gly As

44、p Val Arg Ala Ala Ile Gln Lys Ala Arg Val 0126 85 90 95 0127 Ala Lys Gly Trp Ser Gln Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ile Asn Glu Arg 0128 100 105 110 0129 Ala Gln Val Val Gln Glu Tyr Glu Ser Gly Lys Ala Val Pro Val Gln 0130 115 120 125 说 明 书 CN 101585871 B 9 8/8 页 10 0131 Ala Val Leu Ala Lys Met Glu Arg Ala Leu Glu Val Lys Leu Arg Gly 0132 130 135 140 0133 Lys Ala Val Gly Ala Pro Ala Pro Ala Gly Thr Lys 0134 145 150 155 说 明 书 CN 101585871 B 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101585871 B 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101585871 B 12