一种超快速核酸检测方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102676636 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676636 A *CN102676636A* (21)申请号 201110053340.7 (22)申请日 2011.03.07 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 美科生物医学技术无锡有限公司 地址 214174 江苏省无锡市经济技术开发区 惠山大道 1619 号 (72)发明人 冯长访 肖乐义 王保君 康飞 蔡颖颖 巩红铃 谢侃 冯晓程 陶建国 (54) 发明名称 一种超快速核酸检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种超快速实时

2、核酸检测方法， 通过提取核酸， 在特殊的缓冲液和圆盘式反应容 器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时 定量检测标本中核酸模板的含量。特殊的缓冲液 和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往 的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短 了， 由原来的1小时以上缩短到现在的5-10分钟， 真正实现了病原体感染的快速检测。具有反应时 间短， 操作简单， 特异性高， 尤其适合用于突发性 急性传染病的检测， 有很高的推广价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图

3、1 页 1/1 页 2 1. 超快速核酸检测方法， 其特征在于 ： 提取核酸， 在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器 中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。 2. 如权利要求 1 所述的超快速核酸检测方法， 其特征在于 ： 所述特殊的缓冲液含有 1-100mg/L 的甜菜碱作为扩增速度促进剂。 3. 如权利要求 1 所述的超快速核酸检测方法， 其特征在于 ： 所述圆盘式反应容器为刻 有凹槽的圆盘， 圆盘直径为 1-30 厘米， 厚度为 0.1-3 毫米， 圆盘上的凹槽数目为 1-200 个， 加样的容积为 1-100 微升。 4. 如权利要求 1 所述的超快速核酸检测

4、方法， 其特征在于 ： 所述圆盘式反应容器， 在加 样后用导热性材料做的封盘膜密封。 5. 上述任一项权利要求所述的内容， 用于任一种核酸的分析及临床检测。 权 利 要 求 书 CN 102676636 A 2 1/3 页 3 一种超快速核酸检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种核酸检测方法， 具体涉及一种超快速核酸实时荧光定量检测方 法。可广泛用于疾病的核酸定量检测， 尤其适合用于突发性传染病的快速检测。 背景技术 0002 1985 年， 美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等人发明了具有划时代意 义的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reac

5、tion， PCR)， 使得人们可以在体外有目的地无 限扩增特定的核酸片段。其原理类似于 DNA 的体内复制， 只是在离心管中给 DNA 的体外合 成提供一种合适条件。 经过多年的发展， 这一技术已经非常成熟， 现在已是分子生物学研究 和临床诊断领域中最重要和最常用的技术。PCR 仪的出现则使该技术实现了自动化， 使得 PCR 的技术应用更加广泛， 例如在诊断遗传性疾患、 检测临床标本中病原体的核酸、 对法医 标本作遗传学鉴定， 以及分析激活癌基因中的突变情况等方而都得到了广泛的应用。与其 同时， 针对不用的应用领域， 核酸检测技术也发展为很多种类型， 其中依赖核酸序列的扩增 和环介导等温扩增

6、方法应用也较广泛。 但是， 核酸检测技术还面临着许多挑战， 现有的核酸 检测技术中整个扩增时间长达一个多小时、 扩增过程也比较复杂， 结果不容易重复， 尤其是 在突发性传染病的检测方面受到了限制。 0003 提高实时荧光定量核酸检测的反应速度， 缩短整个检测时间， 使其更方便地应用 于临床检测， 特别是突发性传染病的检测， 为疾病的治疗和控制赢取宝贵的时间， 则是核酸 检测技术未来的一个重要发展方向。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的缺点， 提供一种反应时间大幅度缩短、 操作简 单的超快速实时荧光定量核酸检测方法， 可普遍用于多种类型标本中核酸的分析及临床检 测。 0005

7、本发明所涉及的超快速实时荧光定量核酸检测方法， 其特征在于 ： 提取核酸， 在特 殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标 本中核酸模板的含量。该检测方法通过以下技术方案实现 ： (1) 核酸模板提取 ： A、 样品处 理 ； B、 核酸分离 ； C、 核酸沉淀 ； D、 核酸洗涤 ； E、 核酸溶解 ； F、 核酸浓度测定 ； G、 核酸电泳检 测。(2) 加样 ： 将模板、 引物、 酶、 特殊缓冲液等加入到圆盘式反应容器。(3) 荧光定量核酸 检测 ： 以特异性引物进行实时荧光 PCR 定量检测标本中核酸的含量。 0006 所述的特殊缓冲液含有 1-10

8、0mg/L 的甜菜碱作为扩增速度促进剂。所述的圆盘式 反应容器为刻有凹槽的圆盘， 圆盘直径为1-30厘米， 厚度为0.1-3毫米， 圆盘上的凹槽数目 为 1-200 个， 加样的容积为 1-100 微升， 比起以往的离心管则加热面积更大， 热传导效率更 高。 特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法 的反应时间大大的缩短了， 由原来的 1 小时以上缩短到现在的 5-10 分钟， 真正实现了病原 体感染的快速检测。 说 明 书 CN 102676636 A 3 2/3 页 4 0007 该技术有以下优点 ： 反应速度超快， 反应时间超短， 由传统的 1 个半小时

9、反应时间 缩短到 5-10 分钟， 极大地提高了检测效率， 赢得了宝贵的治疗时间 ； 高度特异性， 特异的引 物确保反应不受其它因素的干扰， 对序列高度同源的序列也可精确区分 ； 超宽的定量线性 范围和高度的检测灵敏度， 从几个拷贝到几万个拷贝， 定量线性范围跨越 7 个数量级。 0008 综上所述， 本发明所涉及的核酸检测技术操作简单， 反应时间短， 特异性高， 尤其 适合用于突发性急性传染病的检测， 有很高的推广价值。 附图说明 0009 图 1 为实施例 1 的核酸电泳结果 ； 0010 图 2 为实施例 1 的圆盘式反应容器的结构示意图。 0011 图中所示分别为 ： 0012 1、

10、2- 纯化 RNA 样品 3- 封盘膜 4- 加样孔 5- 圆盘位置固定孔 具体实施方式 0013 下面结合附图1和附图2通过一个实例进一步描述本发明所涉及的超快速实时荧 光定量核酸检测方法， 但本发明所涉及的范围并不局限于本实例。 0014 实施例一 0015 人血液中 hsa-miR-29a miRNA 的超快速定量检测 0016 1、 总 RNA 提取 0017 (1) 样品处理 ： 取 100L 500L 血液标本， 加 1mL TRIzol 试剂， 反复混匀 ； 0018 (2)RNA分离 ： 室温放置上述样品液10分钟， 加入氯仿200L， 剧烈振荡约1分钟， 室温静置 5 分钟，

11、 4 12000g 离心 15 分钟， 小心取出样品， 通过观察可以发现样品分三层， 其中最上层含有 RNA 组份 ； 0019 (3)RNA 沉淀 ： 小心吸取上清液约 450L 至含有 600L 冰冷异丙醇的新离心管 中， 混匀， 4 12000g 离心 10 分钟 ； 0020 (4)RNA 洗涤 ： 去上清， 加入 500L 冷冻的 75乙醇， 弹起沉淀， 4 12000g 离心 5 分钟， 去上清， 4 12000g 再离心 5 分钟， 吸去上清液 ； 0021 (5)RNA 溶解 ： 风干约 5 10 分钟， 加入 DEPC 处理水约 30L， 溶解 RNA ； 0022 (6)R

12、NA 浓度测定 ： 吸取 1L RNA 用 DEPC 水稀释 10 倍后， 在微量分光光度计上测 定 RNA 浓度， 以 DEPC 水做空白对照， 同时记录 RNA 浓度及其 OD260/OD280， 按照公式计算 RNA 浓度， RNA 浓度 40ng/LOD260 稀释倍数 ； 0023 (7)RNA 电泳检测 ： A、 变性胶制备 ： 取 1.2g 琼脂糖加 75mL 去离子水煮沸， 冷却至 70左右加入 10mL 10Mops 和 15mL 甲醛及适量溴化乙锭， 倒胶至插有梳子的胶板上 ； B、 电泳缓冲液配制 (1Mops) ： 取 50mL 10Mops， 用去离子水稀释至 500

13、mL， 倒入电泳槽中 ； C、 RNA 样品处理 ： 取 RNA 样品约 9L， 65变性 10min 后立即冷却， 加入 1L 10RNA 上样 缓冲液 ； D、 RNA 电泳 ： 把 RNA 胶放入电泳槽中， 100V 作用电泳约 5min， 再在点样孔中点入处 理过的 RNA 样品， 100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的 1/3 处， 取胶观察或拍照 ； 0024 (8)RNA 抽提结果 ： RNA 电泳图见附图 1 ； 0025 (9) 所得总 RNA 可立即使用或放 -80保存 ； 说 明 书 CN 102676636 A 4 3/3 页 5 0026 2、 RNA 的逆转录 0027

14、(1) 在冰上按如下比例配制 RNA 及引物混合液 ： 上述所得总 RNA2L， 10M 逆转 录引物 1L， 去 RNA 酶超纯水 7L， 总体积为 10L ； 0028 (2) 混匀上述 RNA 及引物混合液， 短暂离心， 放 65变性 10 分钟， 置冰上 2 分钟 ； 0029 (3)按如下比例配制反转录反应液 ： RNA及引物混合液10L， 5逆转录反应缓冲 液5L， 10mM dNTPs 4L， 25U/L RNA酶抑制剂1L， 200U/L M-MLV逆转录酶1L， 去 RNA 酶超纯水 4L， 总体积为 25L ； 0030 (4) 混匀上述反应混合物， 短暂离心， 置 42反

15、应 60 分钟， 95 5 分钟灭活处理 ； 0031 (5) 所得产物是单链 cDNA， 可立即使用或放置于 -20保存。 0032 4、 荧光定量超快速检测反应 0033 (1) 在冰上按如下比例配制荧光定量 PCR 的反应液 ： 10 荧光定量 PCR 缓冲液 2L， 20mg/L 甜菜碱 1L， 5U/L DNA 聚合酶 0.5L， 40 荧光定量染料 0.5L， 10mM dNTPs 2L， 2M 正向引物 2L， 2M 反向引物 2L， 单链 cDNA2L， 去 RNA 酶超纯水 8L， 总体积为 20L ； 0034 (2) 混匀上述荧光定量 PCR 的反应液， 加入到圆盘式反应

16、容器中， 每个加样孔加反 应液 20L， 所有加样孔都加完后， 用封盘膜盖上， 密封好， 按圆盘位置固定孔的分布放置到 温度循环仪上， 当圆盘不停转动时， 完成 PCR 循环， 并同步完成扩增产物荧光强度的检测 ； 0035 (3) 荧光定量 PCR 反应 ： 使用标准的三步法进行检测， 反应循环设定如下 ： 95预 变性 10 分钟 ； 95变性 10 秒钟， 57退火 20 秒钟， 72延伸 10 秒钟 ； 40 个循环 ； 0036 (4) 扩增分析 ： 按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线， 确定标本中的 has-miR-29a 的量。 说 明 书 CN 102676636 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102676636 A 6