包括 2,3-和 2,6-唾液酸化的重组FSH.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510933827.2 (22)申请日 2009.04.16 (30)优先权数据 08251528.9 2008.04.25 EP 61/045,424 2008.04.16 US (62)分案原申请数据 200980121391.X 2009.04.16 (71)申请人 辉凌国际制药(瑞士)有限公司 地址 瑞士沃州圣派 (72)发明人 伊恩科廷厄姆 丹尼尔普拉克辛 理查德博伊德怀特 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 吴小明 (51)

2、Int.Cl. C07K 14/59(2006.01) A61K 38/24(2006.01) A61P 15/08(2006.01) (54)发明名称 包括 2,3-和 2,6-唾液酸化的重组FSH (57)摘要 一种包括 2,3-和 2,6-唾液酸化的重组 FSH。 包含重组FSH(rFSH)的制剂。 权利要求书1页 说明书21页 序列表8页 附图10页 CN 105906703 A 2016.08.31 CN 105906703 A 1.重组FSH(rFSH)， 其包括 2,3-和 2,6-唾液酸化， 其中全部唾液酸化的80以上是 2,3-唾液酸化并且全部唾液酸化的5至20是 2,6-唾

3、液酸化。 2.根据权利要求1的重组FSH， 其具有6mol/mol至15mol/mol的唾液酸含量以唾液酸摩 尔数与蛋白的摩尔数的比率表示。 3.根据任一在前权利要求的重组FSH， 其具有8mol/mol至15mol/mol的唾液酸含量以 唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示。 4.根据任一在前权利要求的重组FSH， 其具有8mol/mol至14mol/mol的唾液酸含量以 唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示。 5.根据任一在前权利要求的重组FSH， 其在人细胞系中表达。 6.一种药物组合物， 其包含根据任一在前权利要求的rFSH。 7.根据权利要求6的药物组合物， 其还包含hCG和/或LH

4、。 8.根据权利要求6或7中任一项的药物组合物， 其用于治疗不育。 9.一种生产根据权利要求1-5中任一项的rFSH的方法， 所述方法包括在人细胞系中生 产或表达所述rFSH的步骤。 10.根据权利要求9的方法， 其中所述细胞系已经使用 2,3-唾液酸转移酶和/或 2,6- 唾液酸转移酶进行修饰。 11.重组FSH， 其包括 2,3-和 2,6-唾液酸化， 其中所述重组FSH在人细胞系中表达。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105906703 A 2 包括 2,3-和 2,6-唾液酸化的重组FSH 0001 本申请是申请日为2009年4月16日、 发明名称为 “包括 2,3-和 2,6-唾

5、液酸化的重 组FSH” 的中国专利申请No.200980121391.X的分案申请。 0002 本发明涉及用于治疗不育的促性腺激素。 具体地， 本发明涉及促卵泡激素(FSH)。 0003 所述促性腺激素是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。 它们包括促卵泡激素(FSH),黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。 0004 FSH由垂体前叶腺自然分泌， 并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。 FSH包含对于 其它糖蛋白激素LH和CG也是常见的92个氨基酸的 -亚基， 以及赋予该激素生物学特异性的 FSH独有的111个氨基酸的 -亚基(Pierce和Parsons,1981)。

6、 每个亚基通过增加复杂的糖残 基进行翻译后修饰。 两个亚基都携带关于N-连接的聚糖附着的2个位点， 亚基在氨基酸52 和78处， -亚基在氨基酸残基7和24处(Rathnam和Saxena,1975,Saxena和Rathnam,1976)。 因此， FSH糖基化到约30质量(Dias和VanRoey.2001.Fox等2001)。 0005 从更年期后人尿中纯化的FSH已经在不育治疗中使用了许多年； 其在自然生殖中 促进排卵并且提供卵母细胞用于辅助生殖技术。 FSH的两种重组形式， Gonal-F(Serono)和 Puregon(Organon)在20世纪90年代中期是可获得的。 这些都在

7、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中 表达(Howles,1996)。 0006 存在与FSH制剂相关的相当大的异质性， 其涉及在存在的不同的同分异构体的量 上的不同。 单独的FSH同工型显示相同的氨基酸序列， 但是在它们翻译后修饰的程度上不 同； 具体的同工型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同， 这两者 都显示影响具体的同工型生物活性。 0007 自然FSH的糖基化是高度复杂的。 在自然来源的垂体FSH中的聚糖可以包含广泛范 围的结构， 其可以包括二触角聚糖、 三触角聚糖和四触角聚糖的组合(Pierce和Parsons, 1981.Ryan等.,1987。 Baenziger和

8、Green,1988)。 所述聚糖可以具有其它的修饰:核心岩藻 糖基化、 平分型葡糖胺、 用乙酰基乳糖胺延伸的链、 部分或完全唾液酸化(sialylation),具 有 2,3和 2,6连接的唾液酸化， 和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺(Dalpathado等， 2006)。 此外， 在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。 在来自个体的血清以及来自 绝经期后妇女尿液的FSH中已经发现相当水平的聚糖复杂性(Wide等.,2007)。 0008 重组FSH产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。 现存的rFSH 产品来自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。 在CHO来源的rF

9、SH中的聚糖修饰范围比在来 自垂体提取物或尿液的天然产物中发现的那些更有限。 在CHO来源的rFSH中发现的减少的 聚糖异质性的实例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺 延伸(Hard等,1990)。 此外， CHO细胞仅能够使用 2,3连接加入唾液酸(Kagawa等,1988, Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。 这不同于天然产生的FSH， 其包含具有 2,3和 2,6- 连接的唾液酸混合物的聚糖。 0009 已经证实当与垂体、 血清或绝经期后尿液FSH比较时， 重组FSH制剂(Organon)在具 有低于4的等电点(pI)的FSH(考虑

10、酸性同工型)的量上不同(Ulloa-Aguirre等.1995)。 与重 组产物Gonal-f(Serono)和Puregon(Organon)比较， 在尿制备物中的酸性同工型的量高得 说明书 1/21 页 3 CN 105906703 A 3 多(Andersen等.2004)。 这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸， 因为用硫酸盐修饰的 带负电荷的聚糖的含量在FSH中很低。 与天然FSH比较， 更低的唾液酸含量是两种商购FSH产 品的特征， 并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和Driebergen,2005)。 0010 存在大量的科学工作， 其分析并尝试解释在不同个体

11、之间的FSH糖基化变化以及 在排卵周期过程中的变化。 一项重要讨论涉及这样的观察， 即FSH浓度和唾液酸含量在所述 周期的排卵前期过程中都减少。 减少的唾液酸含量导致更具碱性的FSH， 其都清除地更快， 并且在体外至少在靶受体处更有效(Zambrano等1996)。 关于这些变化的生物相关性以及它 们可以怎样涉及选择优势卵泡的问题仍旧未得到解决(由Ulloa-Aguirre综述,2003)。 0011 已经关于来自多种来源的物质记载了FSH的循环寿命。 这些物质中的一些已经基 于总分子电荷进行分离， 如通过它们的pI表征， 其中更多的酸等同于更高的负电荷。 如以前 所指出的， 对于总分子电荷的

12、主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。 例如， rFSH (Organon)具有约8mol/mol的唾液酸含量， 而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量(de Leeuw等.1996)。 在大鼠中的相应血浆清除率是0.34和0.14ml/min(Ulloa-Aguirre等 .2003)。 在另一个实例中， 其中将重组FSH样品分为高和低pI级分， 高pI(更低唾液酸含量) 级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D Antonio等.1999)。 已经报道在排卵 周期的后期阶段循环的更具碱性的FSH是由于 2,3唾液酸-转移酶在垂体前叶中的下调， 其 由增加水平的雌二醇所导致(Dam

13、ian-Matsumara等.1999.Ulloa-Aguirre等.2001)。 尚未报 道关于 2,6唾液酸-转移酶的结果。 0012 FSH和rFSH的总唾液酸含量不是直接可比较的， 因为唾液酸一般通过两种方式连 接。 垂体/血清/尿FSH都包括 2,3和 2,6-连接的唾液酸， 其中主要为前者。 然而， CHO细胞来 源的重组体仅包括 2,3(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。 除了后者 更低的唾液酸总含量以外， 在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异。 0013 CHO细胞普遍用于生产药用人重组蛋白。 结构分析已经鉴定唾液

14、酸专门通过 2,3- 连接来连接。 (Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。 许多人糖蛋白包括 2,3-和 2,6-连接的混合物。 因此， 使用CHO系统表达的重组蛋白在它们的末端唾液酸连接 类型上与它们的天然对应物不同。 在生产药用的生物制剂上这是一项重要的考虑因素， 因 为糖部分可以有助于所述分子的药理学性质。 0014 具有这样的rFSH产品是理想的， 所述rFSH产品更接近地复制或模拟由人尿生产的 产品的生理化学和药物代谢动力学性质。 具有这样的rFSH产品是理想的， 其与已知重组产 物比较， 具有一种或多种提高的药物代谢动力学性质。

15、 0015 根据本发明， 提供这样的重组FSH( “rFSH” 或 “recFSH” )， 其包括 2,3唾液酸化和 2,6唾液酸化和,任选地, 2,8唾液酸化。 根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化 的10以上是 2,3-唾液酸化， 例如全部唾液酸化的65-85可以是 2,3-唾液酸化。 本发 明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的50以下可以是 2,6-唾液酸化， 例如全部唾液 酸化的15-35可以是 2,6-唾液酸化。 本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的5 以下可以是 2,8-唾液酸化， 例如全部唾液酸化的0.1-4可以是 2,8-唾液酸化。 根据

16、本发 明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6mol/mol以上， 例如6mol/mol-15mol/mol之间的唾液酸含 量(以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示)。 0016 申请人已经发现唾液酸连接的类型， 2,3-或 2,6-， 可以具有对FSH的生物清除率 说明书 2/21 页 4 CN 105906703 A 4 的巨大影响。 与CHO细胞系相比， 人细胞系可以表达唾液酸通过 2,3和 2,6连接的重组FSH。 在实施例4中， 制备这样的重组FSH细胞系， 其表达包含具有低水平的 2,3-和 2,6-连接的 唾液酸的聚糖的FSH(图6)。 这种碱性物质， 具有有限的唾液酸含量(

17、图4)， 在大鼠中从循环 中非常快地清除， 如所预期的(图7)。 接着， 通过加入编码 2,6-唾液酸-转移酶的基因对所 述细胞系进行第二个改造步骤(实施例5)。 得到的rFSH是高度唾液酸化的， 显示可与尿FSH 比较的唾液酸含量和pI分布(图5)。 然而， 所述物质以与具有低唾液酸含量的原始物质相当 的速率从大鼠的循环中非常快地清除(图8)。 这是意外的观察， 因为已知在天然和生物活性 FSH上的一定比例的唾液酸是 2,6-连接的。 发现 2,6-唾液酸化的rFSH的清除率是通过在 肝中发现的脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体介导(实施例9)。 这通过使用过量的另一种所述受 体的底物来瞬时阻断

18、ASGP受体而得以证实。 在受体被脱唾液酸胎球蛋白阻断的情况下， 恢 复了关于高度唾液酸化的物质的预期清除率(图9)。 这维持了数小时， 直到阻断被消除， 并 且 2,6连接的高度唾液酸化的rFSH恢复了其快速清除率。 0017 通过改造人细胞系以表达rFSH和 2,3唾液酸转移酶来制备具有 2,3和 2,6-连接 的唾液酸的混合物的重组FSH(实施例4和5)。 表达的产物是高度酸性的并且携带 2,3-和 2,6-连接的唾液酸的混合物； 后者由内源的唾液酸转移酶活性提供(图6)。 与在常规CHO细 胞中表达的rFSH比较， 这具有两个优势： 首先， 由于这两种唾液酸转移酶的组合活性， 所以 所

19、述物质是更加高度唾液酸化的； 其次， 所述物质更接近地类似于天然FSH。 与CHO细胞来源 的重组产物比较， 这可能在生物学上是更加适合的， 所述重组产物仅产生 2,3连接的唾液 酸(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)并且具有减少的唾液酸含量 (Ulloa-Aguirre等.1995.,Andersen等.2004)。 0018 申请人令人惊奇地发现与其它重组产物相比， 本发明的rFSH可以更接近地复制或 模拟天然人尿产物的生理化学和药物代谢动力学性质。 换言之， 本发明的rFSH可以更接近 于 “天然” FSH。 关于给药等， 这可能具有

20、明显的优势。 此外， 更 “天然” 或更 “人化” 的产品对于 可能需要治疗的患者可能是更理想的， 尽管在某种意义上， 人工意味着尽可能的 “是天然 的” 。 与其它重组产物比较， 在糖(例如聚糖)结构上更接近于天然(例如人尿)FSH的重组产 物可能具有其它优势(例如药物代谢动力学优势)。 0019 因此， 本发明是FSH的重组形式， 其携带 2,3和 2,6唾液酸的混合物并且因此更接 近地类似于天然FSH。 与现存的重组产物比较， 预期这种化合物关于控制的卵巢刺激， 在IVF 技术中的应用， 以及排卵诱导的应用将导致卵巢的更天然的刺激。 0020 根据本发明， 提供包含2 ,3唾液酸化和2

21、,6唾液酸化的重组FSH( “rFSH” 或 “recFSH” )(和/或重组FSH制剂)。 rFSH或rFSH制剂可以任选地进一步包含 2,8唾液酸化。 0021 在本文中， 术语 “重组FSH制剂” 包括用于例如药物应用的制剂， 其包含重组FSH。 在 本发明的实施方案中， 所述rFSH可以作为单一同工型或作为同工型的混合物存在。 0022 根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6mol/mol以上的唾液酸含量以唾液酸 的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示(实施例8)， 例如6mol/mol-15mol/mol,例如8mol/ mol-14mol/mol,例如10mol/mol-14m

22、ol/mol,例如11mol/mol-14mol/mol,例如12mol/mol- 14mol/mol,例如12mol/mol-13mol/mol。 本发明的rFSH可以在人细胞系中生产或表达。 0023 根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的10以上可以是 2,3-唾液酸 化。 例如， 全部唾液酸化的20,30,40,50,60,70,80或90以上可以是 2,3-唾液酸化。 所述 说明书 3/21 页 5 CN 105906703 A 5 rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的65-85的量， 例如全部唾液酸化的70-80， 例 如全部唾液酸化的71-79的量包括

23、2,3-唾液酸化。 本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾 液酸化的50以下可以是 2,6-唾液酸化。 例如， 全部唾液酸化的40,30,20,10,5以下可 以是 2,6-唾液酸化。 所述rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的15-35的量， 例如全 部唾液酸化的20-30， 例如全部唾液酸化的21-29的量包括 2,6-唾液酸化。 本发明的 rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的5以下可以是 2,8-唾液酸化。 例如， 全部唾液酸化 的2.5以下可以是 2,8-唾液酸化。 所述rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的0.1到 4， 例如全部唾液酸化的0.5-3， 例如

24、全部唾液酸化的0.5-2.5的量包括 2,8-唾液酸 化。 所谓唾液酸化， 意味着在FSH糖结构上存在着唾液酸残基的量。 2,3-唾液酸化意味着在 2,3位置处的唾液酸化(如本领域中公知的)和 2,6唾液酸化意味着在2,6位置处的唾液酸 化(如本领域中公知的)。 因此，“的全部唾液酸化可以是 2,3唾液酸化” 指在FSH中存在的 唾液酸残基的总数的在2,3位置处被唾液酸化。 术语 “的全部唾液酸化是 2,6-唾液酸 化” 指在FSH中存在的唾液酸残基的总数的在2,6位置处被唾液酸化。 0024 根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6质量以上(例如， 6质量-15质 量,例如， 7质量

25、-13质量,例如， 8质量-12质量,例如， 11质量-15质量,例如， 12质量-14质量)的唾液酸含量(每个FSH分子唾液酸化的量)(基于蛋白质的质量， 而不 是蛋白质加上糖的质量)。 0025 在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组FSH专门包含 2,3唾液酸化(Kagawa等, 1988,Takeuchi等.1988,Svensson等.1990)。 0026 本发明的rFSH可以在人细胞系中生产或表达。 其可以简化生产方法(并使其更有 效)， 因为操作和控制例如细胞生长培养基以维持唾液酸化与已知方法相比可能是较不关 键的。 所述方法也可以是更有效的， 因为与已知rFSH产品的生产比

26、较， 只有少量碱性rFSH产 生； 产生更多的酸性rFSH并且分离/去除碱性FSH是不存在问题的。 rFSH可以在Per.C6细胞 系， Per.C6来源的细胞系或修饰的Per.C6细胞系中生产或表达。 所述细胞系可以使用 2,3- 唾液酸转移酶进行修饰。 所述细胞系可以使用 2,6-唾液酸转移酶修饰。 备选地， 或另外地， 所述rFSH可以包含由细胞系的内源唾液酸转移酶活性提供的 2,6-连接的唾液酸( 2,6 唾液酸化)。 0027 所述rFSH可以使用 2,3-和/或 2,6-唾液酸转移酶产生。 所述rFSH可以使用 2,3- 唾液酸转移酶产生。 rFSH可以包含由内源唾液酸转移酶活性提

27、供的 2,6-链接的唾液酸( 2,6唾液酸化)。 0028 根据本发明， 在另一方面， 提供产生如本文所述的rFSH和/或rFSH制剂的方法(根 据本发明的各方面)， 所述方法包含在人细胞系中生产或表达rFSH的步骤， 所述人细胞系例 如， Per.C6细胞系， Per.C6来源的细胞系， 或修饰的Per.C6细胞系， 例如已经用 2,3-唾液酸 转移酶修饰的细胞系。 0029 所述rFSH结构包含聚糖部分。 可以发生分支作用， 结果是聚糖可以具有1,2,3,4个 以上的末端糖残基或 “触角” ， 如本领域中众所周知的。 本发明的rFSH可以具有聚糖， 其中唾 液酸化存在于单-触角和/或二触角

28、和/或三触角和/或四触角的结构上。 rFSH可以优选地包 含单唾液酸化的， 二唾液酸化的， 三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖结构， 具有如下的相对 量： 9-15单唾液酸化； 2730二唾液酸化； 3036三唾液酸化和2529四唾液酸化(例 说明书 4/21 页 6 CN 105906703 A 6 如， 如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示， 如在实施例8c中所显示)。 0030 根据本发明， 在另一方面， 提供在人细胞系中产生的(例如表达的)rFSH。 所述rFSH 可以包括 2,3-和 2,6-唾液酸化。 可以在Per.C6细胞系,Per.C6来源的细胞系或修饰的 Per.C6细胞系中生产

29、或表达rFSH。 可以使用 2,3-唾液酸转移酶修饰所述细胞系。 可以使用 2,6-唾液酸转移酶修饰细胞系。 备选地或另外地， rFSH可以包含由细胞系的内源唾液酸 转移酶活性提供的 2,6-连接的唾液酸( 2,6唾液酸化)。 rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸 化的10以上可以是 2,3-唾液酸化， 例如全部唾液酸化的65-85可以是 2,3-唾液酸化。 本发明的rFSH(或rFSH制剂)的50以下的全部唾液酸化可以是 2,6-唾液酸化， 例如15- 35的全部唾液酸化可以是 2,6-唾液酸化。 本发明的rFSH(或rFSH制剂)的5以下的全部 唾液酸化可以是 2,8-唾液酸化， 例如0

30、.5-4的全部唾液酸化可以是 2,8-唾液酸化。 所述 rFSH可以具有6mol/mol以上的唾液酸含量， 例如6mol/mol-15mol/mol之间的唾液酸含量 (以唾液酸的摩尔数与蛋白质的摩尔数的比率表示)。 0031 根据本发明， 在另一方面， 提供包含含有 2,3-唾液酸化和 2,6-唾液酸化(例如， 如上提及)的rFSH的药物组合物。 所述药物组合物还可以包含hCG和/或LH。 0032 可以通过本领域已知的任何方式获得hCG。 在本文中使用的hCG包含人来源的和重 组hCG。 可以通过本领域已知的任何方法从任何适当来源(例如， 尿和胎盘)纯化人来源的 hCG。 表达和纯化重组hC

31、G的方法是本领域中众所周知的。 0033 LH可以通过本领域中已知的任何方法获得。 LH,如本文所用， 包含人来源的和重组 LH。 可以通过本领域已知的任何方法从任何适当的来源(例如， 尿)纯化人来源的LH。 表达和 纯化重组LH的方法是本领域中已知的。 0034 所述药物组合物可以用于治疗不育， 例如， 用于在例如辅助生殖技术(ART)， 排卵 诱导或宫内人工受精(IUI)中。 所述药物组合物可以例如用于这样的医学适应证， 在所述适 应证中使用已知FSH制剂。 本发明还提供本文所述的rFSH和/或rFSH制剂(根据本发明的各 方面)用于制备治疗不育的药物的应用。 可以将本发明的药物组合物配制

32、为用于任何药物 施用途径的众所周知的组合物， 所述药物施用途径例如口服、 直肠、 肠胃外、 透皮(例如， 贴 片技术)、 静脉内、 肌内、 皮下、 intrasusternal、 阴道内、 腹膜内、 局部(粉末、 药膏或滴剂)或 作为颊含或鼻喷雾剂。 典型的组合物包含药用载体， 如水溶液、 非毒性赋形剂， 包括盐和防 腐剂， 缓冲剂等， 如特别在雷明顿药物科学(Matt出版公司,1975)第15版， 在1405-1412和 146187页中， 以及在国家药典(nationalformulary)XIV第十四版(美国药物协会 (AmericanPharmaceuticalAssociation)

33、,1975)中所述。 0035 适合的水性和非水性药物载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂的实例包括水、 乙醇、 多元 醇(如甘油,丙二醇,聚乙二醇,等)， 羧甲基纤维素及其适合的混合物， 植物油(如橄榄油)， 和可注射的有机酯如油酸乙酯。 0036 本发明的组合物还可以包含添加剂如， 但不限于防腐剂、 湿润剂、 乳化剂和分散 剂。 可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物的生长， 并且包括， 例如对羟基苯甲酸酯 类、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸等。 此外， 包含等张剂如糖、 氯化钠等可能是需要的。 0037 在一些情形中， 为了实现延长的作用， 需要延缓自皮下或肌内注射的FSH(和其它 活性成分， 如

34、果存在的话)的吸收。 这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的 液体混悬液来实现。 FSH吸收的速率于是取决于其溶出速率， 其又可以取决于晶体大小和晶 说明书 5/21 页 7 CN 105906703 A 7 体形式。 备选地， 肠胃外施用的FSH组合形式的延缓吸收通过将所述FSH组合溶解或悬浮在 油赋形剂中实现。 0038 可注射长效制剂形式可以通过在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成 FSH(和其它药剂， 如果存在的话)的微胶囊基质来进行制备。 取决于FSH与聚合物的比率以 及所用的特定聚合物的性质， 可以控制FSH释放的速率。 其它可生物降解的聚合物的实例包 括聚乙烯吡

35、咯烷酮， 聚(原酸酯)， 聚(酐)等。 可注射的长效制剂也通过将FSH包埋在脂质体 或微乳中进行制备， 所述脂质体或微乳可与体组织相容。 0039 可注射制剂可以例如通过经过留住细菌(bacterial-retaining)的滤器进行过 滤， 或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌， 所述无菌固体组合物可以溶解 或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中， 之后立即使用。 可以将可注射制剂在任何适合 的容器中提供， 所述容器例如瓶子、 预先填充的注射器、 注射药筒等。 0040 可注射制剂可以作为这样的产品供应， 所述产品具有包含FSH的药物组合物(任选 地具有hCG,LH等)。 如果存在超

36、过一种活性成分(即FSH， 和例如hCG或LH)， 这些可以适合于 单独或在一起施用。 如果单独施用， 施用可以是顺序的。 所述产品可以在任何适合的包装中 供应。 例如， 产品可以包含许多含有FSH,hCG， 或FSH和hCG的组合的预先填充的注射器， 在泡 眼包装或其它装置里包装注射器以保持无菌。 产品可以任选地包含使用所述FSH和hCG制剂 的说明书。 0041 根据本领域中的常规实践调整药物组合物中各种成分的pH和提取物浓度。 见 GOODMAN和GILMAN sTHEPHARMACOLOGICALBASISFORTHERAPEUTICES(治疗剂的药物基 础),第7版。 在优选的实施方

37、案中， 本发明的组合物作为用于肠胃外施用的组合物供应。 制 备肠胃外制剂的一般方法是本领域中已知的并且在REMINGTON； THESCIENCEAND PRACTICEOFPHARMACY(雷明顿： 药物科学和实践),上文,第780-820页中描述。 肠胃外组 合物可以以液体制剂或作为固体供应， 所述固体与无菌可注射介质混合， 之后立即施用。 在 尤其优选的实施方案中， 肠胃外组合物以易于施用和同样剂量的剂量单位形式供应。 0042 发明详述 0043 现在参照下面的实施例和附图更详细地描述本发明： 0044 图1， 2和3:pFSH / ， pST3和pST6表达载体的质粒图谱。 CMV巨

38、细胞病毒启动子， BGHp(A)牛生长激素多腺苷酸化序列， f1orif1复制起点， SV40猿猴病毒40启动子， Neo新霉素抗性标记， Hyg潮霉素抗性标记， SV4Op(A)猿猴病毒40多腺苷酸化序列， FSHA促卵泡激素 多肽， FSHB促卵泡激素 多肽， ST3GAL4 2， 3-唾液酸转移酶， ST6GAL1 2， 6-唾液酸转移酶， CoIE1CoIE1复制起点， Amp氨苄青霉素抗性标记。 0045 图1显示pFSH / 表达载体的质粒图谱(FSH表达载体)； 0046 图2显示 2,3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)表达载体； 0047 图3显示 2,6-唾液酸转移酶(ST6

39、GAL1)表达载体； 0048 图4显示由稳定表达FSH的Per.C6细胞生产的重组FSH的等电聚焦。 细胞培养物上 清液在pH3.07.0梯度上， 在天然条件下分离。 克隆005代表用于唾液酸转移酶改造的五个 克隆。 丢弃包含较少酸性同工型的克隆； 0049 图5显示在用 2,3-或 2,6-唾液酸转移酶改造后， 通过由稳定表达FSH的Per.C6细 胞生产的重组FSH的等电聚焦分析的克隆的实例。 细胞培养物上清液在pH3.07.0梯度上， 说明书 6/21 页 8 CN 105906703 A 8 在天然条件下分离。 克隆005是亲代Per.C6FSH细胞系。 放弃显示碱性或混合图谱的克隆

40、 (*)。 余下的克隆显示用唾液酸转移酶成功改造以增加在FSH上的唾液酸分子的数量； 0050 图6显示Per.C6FSH的唾液酸连接的分析。 在重复的凝 0051 胶上通过SDSPAGE分离纯化的Per.C6FSH， 并将其转移到硝基纤维素上， 并根据 制造商的说明书， 使用DIG聚糖区分试剂盒(目录号11210238001， 罗氏)显现。 与黑接骨 木凝集素(SNA)的阳性反应指示末端连接的(2-6)唾液酸(A)。 与朝鲜槐凝集素(MAA)的阳 性反应:指示末端连接的(2-3)唾液酸(B)。 泳道I是仅包括 2， 6连接的制造商对照。 泳道II 是包括 2， 6和 2， 3连接的制造商对照

41、。 样品a， 商业CHO来源的重组FSH(Gonal-f， Serono)。 样品b， 亲代Per.C6rFSH， 无唾液酸-转移酶改造。 样品c， 具有 2， 6-唾液酸转移酶改造的 Per.C6rFSH。 样品d， 具有 2， 3-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH。 0052 图7显示Per.C6FSH样品的代谢清除率(MCRs)。 在0时间， 将rFSH(110 g/大鼠)推 注到雌性大鼠的尾静脉中(每个克隆3只动物)。 通过ELISA测定随时间过去收集的血液样品 的FSH含量； 0053 图8显示 2,6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。 在0时间， 将rFS

42、H(1 10 g/大鼠)推注到雌性大鼠的尾静脉中(每个克隆3只动物)。 通过ELISA测定随时间过去收 集的血液样品的FSH含量； 0054 图9显示 2,6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。 共施用7500倍摩尔过 量的脱唾液酸胎球蛋白以饱和ASGP-R1-2小时的 2,6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样 品的代谢清除率； 0055 图10显示 2,3-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。 基于它们的IEF图 谱， 关于它们的唾液酸含量选择样品； 0056 图11显示根据Steelman和Pohley(1953)的方法， 通过亲代Per.C6rFS

43、H的Per.C6 rFSH克隆导致的卵巢重量增加(ovarianweightaugmentation)。 根据Steelman和Pohley (1953)的方法的卵巢重量增加。 在不同的剂量(3只大鼠/剂量)测试Per.C6rFSH和标准物 (Gonal-frFSH)； 图12显示通过改造的( 2,6-唾液酸转移酶)Per.C6rFSH导致的Per.C6rFSH克隆的卵 巢重量增加。 根据Steelman和Pohley(1953)的方法的卵巢重量增加。 在不同的剂量(3只大 鼠/剂量)测试 2,6-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH和标准物(Gonal-frFSH)； 和 图13显示通过改

44、造的( 2,3-唾液酸转移酶)Per.C6rFSH导致的Per.C6rFSH克隆的卵 巢重量增加。 根据Steelman和Pohley(1953)的方法的卵巢重量增加。 在五个不同的剂量(3 只大鼠/剂量)测试亲代Per.C6rFSH， 2,3-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH和标准物 (Gonal-frFSH)。 0057 序列选择 0058 人FSH 0059 根据Fiddes和Goodman .(1981 )使用FSH多肽的基因编码区。 序列登记为 AH007338， 并且在构建时， 不存在该蛋白序列的其它变体。 该序列在本文中称为SEQID1。 0060 根据Keene等(198

45、9)使用FSH 多肽的基因编码区。 将所述序列登记为NM_000510， 并且在构建时， 不存在该蛋白序列的其它变体。 该序列在本文登记为SEQID2。 0061 唾液酸转移酶 说明书 7/21 页 9 CN 105906703 A 9 0062 2,3-唾液酸转移酶根据Kitagawa和Paulson(1994)使用 -半乳糖苷 -2,3-唾液 酸转移酶4( 2,3-唾液酸转移酶,ST3GAL4)的基因的编码区。 将序列登记为L23767， 并且在 本文称为SEQID3。 0063 2 ,6-唾 液酸转移酶根 据G rund ma nn等( 1 990 )使 用-半乳糖酰胺 (galacto

46、samide) -2,6-唾液酸转移酶1( 2,6-唾液酸转移酶,ST6GAL1)的基因编码区。 将 序列登记为NM_003032并且在本文称为SEQID4。 实施例 0064 实施例1FSH表达载体的构建 0065 分别使用引物组合FSHa-fw和FSHa-rev和FSHb-fw和FSHb-rec， 通过PCR扩增FSH 多肽(AH007338,SEQID1)和FSH 多肽(NM_003032,SEQID2)的编码序列。 0066 FSHa-fw 0067 5 -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3 0068 FSHa-rev5 -GGATGGC

47、TAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3 0069 FSHb-fw5 -CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3 0070 FSHb-rev5 -CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3 0071 将得到的扩增FSH DNA用限制性酶AscI和HpaI消化， 并将其插入在携带新霉素选 择标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体的AscI和HpaI位点中。 类似地， 将FSH DNA用BamHI和 NheI消化， 并将其插入到在已经包含FSH 多肽DNA的表达载体上的位点BamHI和NheI中。 0072 将载体DNA用

48、于转化大肠杆菌(E.coli)的DH5 菌株。 选择60个克隆用于扩增， 并且 57个包含含有FSH 和 的载体。 选择这些中的20个用于测序并且所有的包含正确的根据 SEQID1和SEQID2的序列。 选择质粒pFSHA+B#17用于转染(图1)。 0073 实施例2ST3表达载体的构建 0074 使用引物组合2,3STfw和2,3STrev， 通过PCR扩增 -半乳糖苷 -2,3-唾液酸转移酶 4(ST3,L23767,SEQID3)的编码序列。 0075 2,3STfw5 -CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3 0076 2,3STrev5 -T

49、TTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3 0077 将得到的扩增的ST3DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化， 并将其插入在携带潮 霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。 将所述载体如前 述扩增， 并且测序。 克隆pST3#1(图2)包含正确的根据SEQID3的序列， 并将其选择用于转 染。 0078 实施例3ST6表达载体的构建 0079 使用引物组合2,6STfw和2,6STrev， 将 -半乳糖酰胺 -2,6-唾液酸转移酶1的编码 序列(ST6,NM_003032,SEQID4)通过PCR进行扩增。 0080 2,6STfw5 -CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3 0081 2,6STrev5 -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3 0082 将得到的扩增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化， 并将其插入携带潮霉 素抗性标记的CMV驱动的哺乳