一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410108994.9 (22)申请日 2014.03.21 CGMCC No.8792 2014.02.27 C12N 1/20(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (73)专利权人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市甘井子区凌工路 2 号 (72)发明人 徐永平 张建城 曹振辉 王丽丽 李振 徐乐 (74)专利代理机构 大连理工大学专利中心 21200 代理人 李宝元 梅洪玉 CN 102172248 A,2011.09.07, 林业杰 等 . 溶藻弧菌噬菌

2、体的分离 .微生 物学报 .1993, 第 33 卷 ( 第 4 期 ), Yong Ju Heo et al.Morphological characterization of Vibrio alginolyticus specific bacteriophage isolated from fish farms on west coast of Korea.JOURNAL OF FISH PATHOLOGY .2012, 第 25 卷 ( 第 3 期 ), 曾林 等 . 一株溶藻弧菌噬菌体的生理特性 研究 .广东海洋大学学报 .2012, 第 32 卷 ( 第 1 期 ), Jianche

3、ng Zhang et al.Effect of Bacteriophages on Vibrio alginolyticus Infection in the Sea Cucumber.JOURNAL OF THE WORLD AQUACULTURE SOCIETY .2015, 第 46 卷 ( 第 2 期 ), (54) 发明名称 一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中 的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种溶藻弧菌噬菌体及其在海 参疾病预防中的应用， 属于生物技术领域。 该噬菌 体于 2014 年 3 月 11 日保藏于 “中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心” ， 保藏号

4、CGMCC No.8792，分 类 命 名 为 Vibrio alginolyticus bacteriophage ； 溶藻弧菌噬菌体为有尾噬菌体 目， 短尾噬菌体科， 头部直径 50nm， 尾部长 15nm， 无收缩尾鞘， 有6根短尾丝。 将噬菌体应用于防治 海参养殖过程中相应溶藻弧菌的感染和污染， 效 价 105PFU/mL。噬菌体对溶藻弧菌有抑制作用， 在 12h 内无噬菌体抗性菌株产生 ； 潜伏期 28min， 裂解量为79个， 其在海水养殖环境中14天内降低 了两个数量级。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王子晔 (19)中华人民共和国国家知

5、识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 103898015 B 2016.04.06 CN 103898015 B 1.一种溶藻弧菌噬菌体， 其特征在于： 该溶藻弧菌噬菌体于2014年3月11日保藏于 “中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 保藏号CGMCCNo.8792， 分类命名为 Vibrioalginolyticusbacteriophage。 2.权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体的应用， 其特征在于： 将溶藻弧菌噬菌体应用于防 治海参养殖中溶藻弧菌的感染和污染， 其中， 效价 105PFU/mL； 溶藻弧菌噬菌体对溶藻弧 菌具有抑制作用，

6、在12h内无噬菌体抗性菌株产生。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103898015 B 2 一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域 ， 涉及一株能够特异性裂解溶藻弧菌 （Vibrio alginolyticus） 菌株的噬菌体分离物及其在海参疾病预防领域中的应用。 背景技术 0002 海参 （Holothurioidea） 是中国北方沿海地区产值最大的海水养殖动物之一。 据统 计， 目前我国海参养殖面积近9万公顷， 产量近10万吨， 年产值100多亿元 （中国海参学术研 究与产业发展论坛， 2009） 。 然而， 近年随着刺参养殖规模和养殖

7、密度的迅速增大， 养殖水体 逐渐恶化， 病害问题也日趋严重。 溶藻弧菌 （Vibrioalginolyticus） 是一种常见的海洋致 病菌， 该菌是导致成年海参患腐皮综合症的主要致病菌之一， 死亡率高达90%， 严重地限制 了海参养殖业的持续健康发展。 同时， 溶藻弧菌也是临床上引起沿海地区水产品食物中毒 和急性腹泻的常见病原菌。 0003 噬菌体是一类细菌性病毒， 能在菌体细胞内快速复制增殖， 并最终裂解细菌从而 达到抗菌效果。 噬菌体治疗是利用噬菌体裂解细菌的特性来防治人或动物的细菌性感染。 近年来， 研究发现噬菌体治疗能有效防治水产动物细菌性疾病。 如利用噬菌体防治鰤鱼格 氏乳球菌 （

8、Lactococcusgarvieae） 感染、 香鱼冷水病、 变形假单胞菌 （Pseudomonas plecoglossicida） 感染、 对虾哈维氏弧菌 （Vibrioharveyi） 病以及河流弧菌 （Vibrio fluvialis） 引起的皱纹盘鲍脓疱病。 尽管噬菌体在防治陆生动物及水产动物 （鰤鱼、 香鱼、 对虾等） 细菌性疾病的效果已在实验室中得到证实， 但目前尚未见有关将噬菌体用于海参 病害防治的研究报道， 且噬菌体治疗过程中的一些关键问题尚未解决， 具体作用机制尚不 明确。 0004 本发明中的噬菌体分离物是从自然界中分离的烈性噬菌体， 经小鼠安全性实验证 明其安全、 无

9、毒副作用， 并对溶藻弧菌具有强烈的裂解作用。 该噬菌体经纯化后有望开发成 为生物杀菌剂防控由溶藻弧菌引起的海参疾病。 发明内容 0005 本发明提供了一种应用裂解性噬菌体预防海参养殖中由溶藻弧菌引起的疾病， 降 低由该病引起的死亡率， 可提高海参养殖企业经济效益的技术方法。 0006 本发明的技术方案是提供一种溶藻弧菌噬菌体， 该溶藻弧菌噬菌体于2014年3月 11日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 保藏号CGMCCNo.8792， 分 类命名为溶藻弧菌噬菌体Vibrioalginolyticusbacteriophage。 中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中

10、心地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编： 100101。 该溶藻弧 菌噬菌体为有尾噬菌体目， 短尾噬菌体科， 头部直径50nm， 尾部长15nm， 无收缩尾鞘， 有6根 短尾丝。 0007 本发明中溶藻弧菌噬菌体纯化液对于由溶藻弧菌引起的海参疾病有较好的预防 效果 （存活率提高50%以上） 。 将溶藻弧菌噬菌体纯化液应用于防治海参养殖过程中相应溶 说明书 1/4 页 3 CN 103898015 B 3 藻弧菌的感染和污染， 其中， 效价 105PFU/mL。 该溶藻弧菌噬菌体对溶藻弧菌具有良好的 抑制作用， 在12h内无噬菌体抗性菌株产生； 潜伏期28min， 裂解量为79个， 其

11、噬菌体纯化液 在海水养殖环境中14天内降低了两个数量级。 0008 本发明中噬菌体经小鼠安全性实验， 腹腔注射给予噬菌体实验组1010PFU/kg的噬 菌体纯化液， 对照组给予等量生理盐水， 连续给予15天后， 将小鼠脱颈处死， 尸检， 其肺部、 肝脏、 肾脏、 腹腔均未发现病变症状， 初步验证该噬菌体是安全的。 0009 本发明的有益效果： 0010 1.分离获得一株噬菌体PVA1对致病性溶藻弧菌有良好的消杀效果， 且在12h内无 噬菌体抗性菌株产生； 0011 2.上述噬菌体纯化液在养殖水体中， 14天内效价仅下降了两个数量级， 环境耐受 性较好， 具有一定的实用基础； 0012 3.上述

12、噬菌体纯化液在小鼠体内的安全性实验显示连续15天给药未见异常， 初步 验证其体内安全性； 0013 4.上述噬菌体纯化液 （效价 105PFU/mL） 对于由致病性溶藻弧菌引起的海参疾病 有良好的预防效果 （存活率提高50%以上） ； 0014 5.噬菌体作为天然的抗菌微生物广泛存在于自然界中， 人工筛选、 富集并使用噬 菌体制剂可代替传统化药、 抗生素的使用， 具有无公害， 无残留， 廉价、 高效抗菌等特点， 是 一种应用前景广阔、 潜力巨大的天然杀菌剂。 附图说明 0015 图1为噬菌体PVA1透射电镜图片。 0016 图2为噬菌体PVA1体外抑菌结果。 0017 图3为噬菌体PVA1一步

13、生长曲线。 0018 图4为噬菌体PVA1纯化液在模拟养殖水体中的降解情况。 0019 图5为不同剂量噬菌体PVA1纯化液对于溶藻弧菌的预防效果。 0020图中： 强力霉素 （5mg/L） ； 硫酸卡那霉素 （10mg/L） ； 高剂量MOI=10； 中剂量 MOI=1； 低剂量MOI=0.1； 空白对照。 具体实施方式 0021 实施例1 0022 噬菌体的筛选和纯化 0023 （一） 水样采集及处理 0024 （1） 宿主菌的准备 0025 将溶藻弧菌经细菌学鉴定后接种于2216E固体培养基中， 保存于4冰箱中。 筛选 用宿主菌经28过夜培养， 挑取单个菌落， 接种于2216E液体培养基中

14、， 28振荡培养8h后， 用来分离噬菌体用。 0026 （2） 水样的处理 0027 取来自于大连某刺参养殖场及大连市某水产市场排污口废水样品各200mL， 对水 样做预处理： 加入CaCl2、 MgCl2， 使其终浓度为1mmol/L， 作用大约10min。（二） 水样噬菌体的 说明书 2/4 页 4 CN 103898015 B 4 富集 0028 将上述经过预处理的水样， 10000g离心5min， 收集上清； 将上清过0.22 m滤膜， 除 菌体、 杂质等其他成分， 即得噬菌体原液； 取10mL滤液加入处于对数生长期 （接种后5h左右， 噬菌体终浓度达到106-107CFU/mL时，

15、即对数生长期） 的50mL菌液中， 28过夜培养12-18h， 目的是使噬菌体数量扩增， 观察并记录； 收集菌液， 10000g离心5min， 收集上清， 再过滤膜 （0.22 m） ， 即得增殖后的噬菌体上清液。 0029 （三） 噬菌体的筛选 0030 采用双层平板法进行噬菌体的鉴定， 下层为1.5%琼脂的2216E固体培养基， 置于4 备用， 用前放于28， 约30min； 上层为0.5%琼脂2216E培养基， 将上层培养基加热溶解， 放 置于50的水浴锅中待用， 取8支10mL离心管， 分别加1mL宿主菌液， 吸取噬菌体悬浮液进行 梯度稀释至10-6， 将7种不同浓度梯度的噬菌体稀释液

16、分别取出10 L， 加到10mL离心管中， 设置一个对照组， 仅加入1mL宿主菌液和10 L2216E培养基， 在28下作用10min， 加入5mL含 0.5%琼脂的2216E培养基充分混匀后， 立刻加到上层， 待凝固后， 倒置培养24h后观察有无噬 菌斑形成。 如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。 0031 （四） 噬菌体的纯化 0032 初次分离的噬菌斑的大小、 形状不一致， 对分离的噬菌体进一步的纯化， 使噬菌体 在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑。 用无菌200 L枪头挑取形态大小有明显差异的噬 菌斑各一个， 将其分别加入到1mL无菌PBS的离心管中，

17、涡旋震荡1min， 置于4,4h， 使噬菌 体充分释放入PBS中； 4、 10000g离心5min， 收集上清， 过膜 （0.22 m） ， 将噬菌体虑液进行梯 度稀释， 双层培养， 重复3次上述操作， 直至出现的噬菌斑形态、 大小完全一致为止， 即得到 纯化噬菌体。 噬菌体电镜照片见附图1。 0033 （五） 噬菌体的富集与扩增 0034 采用液体增殖法进行增殖。 具体的方法如下： 将噬菌体液按一定比例加入到培养 12h的宿主菌液中， 再于28摇床中培养12h， 将混合液于4、 10000g离心5min， 去处细菌碎 片， 上清液用0.22 m的滤膜过滤， 即可获得高效价的噬菌体富集液。 0

18、035 实施例2 0036 噬菌体的体外抑菌效果 0037 （一） 噬菌体的体外抑菌实验 0038 实验设置为4个组， 取4个50mL离心管， 分别标记为A、 B、 C、 D； 其中A为阴性对照组， B、 C为阳性对照组， D为实验组。 A中加入30mL2216E液体培养基、 1mL菌液 （浓度为108CFU/ ml） 、 1mLPBS； B中加入30mL2216E液体培养基、 1mL菌液、 1mL硫酸卡那霉素 （Sulfate Kanamycin） 浓度为10mg/L； C中加入30mL2216E液体培养基、 1mL菌液、 1mL强力霉素 （Doxycycline） 浓度为5mg/L； D中

19、同样加入30mL2216E液体培养基、 1mL菌液、 加入1mLPVA1 噬菌体富集液， 效价为109PFU/mL； 振荡10min后， 放入酶标仪中测OD600nm的值， 记录； 放入 28摇床中培养， 每半小时取样测一次OD600nm的值， 记录12h内变化。 0039 结果显示， 噬菌体实验组可在12h内抑制宿主菌的生长， 且无相应抗性菌株产生， 结果见附图2。 0040 （二） 一步生长曲线 0041 利用一步生长实验检测裂解性噬菌体感染宿主菌的潜伏期和最终释放噬菌体的 说明书 3/4 页 5 CN 103898015 B 5 颗粒数。 0042 （1） 在100mL的2216E液体培

20、养基中加入200 L宿主菌过夜培养， 使菌体浓度约1 109CFU/mL； 0043 （2） 取20mL2216E新鲜培养基中加入2mL过夜菌液和噬菌体保存液， 调整感染复数 为0.1， 28静置15min使噬菌体充分吸附在宿主菌上后取1mL上述液体； 0044 （3） 4， 10000g离心10min； 0045 （4） 去除上清， 用1mL2216E液体培养基悬浮菌体沉淀； 0046 （5） 重复步骤3和4两到三次， 将未吸附的噬菌体洗脱至上清中； 0047 （6） 将上述吸附液加入19mL新鲜2216E培养基中， 充分混匀， 28、 120rpm培养； 0048 （8） 每隔5min吸取

21、100 L培养液检测噬菌体效价。 0049 结果显示， 噬菌体PVA1潜伏期为28min， 裂解量为79个， 结果见附图3。 0050 实施例3 0051 噬菌体的环境耐受性 0052 获取噬菌体PVA1的高效价富集液 （效价为4.21010PFU/ml） 。 将100mL养殖海水、 1 头9g健康海参及噬菌体液放入500mL烧杯中， 起始效价为1.5107PFU/ml， 养殖室温放置， 每24h使用双层平板法测效价一次， 记录14天内噬菌体降解情况。 0053 结果显示： 在养殖海水、 养殖室温的条件下， 噬菌体液在14天内下降了两个数量 级， 噬菌体环境耐受性较好， 为噬菌体的环境水体应用

22、提供了可能性， 结果见附图4。 0054 实施例4 0055 小鼠安全性实验 0056 实验动物为清洁级昆明小鼠， 体重184g， 2月龄 （合格证号： 00001317） ， 由大连医 科大学实验动物中心提供。 实验动物饲养于清洁级动物房， 室温18， 相对湿度40%-80%， 12h日照和昏暗循环。 实验小鼠共10只， 雄性， 适应性饲养3日后， 随机成两组 （对照组、 噬菌 体组） ， 每组5只， 噬菌体实验组腹腔注射给予1010PFU/kg噬菌体纯化液， 对照组灌胃给予等 量生理盐水， 连续给药15天后， 将小鼠脱颈处死， 解剖内脏观察病变情况。 0057 结果显示， 在1010PFU

23、/kg剂量下， 噬菌体纯化液对实验小鼠日常行为无显著影响， 解剖观察肺部、 肝脏、 肾脏、 腹腔均未发现病变症状。 0058 实施例5 0059 不同剂量噬菌体PVA1纯化液对溶藻弧菌的预防效果 0060 实验海参由大连湾某海产品养殖场提供， 个重58g， 实验前海参适应性养殖7天， 禁食1天， 水温18， 通氧避光。 实验分组：（1） 阳性对照组一 （5mg/L强力霉素） ；（2） 阳性对照 组二 （10mg/L硫酸卡那霉素） ；（3） 高剂量噬菌体组 （终浓度107PFU/mL） ；（4） 中剂量噬菌体组 （终浓度106PFU/mL） ；（5） 低剂量噬菌体组 （终浓度105PFU/mL）

24、 ；（6） 空白组 （等量灭菌海水） 。 共六组， 每组10只健康海参同时设三平行实验。 实验方法： 按上述条件建立各实验组， 1h后 使用5.7106CFU/mL溶藻弧菌每24h浸浴攻毒一次， 记录各组海参死亡情况。 0061 实验结果显示， 5天后空白组海参全部死亡， 同时强力霉素组的存活率为80%， 硫酸 卡那霉素组的存活率为47%， 高中低剂量的噬菌体组存活率分别为73%、 50%、 50%， 见附图5。 由此可见， 噬菌体PVA1对溶藻弧菌具有一定的预防效果， 可以作为一种生物抗菌剂应用于 海参养殖中溶藻弧菌的预防。 说明书 4/4 页 6 CN 103898015 B 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 103898015 B 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 103898015 B 8 图5 说明书附图 3/3 页 9 CN 103898015 B 9