利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103865956 A (43)申请公布日 2014.06.18 CN 103865956 A (21)申请号 201310229277.7 (22)申请日 2013.06.09 C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 5/0793(2010.01) (71)申请人 南通大学 地址 226019 江苏省南通市崇川区市啬园路 9 号 (72)发明人 谭雪锋 (54) 发明名称 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能 神经元分化的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种生物工程技术， 具体地说是 一种利用基因重组病毒诱导神经干

2、细胞向多巴 胺能神经元分化的方法 ： 重组慢病毒载体构建 ； 神经干细胞的分离、 培养及鉴定 ； 重组病毒转染 NSCs ； 重组慢病毒转染 NSCs 的鉴定 ； 重组病毒转 染NSCs ： 取传代3次后的NSCs消化制备成单细胞 悬液， 接种至培养板中 ； 转染 TH+Brn4 基因重组慢 病毒 ； 加入慢病毒和 ploybrene， 摇晃混匀后将培 养板置培养箱中培养， 12 小时后更换新鲜分化培 养基 ； 同时用嘌呤霉素进行筛选， 以获得稳定转 染的细胞 ； 本发明的优点在于 ： 通过构建目的基 因 TH 和 Brn4 的慢病毒载体， 转染 NSCs 后外源性 基因能在细胞内稳定表达 ；

3、 分化后产生高比例的 TH 阳性多巴胺能神经元 ； Brn4 能促进神经营养因 子的高表达， 且具有抑制细胞凋亡的功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 13 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书13页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103865956 A CN 103865956 A 1/3 页 2 1. 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法， 所述的方法包括如 下实施步骤 ： 一、 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒载体构建 ： 根据pLV5-EFla-

4、GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全 长序列分别为 NM_012740 和 NM_017252 的基因， 构建 pLV5-TH、 pLV5-Brn4 和 pLV5-TH+Brn4 慢病毒表达载体， 包装滴度后进行测序鉴定和滴度鉴定 ； 二、 神经干细胞的分离、 培养及鉴定 ： 神经干细胞的培养方法 ： 在无菌条件下取孕 14d 的 SD 胎鼠腹侧中脑组织， 用吸管反复 吹打直至为细胞悬液， 并经 200 目尼龙网过滤， 收集过滤后的细胞悬液， 用基础培养基清洗 3遍后重悬于NSCs培养液中， 经细胞计数和活力观察后， 按1105/ml细胞密度接种于含有

5、10ml NSCs 培养液的细胞培养瓶中， 置于 5、 37的 CO2 培养箱中培养， 3 天后可见培养瓶 内形成悬浮的 NSCs 球， 7 天后进行传代培养 ； 神经干细胞的分离方法 ： 神经干细胞在培养瓶中培养3天后， 用低速离心收集NSCs球， 清洗 3 遍后用 Accutase 酶进行消化， 约 10min 钟后用含 10 FBS 的基础培养液终止消化， 通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液， 进行细胞计数后培养瓶中继续培养 ； 神经干细胞的鉴定方法 ： 取 P3 代 NSCs 在传代时培养液中加入终浓度为 5mol/L 的 BrdU 进行标记， 使 BrdU 整合到神经干细胞 DN

6、A 中， 7 天后进行 BrdU 免疫荧光检测 ； 另取 P3 代以后的 NSCs 亚克隆球用 Nestin 免疫荧光检测证明其胚胎源性 ； 将 P10 代 NSCs 球接种于 预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的 24 孔培养板中， 加入含 10 FBS 的 DMEM/F12 分化培养 液进行分化， 2 周后分别进行 MAP-2、 GFAP 和 CNP 免疫荧光检测以证明 NSCs 的多分化潜能 ； 四、 重组慢病毒转染 NSCs 的鉴定， 包括 ： 转染效率检测是将转染后的 NSCs 球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的 24 孔板中， 加 入含 2 FBS 的 DMEM/F12 分化培养液， 分化

7、培养 1 周后终止培养， 吸去培养液， 加入 4多 聚甲醛固定 30min， PBS 清洗后用 Hochest33342 染色， 在荧光显微镜下观察结果 ； TUNEL 法细胞凋亡检测是将各组 NSCs 分化培养 2W 后， 吸去各孔中的培养液， 用 0.01M PBS 清洗 3 遍， 然后用含 4多聚甲醛的 0.1PBS 室温下固定 20min， 吸去多聚甲醛， PBS 清洗 3遍， 用TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测， 最后PBS洗片3遍后， 在避光 条件下， 加入 Hoechst33342， 室温湿盒孵育 30min， PBS 洗片 3 遍后， 中性甘油封片 ； 在正置

8、 荧光显微镜下观察 TUNEL、 Hoechst 阳性细胞核并摄片 ； 用统计方法对各组数据进行方差分 析和组间比较 ； 高效液相色谱法检测分化培养液中 DA 含量是将各组取 NSCs 分化培养液 1ml， 加入 0.1mol/L 过氯酸酸化培养液， 14000rpm 离心 15min， 取上清过滤后按吴燕琼等报道的方法 行高效液相色谱测定 ； 其特征在于 ： 该方法实施步骤还包括 ： 三、 重组病毒转染 NSCs ： 所述的重组病毒的转染方法 ： 取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液， 细胞计数后接种至 24 孔培养板中， 每孔接种 4104个细胞， 加入 500l 基础培养液悬浮细胞 ；

9、细胞共分 4 组 进行转染， 每组 6 孔 ： Mock 组转染 pLV5-GFP 慢病毒阴性对照 ； TH 组转染 pLV5-TH 重组慢病 毒 ； Brn4 组转染 pLV5-Brn4 重组慢病毒 ； TH+Brn4 组转染 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒 ； 每孔 权 利 要 求 书 CN 103865956 A 2 2/3 页 3 加入 20l1108TU/ml 的慢病毒和 5g/ml ploybrene， 轻轻摇晃混匀后将培养板置培养 箱中培养， 12 小时后更换新鲜分化培养基 ； 感染 72 小时后， 在倒置荧光显微镜下观察荧光 表达情况， 同时在培养基中加入 1g/ml 嘌

10、呤霉素进行筛选， 以获得稳定转染的细胞 ； 7 天 后对各组形成的 NSCs 球进行传代培养。 2. 利用权利要求 1 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法获得一种转染 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒的神经干细胞， 其特征在于 ： 是将权利要求 1 中所述的实施步骤三中获得的稳定转染 pLV5-TH+Brn4 病毒的 NSCs 制成单细胞悬液， 用 基础培养液将细胞配成 2106/ml， 加入 1.5ml 细胞冻存管中， 同时加入 0.4ml 小牛血清和 0.1ml 二甲基亚枫， 混匀后密封， 置 4 1 小时， -20 2 小时， 然后直接放入 -80超低温冰

11、 箱中保存获得。 3. 根据权利要求 1 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法， 其特征在于 ： 所述的重组慢病毒转染NSCs的鉴定还包括 ： Western Blot检测、 免疫荧 光细胞化学检测。 所述的 Western Blot 检测是将各组转染后的 NSCs 球接种至 24 孔板中进行分化， 另设 一组未转染的 NSCs 作为对照组， 分化培养 2 周后终止培养， 按 RIPA 裂解液说明书的要求， 提取各组中细胞的蛋白， 用 10 SDS-PAGE 垂直电泳对蛋白进行分离， Bio-Rad 半干转印系 统转膜 15V， 50min， 5脱脂奶粉封闭后分别加入

12、下列一抗 ： 小鼠抗 -actin 抗体、 小鼠抗 TH 抗体、 兔抗 Brn4 抗体、 兔抗 GDNF 抗体、 兔抗 GFR-1 抗体、 兔抗 RET 抗体， 室温孵育 2h， 4过夜， 次日分别加入辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠 IgG 和羊抗兔 IgG 二抗， 室温孵育 4h， 然后进行曝光、 显影并用所采集图像， 用图像分析软件对Western blot结果进行平均光 密度分析， 并用统计的方法对各组数据进行方差分析和组间比较 ； 所述的免疫荧光细胞化学检测是各组 NSCs 分化 2 周后终止培养， 对阴性对照组和各 重组病毒转染组中细胞进行免疫荧光检测， 简述如下 ： 所用一抗分别为

13、： 小鼠抗 TH、 大鼠抗 DAT ； 二抗为 ： 结合有 Alexa Fluor568 的山羊抗鼠 IgG ； 一抗于 4孵育过夜， 二抗室温下孵 育 2h， 随后用 Hoechst33342 进行细胞核染色 30min， 中间各步骤之间均用 0.01M PBS 进行 常规洗片， 最后用 20甘油缓冲液封片， 并在 FVlOi 智能型激光共聚焦显微镜下观察 TH 或 DAT的表达情况， 并计算GFP/TH和GFP/DAT双标细胞占Hoechst标记细胞的百分比， 并用统 计方法对各组数据进行方差分析和组间比较。 4. 根据权利要求 1 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的

14、 方法， 其特征在于 ： 所述的高效液相色谱法检测分化培养液中 DA 含量的色谱条件 ： 色谱柱 为 4.6250mm， 颗粒度 5m 的 Inertsil ODS-SP 型十八烷基硅烷腱合硅胶柱， 柱温 40， 流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液， 流速为 1.0ml/min， 检测器为 SPD-20A 型紫外检测 器， 检测波长 280nm ； 定性分析 ： 以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性 ； 定量分 析 ： 先利用 DA 标准品绘制标准曲线， 然后在相同条件下依次进行样品测定， 用外标法定量， 以峰面积表示含量。 5. 根据权利要求 4 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多

15、巴胺能神经元分化的 方法， 其特征在于 ： 所述的流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液， 其比例为 97 3。 6. 根据权利要求 1 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法， 其特征在于 ： 所述的 NSCs 培养液由 DMEM/F12、 2 B27、 20ng/mlEGF、 20ng/ml bFGF 组 权 利 要 求 书 CN 103865956 A 3 3/3 页 4 成。 7. 根据权利要求 1 所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法， 其特征在于 ： 所述的慢病毒的感染复数为 50。 权 利 要 求 书 CN 103865956 A 4

16、 1/13 页 5 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。 背景技术 0002 帕金森病 (Parkinson s Disease， PD) 是一种常见的中枢神经系统退行性疾病， 其基本病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死， 数量减 少， 致使纹状体内多巴胺神经递质释放减少， 从而产生震颤、 肌肉强直等一系列运动障碍症 状。 0003 传统的药物治疗和外科治疗仅限于改善症状， 但并不能阻止病情发展， 不能从根 本上解决问题。由于此病变主要侵犯中脑黑质多巴胺能

17、神经元， 且黑质多巴胺能神经元投 射的靶区纹状体定位明确， 所以在黑质 - 纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的细胞， 恢复 多巴胺的神经环路是一个针对病因治疗的理想方法。 0004 近三十年来， PD 的脑内移植研究取得了较大的进展， 有许多 PD 患者接受了流产胎 儿中脑组织的移植， 移植组织中的多巴胺神经元能够长期存活， 并不断释放多巴胺， 使病人 的运动症状得以明显改善。 这表明细胞移植替代治疗是治疗PD较有希望的方法。 但因胚脑 移植物来源有限、 异体免疫排斥及伦理等问题， 胚脑组织移植在实际应用中受到很大限制。 0005 神经干细胞(Neural stem cells， NSCs)是当

18、前国际上研究的热点之一， 它不仅存 在于胚胎脑组织中， 在成年脑内也已被发现。 NSCs不仅具有分裂增殖和自我更新的能力， 还 具有多分化潜能， 可以分化为神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经系统多种类型 的细胞， 包括多巴胺能神经元。因此， NSCs 作为细胞移植替代治疗的供体细胞治疗 PD 等神 经系统退行性疾病具有巨大的潜力和优越性。然而， 研究表明体外培养的 NSCs 一般情况下 大多分化为胶质细胞， 很少分化为神经元， 特别是特异性的多巴胺能神经元， 这给临床应用 NSCs 移植治疗 PD 造成了极大的障碍。同时， 目前的研究表明单独 NSCs 移植后细胞存活率 只有 5 -1

19、0， 且不能有效地迁移分化并整合到宿主的神经环路中， 从而不能很好的释放 神经递质发挥生理功能。 0006 所以探讨诱导 NSCs 分化为多巴胺神经元的方法以及促进移植的细胞在体内存 活， 较长时间地分泌多巴胺是 NSCs 移植治疗 PD 研究中迫切需要解决的问题。 0007 酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase， TH)是细胞内酪氨酸合成多巴胺过程中的 限速酶， 通常作为多巴胺能神经元的特异性标志， 其表达情况是 NSCs 能否转化为多巴胺能 神经元的关键。 研究发现， 脑内TH含量与中脑多巴胺含量呈线性正相关， PD患者脑内TH及 TH mRNA 的水平明显低于正常人，

20、提示补充脑内 TH 基因可促进多巴胺的生物合成。将人或 鼠 TH 基因作为目的基因转入多种细胞的体内和体外实验证明， 经 TH 遗传改造的细胞具有 分泌多巴胺的能力。因此， 设法提高 NSCs 的 TH 活性， 促进多巴胺的生成和释放是 NSCs 移 植联合转基因治疗 PD 的新方法。 0008 Brn-4 是转录因子 POU 蛋白家族第三类成员之一。许多资料表明， 多种同源盒基 说 明 书 CN 103865956 A 5 2/13 页 6 因， 如 HOX、 POU、 LIM、 PAX 等， 编码的转录因子在胚胎发育过程中对神经细胞的分化、 迁移和 某些组织特异性基因的表达起着重要的调控作

21、用。其中， POU 同源盒基因在中枢神经系统 发育过程中扮演着重要角色。根据 POU 区的全部氨基酸序列同源程度， 哺乳动物 POU 蛋白 分为 Class I ClassVI 共六类， Brn-4 和 Brn-1、 Brn-2、 Tst-1 同属于第 III 类， 在胚胎早 期 Brn-1、 Brn-2、 Brn-4 即在神经系统中出现， 且分布广泛， 提示这些因子可能参与早期神 经发生。近期在 Nature 上的一篇报道中， 将三个转录因子 Ascl1、 Brn-2、 Mytl1 导入来自 成年大鼠尾部的皮肤细胞， 一周后， 约有 20的实验鼠皮肤细胞转化为神经细胞， 这些神经 细胞不但可

22、以表达神经蛋白， 而且可与其他神经细胞形成突触联系， 表明 POU 蛋白家族成 员 Brn-2 在神经发育中的关键作用。可见， POU 蛋白家族的第 III 类因子对 NSCs 分化命运 可能起着决定性的作用。Le Moine 等的研究还发现， 阻断成年哺乳动物黑质向纹状体的多 巴胺能神经投射， 会引起纹状体内 Brn-4 表达上调。表明 Brn-4 可能和成年哺乳动物去多 巴胺能神经支配后纹状体内的神经再生与修复有关。 0009 前期研究中， 通过切割大鼠穹窿海马伞阻断自隔区向海马投射的胆碱能神经纤维 建立去神经支配海马模型， 将NSCs移植到海马内， 植入的NSCs在去神经支配的海马内更容

23、 易存活， 并且更多地分化为神经元， 同时， 存在于齿状回的内源性 NSCs 在去神经支配损伤 刺激下也出现明显增生、 迁移和神经元分化。上述结果表明， 去神经支配损伤后， 海马内局 部微环境的改变为 NSCs 的存活、 再生和向神经元分化提供了良好的条件。我们进一步利用 原位杂交、 RT-PCR、 免疫组织化学和 Western blot 等多种方法检测发现， Brn-4 的转录和表 达水平在去神经支配的海马内均明显上调。在获得的去神经支配海马提取液中加入过量 的 Brn-4 抗体中和其中的 Brn-4， 再与 NSCs 共培养， 结果发现， 抗体中和后， 去神经支配海 马提取液促进神经元分

24、化的效应显著减弱。利用 RNA 干扰技术将针对 Brn-4 的小 RNA 片段 转入 NSCs 中， 下调细胞内 Brn-4 的水平， 结果 NSCs 分化为神经元的比例明显下降。相反， 过表达 Brn-4 的 NSCs 分化为神经元的比例明显升高， 而且新生神经元的成熟度明显增加。 这些结果说明 Brn-4 在 NSCs 向神经元分化成熟过程中起着十分重要的作用。进一步研究 还发现， 转染 Brn-4 基因的 NSCs 在体外分化 7 天后， Western blot 检测发现凋亡相关蛋白 Caspase-3 的表达明显低于对照组， 提示 Brn-4 可能具有抑制细胞凋亡的作用。Shimaz

25、aki 等的研究发现， 在体外用脑源性神经生长因子 (Brain-derived neurotrophic factor， BDNF) 和胰岛素样生长因子 -1 (Insulinlike growth factor-1， IGF-1) 刺激来源于小鼠 胚胎纹状体的 NSCs 分化过程中， Brn-4 表达迅速上调， 且 Brn-4 蛋白主要表达于新生的神 经元内 ； 应用反义寡核苷酸技术阻断 Brn-4 的功能， NSCs 分化为成熟神经元的比例则下降。 说明 Brn-4 可能通过一些神经营养因子的介导来调控 NSCs 向神经元的分化及其成熟。然 而， Brn-4 促进 NSCs 向成熟神经元

26、分化并且维持移植细胞存活的分子机制在国内、 外没有 研究。如果能通过 TH 和 Brn-4 基因有效地诱导 NSCs 向成熟的多巴胺能神经元分化， 并且 通过Brn-4维持移植后细胞的存活， 使之长时间地分泌多巴胺， 纠正PD的病理和生化异常， 改善临床症状， 这将为多基因联合 NSCs 移植治疗 PD 提供新的方法和实验依据。 发明内容 0010 本发明的目的是克服现有技术中的不足之处， 提供一种利用重组慢病毒诱导神经 干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。 说 明 书 CN 103865956 A 6 3/13 页 7 0011 为了实现本发明的目的， 我们将采用如下技术方案予以实施 ： 00

27、12 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法， 所述的方法包括 如下实施步骤 ： 0013 一、 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒载体构建 ： 0014 根据 pLV5-EFla-GFP 慢病毒表达载体的要求和 GenBank 大鼠 TH 和 Brn4 的 cDNA 功能全长序列分别为 NM_012740 和 NM_017252 的基因， 合成目的基因并构建 pLV5-TH、 pLV5-Brn4 和 pLV5-TH+Brn4 慢病毒表达载体， 包装滴度后进行测序鉴定和滴度鉴定 ； 0015 二、 神经干细胞的分离、 培养及鉴定 ： 0016 神经干细胞的培养方法 ： 在无菌

28、条件下取孕 14d 的 SD 胎鼠腹侧中脑组织， 用吸管 反复吹打直至为细胞悬液， 并经 200 目尼龙网过滤， 收集过滤后的细胞悬液， 用基础培养基 清洗 3 遍后重悬于 NSCs 培养液中， 经细胞计数和活力观察后， 按 1105/ml 细胞密度接种 于含有 10ml NSCs 培养液的细胞培养瓶中， 置于 5、 37的 C02 培养箱中培养， 3 天后可见 培养瓶内形成悬浮的 NSCs 球， 7 天后进行传代培养 ； 0017 神经干细胞的分离方法 ： 神经干细胞在培养瓶中培养 3 天后， 用低速离心收集 NSCs 球， 清洗 3 遍后用 Accutase 酶进行消化， 约 10min

29、钟后用含 10 FBS 的基础培养液 终止消化， 通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液， 进行细胞计数后培养瓶中继续培 养 ； 0018 神经干细胞的鉴定方法 ： 取 P3 代 NSCs 在传代时培养液中加入终浓度为 5mol/L 的 BrdU 进行标记， 使 BrdU 整合到神经干细胞 DNA 中， 7 天后进行 BrdU 免疫荧光检测 ； 另取 P3 代以后的 NSCs 亚克隆球用 Nestin 免疫荧光检测证明其胚胎源性 ； 将 P10 代 NSCs 球接 种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的 24 孔培养板中， 加入含 10 FBS 的 DMEM/F12 分化 培养液进行分化， 2 周

30、后分别进行 MAP-2、 GFAP 和 CNP 免疫荧光检测以证明 NSCs 的多分化 潜能 ； 0019 重组慢病毒转染 NSCs 的鉴定， 包括 ： 0020 转染效率检测是将转染后的 NSCs 球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的 24 孔板 中， 加入含 2 FBS 的 DMEM/F12 分化培养液， 分化培养 1 周后终止培养， 吸去培养液， 加入 4多聚甲醛固定 30min， PBS 清洗后用 Hochest33342 染色， 在荧光显微镜下观察结果 ； 0021 TUNEL 法细胞凋亡检测是将各组 NSCs 分化培养 2W 后， 吸去各孔中的培养液， 用 0.01MPBS清洗3遍，

31、然后用含4多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min， 吸去多聚甲醛， PBS 清洗 3 遍， 用 Roche 公司 TUNEL 凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测， 最后 PBS 洗 片 3 遍后， 在避光条件下， 加入 Hoechst33342， 室温湿盒孵育 30min。PBS 洗片 3 遍后， 中性 甘油封片 ； 在正置荧光显微镜下观察 TUNEL、 Hoechst 阳性细胞核并摄片 ； 用 Stata10.0 统 计软件对各组数据进行方差分析和组间比较 ； 0022 高效液相色谱法检测分化培养液中 DA 含量是将各组取 NSCs 分化培养液 1ml， 加 入 0.1mol/L

32、过氯酸酸化培养液， 14000rpm 离心 15min， 取上清过滤后按吴燕琼等报道的方 法行高效液相色谱测定 ； 0023 其特征在于 ： 该方法实施步骤还包括 ： 0024 三、 重组病毒转染 NSCs ： 0025 所述的重组病毒的转染方法 ： 取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液， 细胞计数后接 说 明 书 CN 103865956 A 7 4/13 页 8 种至24孔培养板中， 每孔接种4104个细胞， 加入500l基础培养液悬浮细胞 ； 细胞共分 4 组进行转染， 每组 6 孔 ： Mock 组转染 pLV5-GFP 慢病毒阴性对照 ； TH 组转染 pLV5-TH 重组 慢病毒

33、； Brn4 组转染 pLV5-Brn4 重组慢病毒 ； TH+Brn4 组转染 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒 ； 每孔加入20l1108TU/ml感染复数为50的慢病毒和5g/ml ploybrene， 轻轻摇晃混匀 后将培养板置培养箱中培养， 12 小时后更换新鲜分化培养基 ； 感染 72 小时后， 在倒置荧光 显微镜下观察荧光表达情况， 同时在培养基中加入 1g/ml 嘌呤霉素进行筛选， 以获得稳 定转染的细胞 ； 7 天后对各组形成的 NSCs 球进行传代培养 ； 0026 四、 重组慢病毒转染 NSCs 的鉴定。 0027 利用所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经

34、元分化的方法获得 一种转染 pLV5-TH+Brn4 重组慢病毒的神经干细胞 ： 是将所述的方法中所述的实施步骤三 中获得的稳定转染 pLV5-TH+Brn4 病毒的 NSCs 制成单细胞悬液， 用基础培养液将细胞配成 2106/ml， 加入 1.5ml 细胞冻存管中， 同时加入 0.4ml 小牛血清和 0.1ml 二甲基亚枫， 混匀 后密封， 置 4 1 小时， -20 2 小时， 然后直接放入 -80超低温冰箱中保存获得。 0028 所述的重组慢病毒转染 NSCs 的鉴定还包括 ： Western Blot 检测、 免疫荧光细胞化 学检 测 ： 0029 所述的 Western Blot

35、检测是将各组转染后的 NSCs 球接种至 24 孔板中进行分化， 另设一组未转染的 NSCs 作为对照组， 分化培养 2 周后终止培养， 按 RIPA 裂解液说明书的要 求， 提取各组中细胞的蛋白， 用 10 SDS-PAGE 垂直电泳对蛋白进行分离， Bio-Rad 半干转 印系统转膜 15V， 50min， 5脱脂奶粉封闭后分别加入下列一抗 ： 小鼠抗 -actin 抗体、 小 鼠抗 TH 抗体、 兔抗 Brn4 抗体、 兔抗 GDNF 抗体、 兔抗 GFR-1 抗体、 兔抗 RET 抗体， 室温孵育 2h， 4过夜， 次日分别加入辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG二抗， 室

36、温孵 育 4h， 然后进行曝光、 显影并用所采集图像， 用图像分析软件对 Western blot 结果进行平 均光密度分析， 并用统计的方法对各组数据进行方差分析和组间比较 ； 0030 所述的免疫荧光细胞化学检测是各组NSCs分化2周后终止培养， 对阴性对照组和 各重组病毒转染组中细胞进行免疫荧光检测， 简述如下 ： 所用一抗分别为 ： 小鼠抗 TH、 大鼠 抗DAT ； 二抗为 ： 结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ； 一抗于4孵育过夜， 二抗室温下 孵育 2h， 随后用 Hoechst33342 进行细胞核染色 30min， 中间各步骤之间均用 0.01M PBS 进

37、 行常规洗片， 最后用 20甘油缓冲液封片， 并在 FVlOi 智能型激光共聚焦显微镜下观察 TH 或 DAT 的表达情况， 并计算 GFP/TH 和 GFP/DAT 双标细胞占 Hoechst 标记细胞的百分比， 并 用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较 ； 0031 所述的高效液相色谱法检测分化培养液中 DA 含量的色谱条件 ： 色谱柱为 4.6250mm， 颗粒度5m的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱， 柱温40， 流动 相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液， 流速为 1.0ml/min， 检测器为 SPD-20A 型紫外检测器， 检测波长 280nm ； 定性分析

38、 ： 以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性 ； 定量分析 ： 先利用 DA 标准品绘制标准曲线， 然后在相同条件下依次进行样品测定， 用外标法定量， 以 峰面积表示含量。 0032 所述的磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钾 6.742g， 磷酸氢二钾 0.0114g， 加水定溶至 1000ml， 用磷酸调节 pH 值至 4.2， 并用 0.12m 纤维素脂膜过滤获得的。 0033 所述的流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液， 其比例为 97 3。 说 明 书 CN 103865956 A 8 5/13 页 9 0034 所述的 NSCs 培养液由 DMEM/F12、 2 B27、 20ng/mlE

39、GF、 20ng/ml bFGF 组成。 0035 所述的慢病毒的感染复数为 50。 0036 有益效果 0037 一、 我们从鼠胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力， 并具 有分化为神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能， 是中枢神经系统的干细 胞 ； 0038 二、 成功构建带有目的基因 TH 和 Brn4 的慢病毒载体， 转染 NSCs 后外源性基因能 在 细胞内稳定表达， 得到大鼠 NSCs-TH+Brn4 细胞株 ； 0039 NSCs-TH+Brn4 在体外分化后能产生较高比例的 TH 阳性多巴胺能神经元， 且这 些神经元在形态、 表型和功能上均较为成熟。

40、Brn4 能促进神经营养因子 GDNF 及其受体 GFR-1 和 Ret 的高表达， 同时还具有抑制细胞凋亡的功能， 这些对于多巴胺神经元的分 化、 成熟以及维持其存活可能起到了重要的作用。 附图说明 0040 图 1 为慢病毒载体的构建及慢病毒包装试验结果图 ； 0041 图 2 为 NSCs 的培养、 分离及鉴定结果图 ； 0042 图 3 为重组病毒转染 NSCs 的效率检测结果图 ； 0043 图 4 为 Western blot 检测结果图 ； 0044 图 5 为免疫荧光检测结果图 ； 0045 图 6 为细胞凋亡检测结果图。 具体实施方式 0046 结合附图， 对本发明做进一步地

41、说明 ： 0047 第一部分体外实验 0048 转染重组慢病毒的神经干细胞的制备和该神经干细胞的鉴定 0049 实验材料 0050 1.1、 实验动物 0051 孕14d Sprague-Dawley(SD)大鼠， 清洁级， 由南通大学实验动物中心提供， 生产许 可证号 ： SCXK( 苏 )2002-0019。 0052 1.2 实验仪器 0053 (1)SPD-20A 型紫外检测器 ( 日本 Shimadzu 公司 ) ； 0054 (2)C02 培养箱 ( 法国 Jouan 公司 ) ； 0055 (3) 超净工作台 (SW-CJ-1F， 苏州安泰空气技术有限公司 ) ； 0056 (4

42、) 低温冷冻离心机 ( 德国 Beckman 公司 ) ； 0057 (5)Leica DMR 正置荧光显微镜 ( 德国 Leica 公司 ) ； 0058 (6)Leica DMIRB 倒置荧光显微镜 ( 德国 Leica 公司 ) ； 0059 (7) 超低温冰箱 ( 美国 Nuaire 公司 ) ； 0060 (8)SDS-PAGE 电泳槽及转膜装置 (Bio-Rad 公司 ) ； 0061 (9)LeicaQwin 图像分析系统 (Leica 公司 ) ； 说 明 书 CN 103865956 A 9 6/13 页 10 0062 (10)Molecular Imager ChemiD

43、oc XRS System 采集图像 (Bio-Rad 公司 ) ； 0063 (11)FVlOi 智能型激光共聚焦显微镜 (Olympus 公司 ) ； 0064 (12)TUNEL 凋亡检测试剂盒 (Roche 公司 ) ； 0065 (13) 细胞培养瓶 (BD 公司 ) ； 0066 (14)200 目尼龙网 (BD 公司 ) ； 0067 (15) 细胞冻存管 (BD 公司 ) ； 0068 (16) 纤维素脂膜 (BD 公司 ) ； 0069 (17)Inertsil ODS-SP 型十八烷基硅烷腱合硅胶柱 (Shimadzu 公司 ) ； 0070 (18)Quantity On

44、e 图像分析软件 (Bio-Rad 公司 )。 0071 1.3 实验试剂 0072 1.3.1 慢病毒构建试剂 0073 (1)pLV5-EFla-GFP 慢病毒 (Genepharma 公司 ) ； 0074 (2) 限制性核酸内切酶 BamHI(MBI) ； 0075 (3) 限制性核酸内切酶 NotI(MBI) ； 0076 (4)T4DNA Ligase(NEB 公司 ) ； 0077 (5)DNA 纯化试剂盒 (Axygen 公司 ) ； 0078 (6)DH5 感受态细胞 (TransGen Biotech 公司 ) ； 0079 (7) 氨苄抗生素溶液 (Invitrogen

45、公司 ) ； 0080 (8) 包装质粒 Packaging Mix(Genepharma 公司 ) ； 0081 (9)293FT 细胞 (Invitrogen 公司 ) ； 0082 (10)DMEM+10 FBS(Invitrogen 公司 ) ； 0083 (11)Lipofectamine2000(Invitrogen 公司 ) ； 0084 (12)Opti-MEM 培养液 (Invitrogen 公司 ) ； 0085 (13)0.05 Trypsin(Invitrogen 公司 )。 0086 1.3.2 细胞培养主要试剂 0087 (1)DMEM 培养基 (Dulbecco

46、s Modified EagleMedium， Cat.No.12100-038， Gibco 公司 ) ； 0088 (2)F12 培养基 (F12Nutrient Mixture， Cat.No.21700-026， Gibco 公司 ) ； 0089 (3) 无血清培养添加剂 B27(B27Supplement， Cat.No.17504-044， Gibco 公司 ) ； 0090 (4) 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum， FBS， Cat.No.16140-087， Gibco 公司 ) ； 0091 (5)表皮生长因子(Epidermal Growth Facto

47、r， EGF， Cat.No.E4127， Sigma公司) ； 0092 (6) 碱性成纤维细胞生长因子 (Fibroblast Growth Factor-Basic， bFGF， Cat. No.F0291， Sigma 公司 ) ； 0093 (7) 细胞消化液 Accutase(Sigma 公司 ) ； 0094 (8)BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine,sigma 公司 ) ； 0095 (9)RIPA 裂解液 ( 碧云天， P0013B) ； 0096 (10) 二甲基亚枫 (dimethyl sulfoxide， sigma 公司 )。 0097 (11)

48、嘌呤霉素 (puromycm， sigma 公司 )。 0098 1.3.3 主要抗体 说 明 书 CN 103865956 A 10 7/13 页 11 0099 (1) 小鼠抗 TH(1 200， Millipore 公司 ) ； 0100 (2) 大鼠抗 DAT(1 5000， Millipore 公司 ) ； 0101 (3) 结合有 Alexa Fluor568 的山羊抗鼠 IgG(1 500， Invitrogen 公司 ) ； 0102 (4) 小鼠抗 -actin 抗体 (1 2000， Sigma 公司 ) ； 0103 (5) 小鼠抗 TH 抗体 (1 200， Milli

49、pore 公司 ) ； 0104 (6) 兔抗 Bm4 抗体 (1 1000， Santa Cruz 公司 ) ； 0105 (7) 兔抗 GDNF 抗体 (1 200， Abcam 公司 ) ； 0106 (8) 兔抗 GFR-1 抗体 (1 500， Abcam 公司 ) ； 0107 (9) 兔抗 RET 抗体 (1 5000， Abcam 公司 ) ； 0108 (10) 辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠 IgG(1 1000， Pierce 公司 ) ； 0109 (11) 羊抗兔 IgG(1 1000， Pierce 公司 ) ； 0110 (12)Hoechst33342(1 2000， sigma 公司 )。 0111 1.4 实验方法 0112 一、 重组慢病毒载体构建 0113 (1) 目的基因获取 0114 1) 引物设计 0115 根据 Genepharma 公司 pLV5-EF1a-GFP 慢病毒表达载体的要求和 GenBank 大鼠 TH(NM_012740) 和 Bm4(NM_01